利用新o-磷酸絲氨酸巰解酶生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用新O-磷酸絲氨酸巰解酶來生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物的方法。根據(jù)本發(fā)明提供一種利用新O-磷酸絲氨酸巰解酶以O(shè)-磷酸絲氨酸為底物生產(chǎn)半胱氨酸的方法，從而具有可利用該方法用簡便的方法以高收率容易地生產(chǎn)環(huán)保的半胱氨酸的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】利用新O-磷酸絲氨酸巰解酶生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用新O-磷酸絲氨酸巰解酶(ο-phosphoserine sulfhydrylase)生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]半胱氨酸是所有生物體的硫代謝中重要的氨基酸，不僅用于頭發(fā)的角蛋白等生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸及其它含硫代謝產(chǎn)物的合成，而且用作輔酶A生物合成的前體物質(zhì)。此外，半胱氨酸的生物合成被認(rèn)為與絲氨酸、甘氨酸、蛋氨酸等其它氨基酸的生物合成有密切的關(guān)系。工業(yè)上，半胱氨酸及其衍生物用于制藥領(lǐng)域(支氣管疾病治療)、化妝品領(lǐng)域(洗發(fā)水及燙發(fā)液的成分)及食品領(lǐng)域(抗氧化劑、增味劑及和面助劑)。
[0003]目前為止主要以人的頭發(fā)或動物的羽毛等為原料用化學(xué)的酸-水解工序生產(chǎn)半胱氨酸。但是，從頭發(fā)提取的半胱氨酸的生成收率為7~8%，非常低，并且由于提取過程中使用的鹽酸和硫酸，產(chǎn)生過量的環(huán)境污染廢棄物。此外，由于將頭發(fā)用作原材料，會使消費(fèi)者產(chǎn)生厭惡感。由于這種問題，對環(huán)保的半胱氨酸生產(chǎn)工藝的開發(fā)要求提高，由此開發(fā)出了利用微生物來生產(chǎn)半胱氨酸的方法。
[0004]作為利用微生物來生產(chǎn)半胱氨酸的方法，已知有I)首先，對D，L-ATC利用微生物以生物學(xué)轉(zhuǎn)換的方法。但是，該方法由于前體D，L-ATC的溶解度低而在產(chǎn)業(yè)化上存在困難。2)另一方法已知有以利用大腸桿菌的直接發(fā)酵法生產(chǎn)半胱氨酸的方法。該方法在微生物內(nèi)過量堆積半胱氨酸的情況下會顯示細(xì)胞內(nèi)毒性，因此利用微生物來生產(chǎn)高濃度的半胱氨酸時(shí)存在限制。
[0005]仔細(xì)研究微生物及植物的半胱氨酸生物合成路徑之一，O-乙酰絲氨酸(0-acety 1-serine, 0AS)作為半胱氨酸的碳骨架的中間前體起作用。OAS是作為載硫劑利用硫化氫(Hydrogen sulfide)通過O-乙酰絲氨酸巰解酶(O-acetyl-serinesulfhydrylase, 0ASS)被轉(zhuǎn)換成半胱氨酸。從而可利用OASS從累積OAS的微生物和多種載硫劑生產(chǎn)半胱氨酸(美國授權(quán)專利US6，579，705)。
[0006]本發(fā)明發(fā)明人在尋找與此不同的新的半胱氨酸生產(chǎn)方法的過程中發(fā)現(xiàn)特定微生物中存在利用O-磷酸絲氨酸(ο-phospho-serine, OPS)來合成半胱氨酸的酶(0-phosphoserine sulfhydrylase, 0PSS)。OPS 是絲氨酸(L-serine)的中間前體，因此與OAS相比代謝路徑短，在利用OPS的情況下相比利用OAS的情況會對前體生產(chǎn)有利。尤其是，源自陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的OPSS與源自結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的OPSS不同，不需要如mec+及cysO那樣的傳遞硫的輔酶,與敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix)的OPSS不同，在37°C下顯示最佳活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

(一)要解決的技術(shù)問題[0007]本發(fā)明人為了開發(fā)以高收率生產(chǎn)半胱氨酸的方法努力研究的結(jié)果，從多種微生物中識別具有以O(shè)PS為底物合成半胱氨酸的具有活性的新0PSS，并且確認(rèn)所述新OPSS與以往已知的陰道毛滴蟲的OPSS相比半胱氨酸合成活性增加，從而完成了本發(fā)明。
(二)技術(shù)方案
[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種半胱氨酸或其衍生物的生產(chǎn)方法，包括:在新O-磷酸絲氨酸巰解酶或表達(dá)其的微生物的存在下，使O-磷酸絲氨酸與硫化物反應(yīng)，從而制備半胱氨酸或其衍生物的步驟。
(三)有益效果
[0009]根據(jù)本發(fā)明提供一種利用新O-磷酸絲氨酸巰解酶以O(shè)-磷酸絲氨酸為底物生產(chǎn)半胱氨酸的方法，從而具有可利用該方法用簡便的方法以高收率容易地生產(chǎn)環(huán)保的半胱氨酸的優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1表示利用三種OPSS在10分鐘、30分鐘及60分鐘測定半胱氨酸的轉(zhuǎn)換率的結(jié)
果O
[0011]圖2表示為了確認(rèn)Dal-OPSS的pH敏感性而測定不同pH下的半胱氨酸轉(zhuǎn)換率的
結(jié)果。
[0012]圖3表示以O(shè)PS的發(fā)酵液和硫化物為底物利用三種OPSS在10分鐘、30分鐘及60
分鐘測定半胱氨酸的轉(zhuǎn)換率的結(jié)果。
[0013]圖4表示Dal-OPSS的不同溫度下半胱氨酸轉(zhuǎn)換率的測量結(jié)果。
最佳實(shí)施方式
[0014]作為一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種半胱氨酸或其衍生物的生產(chǎn)方法，包括:在具有SEQ IDNo:1或2所示的氨基酸序列的O-磷酸絲氨酸巰解酶或表達(dá)其的微生物存在的情況下，使O-磷酸絲氨酸與硫化物反應(yīng)，從而制備半胱氨酸或其衍生物的步驟。
[0015]本發(fā)明中術(shù)語“O-憐酸絲氨酸疏解酶(0-phosphoserine sulfhydrylase,以下簡稱0PSS) ”是指具有對O-磷酸絲氨酸(ο-phosphoserine,以下簡稱OPS)提供硫醇基(th1lgroup, SH基)來使OPS轉(zhuǎn)換成半胱氨酸的活性的酶。
[0016]在本發(fā)明中所述OPSS可以是SEQ ID No:1或2所示的氨基酸序列，其是由本發(fā)明發(fā)明人新識別的0PSS。所述SEQ ID No:1或2所示的氨基酸序列具有OPSS的活性，并且只要維持其活性，則可進(jìn)行一定程度的變形。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，通過這種人為的變形而維持70%以上，優(yōu)選為80%以上，更優(yōu)選為90%以上，最優(yōu)選為95%以上的同源性的氨基酸序列只要保留本發(fā)明所要的活性則與本發(fā)明的所述氨基酸序列等同。
[0017]本發(fā)明的具體的一個(gè)實(shí)施例中，通過對利用具有SEQ ID No:1的氨基酸序列的Dac-OPSS及具有SEQ ID No:2的氨基酸序列的Dal-OPSS將純化的OPS及OPS發(fā)酵液為底物的半胱氨酸合成活性進(jìn)行評價(jià)的結(jié)果，確認(rèn)了與對照組Tva-OPSS相比顯示出高的半胱氨酸轉(zhuǎn)換率，從而確認(rèn)了具有所述SEQ ID No:1或2的氨基酸序列的OPSS能夠以高收率生產(chǎn)半胱氨酸(圖1、圖3、表3及表4)。
[0018]本發(fā)明中術(shù)語“同源性”是指兩個(gè)多肽部分(polypeptide moiety)之間的序列相似性的百分比?？赏ㄟ^已知的技術(shù)決定從一個(gè)部分到另一個(gè)部分的序列相似性。例如，可對序列信息進(jìn)行排列并利用可容易獲得的計(jì)算機(jī)程序來直接排列兩個(gè)多肽分子間的序列信息并決定同源性。此外，可通過在同源區(qū)域間構(gòu)成穩(wěn)定的雙鏈的條件下對多核苷酸進(jìn)行雜交后，用單鏈特異性核酸酶使其分解，并且確定被分解的片段大小來決定同源性。
[0019]本發(fā)明中術(shù)語“序列相似性”是指可共有或不共有共同進(jìn)化起源的蛋白質(zhì)的堿基序列或氨基酸序列之間的同一性或相似性程度。在一個(gè)具體例中，兩個(gè)氨基酸序列的對于氨基酸序列的規(guī)定長度的多肽匹配至少為21% (優(yōu)選為至少約50%，最優(yōu)選為約75%、90%、95%、96%、97%或99%)時(shí)，“實(shí)質(zhì)上同源”或“實(shí)質(zhì)上相似”。實(shí)質(zhì)上同源的序列可使用在數(shù)據(jù)銀行中使用的標(biāo)準(zhǔn)軟件，或例如可通過為特定的系統(tǒng)定義的嚴(yán)格條件下使用過的雜交實(shí)驗(yàn)比較序列來進(jìn)行確認(rèn)。被定義的適當(dāng)?shù)碾s交條件是對應(yīng)的技術(shù)范圍內(nèi)(例，參照 Sambrook 等人 1989 年的 infra)。
[0020]本發(fā)明中術(shù)語“半胱氨酸轉(zhuǎn)換”是指通過OPSS的催化作用由底物OPS轉(zhuǎn)換成產(chǎn)物半胱氨酸的反應(yīng)，即將OPS轉(zhuǎn)換成半胱氨酸來得到半胱氨酸的反應(yīng)。此外，術(shù)語“半胱氨酸轉(zhuǎn)換率”意味著OPS轉(zhuǎn)換成半胱氨酸的比例。在最佳反應(yīng)條件下I摩爾OPS轉(zhuǎn)換成I摩爾半胱氨酸時(shí)，例如由100摩爾OPS經(jīng)過轉(zhuǎn)換反應(yīng)得到100摩爾半胱氨酸時(shí)，半胱氨酸轉(zhuǎn)換率是100%。本發(fā)明的OPSS經(jīng)過將OPS轉(zhuǎn)換成半胱氨酸的過程，因此具有如下優(yōu)點(diǎn)，即比利用OAS的代謝路徑要短，不僅對前體生產(chǎn)有利，而且與現(xiàn)有的OPSS不同，在沒有用于傳遞硫的輔酶(結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的mec+及cysO)的條件下,用OPSS自身生產(chǎn)半胱氨酸。
[0021]本發(fā)明的OPSS可以是由具有SEQ ID No:9至SEQ ID No: 12的堿基序列的多核苷酸編碼的。本發(fā)明的具有SEQ ID No:1或2的氨基酸序列的OPSS可以是分別由具有SEQ IDNo:9或10的堿基序列的多核苷酸編碼的，更優(yōu)選的，為了提高不同蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)，可以是由下述多核苷酸編碼的，所述多核苷酸具有密碼子使用頻率(codon usage)對大腸桿菌最佳化的SEQ ID No:11或12的堿基序列。
[0022]本發(fā)明的表達(dá)所述OPSS的微生物可以是固有的表達(dá)本發(fā)明的OPSS的微生物，或編碼本發(fā)明的OPSS的堿基序列以載體形式或以插入到染色體內(nèi)的形式導(dǎo)入的微生物。所述表達(dá)OPSS的微生物，其活性還可進(jìn)一步強(qiáng)化。強(qiáng)化OPSS活性的方法有:通過將包含具有編碼OPSS的堿基序列的多核苷酸的載體導(dǎo)入到所述微生物來增加拷貝數(shù)的方法、將所述堿基序列的密碼子使用頻率根據(jù)在所述微生物中主要利用的密碼子使用頻率進(jìn)行最佳化的方法、將表達(dá)所述OPSS的微生物中的編碼所述OPSS的基因的啟動子替換成強(qiáng)啟動子的方法、對所述啟動子導(dǎo)入變異的方法以及對編碼所述新分離的OPSS的基因?qū)胱儺愂沟盟鯫PSS的活性被強(qiáng)化的方法等。
[0023]本發(fā)明中術(shù)語“載體”是指利用宿主細(xì)胞用于堿基的克隆和/或轉(zhuǎn)移的任意媒介物。載體可以是其他DNA片段結(jié)合而可引起結(jié)合的片段的復(fù)制的復(fù)制子(replicon)?！皬?fù)制子”是指在生物體內(nèi)起到DNA復(fù)制的自身單元，即可通過自身的調(diào)節(jié)進(jìn)行復(fù)制的任意遺傳單位(例如，質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、病毒)。
[0024]本發(fā)明中表達(dá)所述OPSS的微生物可以是通過轉(zhuǎn)化包含所述OPSS的載體的方法得到的微生物，而所述轉(zhuǎn)化方法包括將堿基導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的任何方法，可選擇本領(lǐng)域中公知的適合的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。所述方法的例子有電穿孔(electroporat1n)、碳酸鈣共沉淀(calcium phosphate co-precipitat1n)、轉(zhuǎn)錄病毒感染(retroviral infect1n)、微注身寸法(microinject1n)、DEAE_ 葡聚糖(DEAE-dextran)、陽離子脂質(zhì)體(cat1nic liposome)法等，但不限于此。
[0025]表達(dá)所述OPSS的微生物是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞均可，優(yōu)選的是腸桿菌科微生物或棒狀桿菌型微生物等，更優(yōu)選的是埃希式桿菌屬微生物、沙雷氏菌屬微生物等，最優(yōu)選的是大腸桿菌。
[0026]通過本發(fā)明培養(yǎng)表達(dá)上述新分離的OPSS的微生物，并可從該培養(yǎng)液分離OPSS。本領(lǐng)域中通常已知的方法都可使用，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，采用了利用PET表達(dá)系統(tǒng)手冊(Novagen股份有限公司)培養(yǎng)微生物并用鎳柱親和層析(N1-NTA columns)分離的方法。
[0027]在本發(fā)明中，作為新OPSS的底物使用的OPS既可以使用市售的純化0PS，也可以使用通過發(fā)酵制備的OPS發(fā)酵液。所述純化的OPS可購買例如西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司的產(chǎn)品號為P0878的OPS或和光(Wako)公司的產(chǎn)品號為CAS407-41-0的0PS。此外，所述OPS發(fā)酵液可通過培養(yǎng)具有OPS生產(chǎn)能力的微生物，例如以保藏號 KCCMl 1103P (CA07-0022/pCL-prmf-serA* (G336V) -serC ；參照韓國公開專利第10-2012-0041115號)保藏的微生物來制備。
[0028]本發(fā)明中術(shù)語“硫化物(sulfide) ”是指硫與比硫更加陽性的元素的化合物的總稱，是為本發(fā)明的目的而制備半胱氨酸或其衍生物時(shí)所使用的化合物。所述硫化物不僅可利用本領(lǐng)域中通常使用的固體，而且只要是因pH、壓力或溶解度的差異而以液體或氣體形態(tài)提供，從而能夠以硫化物(sulfide, S2_),硫代硫酸鹽(th1sulfate, S2O32O等形態(tài)轉(zhuǎn)換成硫醇基的所有硫化物都可使用。優(yōu)選地，可利用Na2S、H2S、NaSH、(NH4)2S及S203。在本發(fā)明的具體的一個(gè)實(shí)施例中將Na2S用作硫源。本發(fā)明的反應(yīng)是在一個(gè)OPS反應(yīng)器中提供一個(gè)硫醇基來制備一個(gè)半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的反應(yīng)，所述反應(yīng)時(shí)硫化物的添加量不限于此，但優(yōu)選反應(yīng)時(shí)所添加的OPS 摩爾濃度的0.1倍至3倍，更優(yōu)選I倍至2倍。本發(fā)明的使OPSS能夠進(jìn)行最佳的酶轉(zhuǎn)換的方法可適用本領(lǐng)域中眾所周知的多種方法。其方法的例子有掌握OPSS酶的特性的方法，優(yōu)選地掌握OPSS酶最佳的活性溫度、pH、是否阻礙底物及濃度，以及OPSS酶自身的熱穩(wěn)定性等，掌握酶轉(zhuǎn)換反應(yīng)的最佳條件的方法，特別是掌握酶轉(zhuǎn)換反應(yīng)時(shí)所使用的最佳的OPSS酶濃度及所使用的底物的最佳平衡濃度、對除OPS底物以外酶轉(zhuǎn)換反應(yīng)時(shí)所使用的硫化物的偏好、轉(zhuǎn)換反應(yīng)時(shí)所使用的緩沖液偏好和由此產(chǎn)生的離子影響性以及是否存在輔酶及最佳濃度的掌握等，但不限于此。
[0029]在本發(fā)明的具體的一個(gè)實(shí)施例中，利用Dal-OPSS確認(rèn)不同pH及溫度下半胱氨酸轉(zhuǎn)換率的結(jié)果，確認(rèn)了 pH在7.0至7.4顯示出最佳活性(圖2)，溫度在37°C下顯示出最佳活性(圖4)。
[0030]在本發(fā)明中，半胱氨酸轉(zhuǎn)換反應(yīng)時(shí)作為額外的輔助因子(cofactor)可添加PLP (吡哆醛-5’ -磷酸)、DTT (二硫蘇糖醇)或同時(shí)添加PLP及DTT。所述輔助因子在半胱氨酸轉(zhuǎn)換反應(yīng)中能夠使其效率增加，在本發(fā)明的具體的一個(gè)實(shí)施例中添加0.2mM PLP、25mMDTT或同時(shí)添加兩種輔助因子時(shí)確認(rèn)了半胱氨酸轉(zhuǎn)換率增加(表5)。所述PLP不限于此，但可優(yōu)選添加0.0OlmM至2mM,更優(yōu)選添加0.01mM至ImM。此外,所述DTT不限于此,但可優(yōu)選添加0.0OlmM至10mM,更優(yōu)選添加0.01mM至50mM。
[0031]本發(fā)明的方法還可包括對通過所述反應(yīng)步驟生產(chǎn)的半胱氨酸或其衍生物進(jìn)行分離及純化的步驟。所述步驟中，可利用本領(lǐng)域中公知的適合的方法來從反應(yīng)液分離及純化目標(biāo)半胱氨酸并收集。
[0032]本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠用公知的化學(xué)合成方法從用本發(fā)明的方法制備的半胱氨酸容易地合成半胱氨酸衍生物。半胱氨酸與乙?；瘎?acetylat1n agent)反應(yīng)而容易地合成為NAC(N-乙酰半胱氨酸，N-acetylcysteine)，在堿性條件下使其與鹵乙酸(haloacetic acid)反應(yīng)而合成為 SCMC (羧甲基半胱氨酸，S-Carboxymetylcysteine) ? 所述半胱氨酸衍生物主要作為制藥原料用作止咳藥、咳嗽緩解劑、支氣管炎、支氣管哮喘和咽喉炎等的治療劑。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。但是，這些實(shí)施例用于示例性地說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不由這些實(shí)施例所限制。
[0034]實(shí)施例1:0_磷酸絲氨酸巰解酶的酶鑒定
[0035]源自陰道毛滴蟲的OPSS被報(bào)告為與除OPSS以外需要兩種輔酶的源自結(jié)核桿菌的OPSS不同，沒有輔酶也顯示活性，與在60°C顯示最佳活性的敏捷氣熱菌的OPSS不同，在37°C顯示出最佳活性。以所述事實(shí)為背景，本發(fā)明發(fā)明人以陰道毛滴蟲(T.vaginalis)的OPSS氨基酸序列為基礎(chǔ)，確保了與其蛋白質(zhì)序列相似性高的源自微生物的新0PSS。所述新OPSS分別具有SEQ ID No:1及2的氨基酸序列，命名為Dac-OPSS及Dal-OPSS。此外，具有所述SEQ ID No:1及2的氨基酸序列的新OPSS分別通過具有SEQ ID No:9及10的堿基序列的多核苷酸而編碼。
[0036]所述兩個(gè)OPSS不源自大腸桿菌，因此在大腸桿菌中的表達(dá)可能不容易。為了使在大腸桿菌中的表達(dá)容易，進(jìn)行了所述新分離的OPSS的密碼子使用頻率最佳化，這利用了密碼子使用頻率最佳化工具Jcat (WWW.jcat.de)。由此獲得了對所述多核苷酸的SEQ ID No:9及10的密碼子使用頻率被最佳化的SEQ ID No: 11及12。具有所述SEQ ID No: 11及12的堿基序列的多核苷酸是通過向季諾科貿(mào)(Genotech Corp.)提供所述堿基序列來合成，以通過Topo TA克隆(cloning)的載體形式供應(yīng)得到。為了從各自的菌株獲得OPSS酶，制作了通常用于酶表達(dá)的pET28a(novagen)載體系統(tǒng)。
[0037]在下述表1中顯示了共三種的OPSS酶表達(dá)載體名稱和用于制作載體所使用的各自的模板及引物。用NdeI和HindIII限制酶處理了(37°C，反應(yīng)3小時(shí))匹配模板和引物并通過PCR方法對各自的OPSS基因進(jìn)行擴(kuò)增而得到的基因片段和載體pET28a。此后使用通常的連接方法將各自的基因片段插入到pET28a載體。用測序法對各自的酶表達(dá)載體制備與否及基因序列都進(jìn)行了確認(rèn)。將所述制作的酶表達(dá)載體導(dǎo)入到具有DE3基因型的大腸桿菌來制備能夠獲得共三種的OPSS酶的菌株。
表1
【權(quán)利要求】
1.一種半胱氨酸或其衍生物的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括:在具有SEQ ID No:1或2所示的氨基酸序列的O-磷酸絲氨酸巰解酶或表達(dá)其的微生物存在的情況下，使O-磷酸絲氨酸與硫化物反應(yīng)，從而制備半胱氨酸或其衍生物的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述O-磷酸絲氨酸巰解酶由具有選自SEQID No:9至SEQ ID No:12組成的組中的堿基序列的多核苷酸編碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述O-磷酸絲氨酸是純化的O-磷酸絲氨酸或包含O-磷酸絲氨酸的微生物的發(fā)酵液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述硫化物選自Na2S、H2S,NaSH, (NH4)2S及S2O3組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述硫化物的添加量是反應(yīng)時(shí)添加的O-磷酸絲氨酸摩爾濃度的0.1倍至3倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，作為所述反應(yīng)時(shí)的輔助因子還添加0.0OlmM至2mM 的 PLP 或 0.0OlmM 至 10mM 的 DTT。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法還包括分離和純化所述半胱氨酸或其衍生物的步 驟。
【文檔編號】C12P13/12GK104039963SQ201280067058
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月15日
【發(fā)明者】宋秉哲, 張真淑, 趙宰賢, 金蕙園 申請人:Cj第一制糖株式會社