通過(guò)單分子雜交和操作進(jìn)行的dna檢測(cè)和定量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和定量核酸、DNA或RNA的快速方法。具體地，本發(fā)明提供基于物理和電子處理的用于檢測(cè)和定量特異核酸分子存在的方法。本發(fā)明的方法特別適用于檢測(cè)染色體異常分布或基因表達(dá)分析的多種應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】通過(guò)單分子雜交和操作進(jìn)行的DNA檢測(cè)和定量的方法
【背景技術(shù)】
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和定量核酸、DNA或RNA的快速方法。具體地，本發(fā)明提供基 于物理和電子處理的用于檢測(cè)和定量特異核酸分子存在的方法。本發(fā)明的方法特別適用于 檢測(cè)異常的染色體分布或基因表達(dá)分析的多種應(yīng)用。
[0002] 對(duì)大范圍通常利用的生物應(yīng)用而言，檢測(cè)和定量核酸序列是重要的。所述應(yīng) 用包括體外診斷領(lǐng)域，包含臨床診斷、在分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究、高通量藥物篩選、獸醫(yī) 診斷、農(nóng)業(yè)遺傳學(xué)測(cè)試、環(huán)境測(cè)試、食品測(cè)試、工業(yè)工程監(jiān)控和保險(xiǎn)測(cè)試。具體地，證明 在生理樣本中特異DNA序列的存在構(gòu)成目前診斷方法發(fā)展的主線，例如，用于鑒定發(fā)展 出抗生素抗性的細(xì)菌的可能性、基因異常、與遺傳修飾相關(guān)的癌癥風(fēng)險(xiǎn)和病毒感染，例如 與HIV或與肝炎病毒相關(guān)的感染（參見(jiàn)，例如Zhang等人，Nature, 358:591-593, 1992 ; Turner 等人，J Bacteriol，176 (12): 3708_3722，1994;Weston 等人，Infection and Immunity.，77(7) :2840-2848, 2009)。檢測(cè)和/或定量特定核酸序列對(duì)于以下各種應(yīng)用也是 至關(guān)重要的，所述應(yīng)用例如產(chǎn)前診斷、研究基因表達(dá)、獲得古代DNA、診斷遺傳病、檢測(cè)序列 多態(tài)性、定量DNA重復(fù)、檢測(cè)病原體、鑒定遺傳修飾的生物體等。（參見(jiàn)，例如W0 02/31463 ; W0 2006/058395 ；US 5,705,365 ；US 5, 840, 487 ；US 5, 858, 658 ；U S 6, 453, 245 ；US 7, 919, 247 ;Ver jat 等人，Biotechniques, 37 (3) : 476-481，2004 ;Vural, Afr. J. Biotechnol .,8(20):5163-5168,2009 ;van der Meide 等人，J. Clin. Microbiol. ,43(11) :5560-5566 ; 2005 ;Fan 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(42) :16266-16271，2008 ;Buehler 等 人，Methods, 50: S15-S18, 2010 ;Clark 等人，Genome Res·, 11:1594-1602,2001 ;Vernon 等 人，BMC Infect Dis, 3:12, 2003 ;Pi印enburg 等人，PLoS Biol.，4 (7) : e204, 2006)。
[0003] 幾種技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了多年，其都依賴于檢測(cè)在靶核酸分子和特異標(biāo)記探針之間的 雜交分子。今天，用于檢測(cè)核酸的最廣泛使用的方法基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)。例如，實(shí) 時(shí)PCR用于放大和同時(shí)定量靶DNA分子。
[0004] 核酸的任何檢測(cè)和/或定量方法中的關(guān)鍵方面是靈敏度。開(kāi)發(fā)的第一技術(shù)需要 大樣本尺寸。這種問(wèn)題通過(guò)在PCR方法中的擴(kuò)增步驟得到緩解。因此，基于PCR的方法允 許通過(guò)擴(kuò)增靶核酸來(lái)檢測(cè)非常少量的核酸（Haque等人.，BMC Biotechnol.，3:20, 2003)。 在生物研究中，PCR因此加速了對(duì)傳染性疾病檢測(cè)的研究。PCR的醫(yī)療應(yīng)用包括在人體組 織中鑒定病毒、細(xì)菌和癌細(xì)胞。在稱為原位（原位點(diǎn)）PCR的步驟中，甚至可以在單個(gè)細(xì) 胞內(nèi)使用PCR以鑒定特異細(xì)胞類型。PCR也可以應(yīng)用到RNA擴(kuò)增中，此方法稱為逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR(RT-PCR)。RT-PCR類似常規(guī)PCR，其具有增加的起始步驟，其中使用稱為逆轉(zhuǎn)錄酶的酶 從RNA靶合成DNA。各種RNA分子，包括核糖體RNA、信使RNA和基因組病毒RNA，已用于 RT-PCR 中。
[0005] 然而，到目前為止所有開(kāi)發(fā)方法具有嚴(yán)重缺點(diǎn)。具體地，它們?nèi)际褂脴?biāo)記的核苷 酸（例如，使用熒光的標(biāo)記），因此造成整體成本的劇烈增加。另外，擴(kuò)增靶序列是費(fèi)時(shí)的、 增加錯(cuò)誤的可能性并是高度易污染的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的方法基于物理技術(shù)和電子處理，不同于目前的化學(xué)或生物化學(xué)方 法。其優(yōu)勢(shì)是：
[0007] 1)它不需要在檢測(cè)和定量之前的PCR步驟；
[0008] 2)它不使用昂貴的標(biāo)記核苷酸（用熒光素或一些其它基團(tuán)標(biāo)記）。
[0009] 此外，本發(fā)明的方法與沿發(fā)夾上全局（電子或光學(xué)）檢測(cè)阻礙的位置相結(jié)合，允許 對(duì)基因組DNA的快速大規(guī)模診斷并提供對(duì)目前DNA芯片技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性替代。
[0010] 本發(fā)明涉及用于檢測(cè)核酸序列的方法，其中與所述核酸序列相對(duì)應(yīng)的變性雙鏈核 酸的復(fù)性被阻斷。
[0011] "核酸序列的檢測(cè)"在本文表示導(dǎo)致直接或間接獲得一些關(guān)于特異核酸序列存在 或不存的信息的所有活動(dòng)，其包括但不限于檢測(cè)核酸分子中的特定序列，或檢測(cè)兩個(gè)不同 核酸分子序列之間的差異。核酸序列的檢測(cè)可包括所述核酸序列的實(shí)際確定，即破譯在所 述核酸中實(shí)際連續(xù)的堿基；但是，在大多數(shù)實(shí)施方式中，可以不測(cè)序所述核酸而進(jìn)行本發(fā) 明。
[0012] 本發(fā)明基于這樣的觀察，即變性雙鏈核酸的兩條鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下將重新雜交。 如果在復(fù)性步驟期間一些分子結(jié)合至所述變性雙鏈核酸的任意鏈，則重新雜交僅是部分 的。本發(fā)明人目前已發(fā)現(xiàn)，在某些條件下，在重新雜交中這種永久或瞬時(shí)的暫停可用于檢測(cè) 變性雙鏈核酸分子中所包含的序列。根據(jù)本發(fā)明，有可能檢測(cè)雙鏈核酸分子重新雜交的阻 斷；與這種阻斷相關(guān)的物理參數(shù)（如，阻斷的持續(xù)時(shí)間，在雙鏈核酸分子上阻斷的位置）從 而允許確定核酸序列。
[0013] 因此，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)核酸序列的方法，所述方法包括步驟：檢測(cè)與所述核酸 序列相對(duì)應(yīng)的變性雙鏈核酸復(fù)性的阻斷。
[0014] "變性"在本文表示當(dāng)所述鏈之間的大部分氫鍵斷裂時(shí)發(fā)生的雙鏈核酸分子的兩 條鏈分離的過(guò)程。變性過(guò)程產(chǎn)生變性核酸分子，其在本文表示雙鏈核酸分子變性所產(chǎn)生的 兩條分離的互補(bǔ)鏈。"復(fù)性"在本文指兩條分離的互補(bǔ)鏈通過(guò)雜交重新形成雙螺旋的過(guò)程。 如本文所用，"雜交"是核酸的兩條或多條互補(bǔ)鏈之間建立非共價(jià)的、序列特異性的相互作 用從而形成單個(gè)雜交體的過(guò)程。
[0015] 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知有幾種可能性來(lái)變性核酸。在一個(gè)最優(yōu)選的方式中，通過(guò)向 兩條鏈?zhǔn)┘游锢砹⑵浞珠_(kāi)。根據(jù)本發(fā)明的"物理力"是導(dǎo)致物體經(jīng)歷某種改變的任何影 響力，該改變關(guān)于其運(yùn)動(dòng)、方向或幾何構(gòu)造。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚根據(jù)本發(fā)明的力與其它 物理參數(shù)如溫度（這是直接的物質(zhì)屬性而不是施加于其上的影響力）不同。根據(jù)本發(fā)明的 物理力包括這樣的力如摩擦力、拉力、法向力、空氣阻力、作用力、和彈力。最優(yōu)選地，根據(jù)本 發(fā)明的物理力是拉力。根據(jù)本實(shí)施方式，所述雙鏈核酸的游離端可被拉開(kāi)，因此使配對(duì)堿基 之間的所有鍵斷裂從而打開(kāi)雙鏈核酸。
[0016] 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法涉及用于檢測(cè)核酸序列的方法，所述方法 包括以下步驟：
[0017] ?通過(guò)向雙鏈核酸分子施加物理力使對(duì)應(yīng)于所述核酸序列的所述雙鏈核酸分子變 性；以及
[0018] ?檢測(cè)所述雙鏈核酸復(fù)性的阻斷。
[0019] 在這種類型的序列檢測(cè)方法中，為了促進(jìn)重新配對(duì)，安排雙鏈DNA的游離端（即沒(méi) 有附著至支持物的端）在被拉開(kāi)之前共價(jià)或準(zhǔn)共價(jià)彼此連接是有利的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方式中，雙鏈核酸分子是發(fā)夾。在本發(fā)明的上下文中如果需要圖表地表示雙鏈核酸，可能將 其比作打開(kāi)（或關(guān)閉）的"拉鏈"（zip fastener):雙鏈核酸的變性就是打開(kāi)拉鏈，復(fù)性是 拉上拉鏈。
[0020] 本發(fā)明人已經(jīng)觀察到，在一定條件下，當(dāng)分子結(jié)合至變性雙鏈核酸分子時(shí)，所述分 子的復(fù)性被阻斷。結(jié)合的分子可以是對(duì)所述變性雙鏈核酸分子上的特異性序列具有親和性 的任何類型的分子，如核酸、蛋白質(zhì)或小分子。然而，優(yōu)選使用單鏈核酸，因?yàn)樗鰡捂満怂?可以與變性雙鏈核酸鏈的一條鏈上的互補(bǔ)序列雜交。只要這種單鏈核酸長(zhǎng)到足以阻斷復(fù)性 過(guò)程，它可以是任何長(zhǎng)度的。優(yōu)選地，單鏈核酸的長(zhǎng)度包括在3和50個(gè)核苷酸之間；更優(yōu) 選地，在3和45個(gè)核苷酸之間，在3和40個(gè)核苷酸之間，在3和35個(gè)核苷酸之間，在3和 30個(gè)核苷酸之間，在3和25個(gè)核苷酸之間，在3和20個(gè)核苷酸之間，在3和15個(gè)核苷酸之 間，甚至更優(yōu)選3和12個(gè)核苷酸之間。本發(fā)明的單鏈核酸尤其可以是天然的或修飾的DNA 或RNA分子。所述單鏈核酸也可以由修飾的核苷酸構(gòu)成，如鎖核酸（LNA)，它是其中核糖部 分修飾有連接2'氧和4'碳的額外橋的核苷酸，或者肽核酸（PNA)，其中骨架由通過(guò)肽鍵連 接的重復(fù)的N-(2-氨乙基）-甘氨酸單元組成。
[0021] 在復(fù)性之前向變性雙鏈核酸添加單鏈核酸分子時(shí)，重新雜交的阻斷表明單鏈核酸 分子序列與雙鏈核酸分子的至少部分序列是互補(bǔ)的。
[0022] 因此，本發(fā)明的方法還涉及用于檢測(cè)核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟：
[0023] 1)通過(guò)向所述分子施加物理力使雙鏈核酸分子變性；
[0024] 2)提供與所述核酸序列相對(duì)應(yīng)的單鏈核酸分子；
[0025] 3)在所述單鏈核酸分子存在時(shí)使所述雙鏈核酸分子復(fù)性；以及
[0026] 4)檢測(cè)雙鏈核酸復(fù)性的阻斷。
[0027] 本發(fā)明適用于任何類型的雙鏈核酸。大多數(shù)情況下，雙鏈核酸將是DNA，但應(yīng)當(dāng)理 解，本發(fā)明也適用于單鏈DNA-單鏈DNA雙鏈體，完全配對(duì)的或者不完全配對(duì)的；或可選擇地 適用于單鏈DNA-單鏈RNA雙鏈體，完全配對(duì)的或者不完全配對(duì)的；或可選擇地適用于單鏈 RNA-單鏈RNA雙鏈體，完全配對(duì)的或者不完全配對(duì)的。此外，雙鏈體可由獲自不同來(lái)源樣本 的兩條單鏈的至少部分重新配對(duì)所組成。最后，本發(fā)明也適用于僅有單鏈DNA或僅有單鏈 RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0028] 在典型的構(gòu)型中，雙鏈核酸分子可以特異性地錨定在兩種固體基質(zhì)上（如顯微鏡 載玻片、微量移液器、微粒）。末端之一可直接或間接地附到表面，而另一個(gè)末端直接或間接 附到可移動(dòng)的表面。在本實(shí)施方式中，當(dāng)移開(kāi)支持物時(shí)拉力施加到雙鏈核酸的兩個(gè)末端。當(dāng) 拉力高于閾值時(shí)，兩條鏈分離而核酸分子變性。施加的拉力優(yōu)選高于或等于15pN ;更優(yōu)選 高于或等于16pN ;甚至更優(yōu)選高于或等于17pN ;在非常優(yōu)選的方面，拉力高于或等于18pN。 這種力可隨溫度、核苷酸類型和緩沖液而變化，但本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)這些參數(shù)將很容易 調(diào)整所述力以獲得兩條鏈的分離。另一方面，當(dāng)拉力下降到低于最小值時(shí)，變性雙鏈核酸的 兩條鏈可以重新雜交。為獲得所述兩條鏈的重新雜交，優(yōu)選施加小于或等于12pN的拉力； 更優(yōu)選地，其小于或等于llpN ;甚至更優(yōu)選地，其小于或等于10pN。
[0029] 最優(yōu)選地，雙鏈核酸是發(fā)夾。如本文所用，"發(fā)夾"是指這樣的雙螺旋，其中一條鏈 的5'端通過(guò)未配對(duì)的環(huán)物理連接到另一條鏈的3'端。所述物理連接可以是共價(jià)或非共價(jià) 的。優(yōu)選地，所述物理連接是共價(jià)鍵。因此，發(fā)夾由雙鏈莖和未配對(duì)的環(huán)組成。在發(fā)夾中， 兩條鏈的未參與到環(huán)中的端是游離的，因此可被拉開(kāi)。這導(dǎo)致雙鏈核酸的未配對(duì)，從而產(chǎn)生 變性雙鏈核酸分子。有可能通過(guò)用高于閾值的力拉所述核酸分子的每一末端而完全打開(kāi)發(fā) 夾雙鏈核酸分子。當(dāng)施加到分子的拉力下降到低于最小值時(shí)，核酸分子重新雜交并重新形 成發(fā)夾。雜交至核酸鏈之一的單鏈核酸分子的存在導(dǎo)致重新雜交的暫停。因此，檢測(cè)到這 樣的暫停表明單鏈核酸分子包含與至少部分的雙鏈莖相互補(bǔ)的序列。
[0030] 在這方面，有利的是設(shè)計(jì)環(huán)序列和長(zhǎng)度以便發(fā)夾在短瞬間之后，如1秒后重新折 疊。在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了達(dá)到這種效果的方法，如在Woodside等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，103 (16) : 6190-6195, 2006中。當(dāng)力從打開(kāi)降低至測(cè)試值時(shí)，打開(kāi)的發(fā)夾的延伸 因?yàn)閱捂淒NA的彈性而變化。發(fā)夾重新折疊前的小延遲允許用戶確定在與用于檢測(cè)阻斷狀 態(tài)所用力相同的力下發(fā)夾的延伸。
[0031] 特別是，使用發(fā)夾使得有可能進(jìn)行配對(duì)和解除配對(duì)的循環(huán)，從而改善信號(hào)/噪音 比率。
[0032] 已知允許雙鏈核酸的游離端連接在一起的技術(shù)，一些技術(shù)將在以下更詳細(xì)地描 述。
[0033] 確定阻斷在本文意味著確定與阻斷相關(guān)的物理參數(shù)。一個(gè)有用的參數(shù)是在雙鏈核 酸分子上阻斷的位置，所述位置對(duì)應(yīng)于單鏈核酸分子在雙鏈核酸分子上雜交的位置。事實(shí) 上，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可精確確定復(fù)性中在雙鏈核酸上暫停發(fā)生的位置：使用發(fā)夾為本領(lǐng) 域技術(shù)人員提供一種手段，以便確定在變性/復(fù)性過(guò)程期間的任何時(shí)間上發(fā)夾兩個(gè)游離端 之間的物理距離。
[0034] "游離端"在本文表示沒(méi)有共價(jià)連接到另一條鏈末端的一條鏈的端；如上面所解釋 的，這些游離端中的每個(gè)均可以結(jié)合至不同的表面。例如，這些表面中的一個(gè)可以是可移動(dòng) 的，而另一個(gè)可以是靜止的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易地認(rèn)識(shí)到，為測(cè)量發(fā)夾雙鏈核 酸游離端之間的距離，有可能僅簡(jiǎn)單地測(cè)量?jī)蓚€(gè)表面之間的距離。
[0035] 當(dāng)發(fā)夾分子完全變性時(shí)這種距離最大（Zs (FiTff))，因?yàn)槟菚r(shí)發(fā)夾核酸完全延伸； 當(dāng)所述發(fā)夾分子完全復(fù)性時(shí)，這種距離最小（Zis(F Wi))。有利地，在相同力進(jìn)行所 有長(zhǎng)度的比較，以使得單鏈核酸具有相同的彈性性能。通過(guò)使用環(huán)關(guān)閉中的延遲，有技能的 用戶可以測(cè)量z s (F_a)。同樣地，當(dāng)復(fù)性過(guò)程臨時(shí)性地暫停時(shí)可以測(cè)量?jī)蓚€(gè)游離端之間 的距離：如預(yù)期地，這種距離z介于Z^PZ ffi (所有z以F = F#W進(jìn)行測(cè)量）之間。很清楚 地，隨著單鏈核酸序列所互補(bǔ)的序列在發(fā)夾分子中的定位變化而距離z變化。如果所述單 鏈核酸和位于靠近發(fā)夾游離端的序列相雜交，則自我重新雜交的過(guò)程就剛好在重新形成完 整發(fā)夾之前被阻斷；在這種情況下，是最小值。另一方面，如果所述單鏈核酸和靠近未 配對(duì)環(huán)的發(fā)夾部分相雜交，復(fù)性過(guò)程將被阻遏在這樣種情況：其中發(fā)夾是完全或幾乎完全 變性的；在這種情況下，最大（圖1)。
[0036] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，將一個(gè)或更多參考單鏈核酸雜交至DNA發(fā)夾上的已知序列 (例如，靠近其基部或靠近其環(huán)），并且相對(duì)于所述參考單鏈核酸的雜交位置來(lái)測(cè)量探測(cè)的 單鏈核酸的雜交位置。
[0037] 有可能精確地將雙鏈核酸分子中的物理距離與若干堿基相關(guān)聯(lián)。例如，在10pN力 下，0.8nm的距離對(duì)應(yīng)于核酸中由兩個(gè)核苷酸（lbp)所跨越的距離。由單鏈核酸的彈性給出 相對(duì)于力的準(zhǔn)確校準(zhǔn)。因此，通過(guò)簡(jiǎn)單測(cè)量雙鏈核酸分子兩個(gè)游離端（或在所述分子上的 任意兩個(gè)參考位置）之間的距離有可能精確地確定復(fù)性在何處被阻斷。
[0038] 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明由用于檢測(cè)核酸序列的方法組成，其中對(duì)應(yīng)于待 檢測(cè)序列的雙鏈核酸分子首先通過(guò)施加物理力變性，然后在單鏈核酸存在下重新雜交，以 及檢測(cè)重新雜交中阻斷的存在。在一個(gè)方面中，當(dāng)復(fù)性過(guò)程被阻斷時(shí)，確定雙鏈分子兩端之 間的距離。優(yōu)選地，當(dāng)分子完全變性時(shí)，確定所述分子兩端之間的距離。更優(yōu)選地，比較兩 個(gè)距離并確定阻斷的位置。更優(yōu)選地，測(cè)量在完全延伸的環(huán)和參考雜交位置之間的距離，并 用其確定阻斷的位置。甚至更優(yōu)選地，測(cè)量?jī)蓚€(gè)參考雜交位置之間的距離，并用其確定阻斷 的位置。
[0039] 除了其在分子上的位置，與復(fù)性阻斷相關(guān)的最有用的參數(shù)是復(fù)性被阻斷期間的時(shí) 間長(zhǎng)短（本文稱為復(fù)性暫停的持續(xù)時(shí)間）。事實(shí)上，有可能測(cè)量重新雜交被阻斷期間的時(shí)間 長(zhǎng)短。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定以下期間的時(shí)間長(zhǎng)短：其間雙鏈核酸的兩端之間距離 為如上所定義的z，即中間值在2胃和Z ffi之間。
[0040] 阻斷的持續(xù)時(shí)間取決于兩條序列之間的互補(bǔ)程度?；パa(bǔ)性越高，兩分子之間建立 的鍵的數(shù)目越多，并且因此持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)。還清楚的是，阻斷時(shí)間將取決于兩條序列之間互 補(bǔ)性區(qū)域的長(zhǎng)度。區(qū)域越長(zhǎng)，兩分子之間建立的鍵的數(shù)目越多，因此持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)。因此容 易想到，在某些條件下復(fù)性暫停的持續(xù)時(shí)間將幾乎是永久的。特別是，當(dāng)單鏈核酸包含多于 20個(gè)，優(yōu)選多于25個(gè)，甚至更優(yōu)選多于30個(gè)能夠與變性雙鏈核酸雜交的核苷酸時(shí)，即使當(dāng) 向所述雙鏈核酸施加的力降低到？ 3^時(shí)，單鏈核酸仍然與雙鏈發(fā)夾雜交（許多分鐘），從而 防止所述雙鏈發(fā)夾的自己重新雜交。在這樣的情況下，使用酶去除單鏈核酸分子可能是有 利的。因此，去除所述單鏈核酸分子使得可能進(jìn)行配對(duì)和解除配對(duì)的循環(huán)，從而改善信號(hào)/ 噪音比。作為合適的酶的實(shí)例,可以舉出例如解旋酶，包括UvrD解旋酶、大腸桿菌UvrD解 旋酶、Tte-UvrD解旋酶、T7 Gp4解旋酶、RecBCD解旋酶、DnaB解旋酶、MCM解旋酶、Rep解旋 酶、RecQ解旋酶、PcrA解旋酶、T4 UvsW解旋酶、SV40大T抗原解旋酶、皰疹病毒解旋酶、酵 母Sgsl解旋酶、DEAH_ATP依賴的解旋酶和乳頭狀瘤病毒解旋酶E1蛋白及其同源物。優(yōu)選 地，使用T4 UvsW解旋酶。
[0041] 暫停的持續(xù)時(shí)間也可隨著反應(yīng)條件變化。所述持續(xù)時(shí)間將隨著溫度的升高而降 低。同樣，緩沖條件也可以調(diào)節(jié)暫停的持續(xù)時(shí)間：例如，鎂、甜菜堿和氯化四甲銨（以摩爾濃 度使用的TMAC)增加阻斷時(shí)間。與GC相比，這些化合物更加加強(qiáng)AT配對(duì)，從而減少這些配 對(duì)之間強(qiáng)度的差異。然而，當(dāng)溫度和緩沖液固定時(shí)，暫停的持續(xù)時(shí)間將僅取決于拉動(dòng)變性雙 鏈核酸的力以及其與單鏈核酸的互補(bǔ)性。
[0042] 因此，在一個(gè)具體方面，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
[0043] ?通過(guò)向所述雙鏈核酸分子施加物理力使與所述核酸序列相對(duì)應(yīng)的所述雙鏈核酸 分子變性；
[0044] ?提供單鏈核酸分子；
[0045] ?在所述單鏈核酸分子存在下使所述雙鏈核酸分子復(fù)性；以及
[0046] ?檢測(cè)所述雙鏈核酸分子復(fù)性的阻斷；以及
[0047] ?確定暫停的持續(xù)時(shí)間。
[0048] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的方法全都使用熒光核苷酸，但本發(fā)明的方法只涉及核酸分子延伸 的機(jī)械檢測(cè)。因此，本發(fā)明的方法不受與現(xiàn)有技術(shù)方法相關(guān)的任何弊端所困。
[0049] 在優(yōu)選的方面中，檢測(cè)所述雙鏈核酸分子復(fù)性的阻斷包括確定雙鏈核酸分子上阻 斷的位置，如上所述。
[0050] 在這個(gè)【具體實(shí)施方式】中，根據(jù)本發(fā)明的方法可用于診斷目的，從而允許特別是測(cè) 序與尋找的異常相對(duì)應(yīng)的核酸的變異區(qū)。
[0051] 然而，基于觀察到的寡核苷酸和DNA序列之間的錯(cuò)配導(dǎo)致更短暫的雜交，有可能 提供一種簡(jiǎn)化的技術(shù)。在第一方面，利用上述任何方法使發(fā)夾雙鏈核酸分子的復(fù)性被單鏈 核酸阻斷，并確定阻斷的持續(xù)時(shí)間。在優(yōu)選的方面中，該值和參考值進(jìn)行比較。在另一優(yōu)選 的方面，所述參考值對(duì)應(yīng)于如通過(guò)上述任何方法所確定的通過(guò)參考單鏈核酸所觀察到的暫 停長(zhǎng)度。
[0052] 出于診斷目的，如尋找基因組DNA中的突變，所述技術(shù)可以以兩種方式實(shí)施：
[0053] 1)在溶液中用寡核苷酸探測(cè)含有被尋找的突變的基因組DNA所形成的發(fā)夾。
[0054] 2)通過(guò)在溶液中以固定大小的單鏈DNA片段存在的基因組DNA來(lái)探測(cè)發(fā)夾，所述 發(fā)夾包含具有被尋找突變的序列。這將是顯而易見(jiàn)的，即如果分析的目標(biāo)只是找到這種序 列中特異性序列或可能突變的存在，則把該序列置于發(fā)夾環(huán)中提供一種非常簡(jiǎn)單的檢測(cè)方 案。如果寡核苷酸在環(huán)中雜交，則寡核苷酸完全阻止發(fā)夾重新折疊，從而導(dǎo)致非常大的延伸 改變，因此可以輕易檢測(cè)到所述延伸改變，如下文所述。
[0055] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的方法須使用熒光或放射性核苷酸來(lái)標(biāo)記探針，而本方法僅依賴機(jī) 械檢測(cè)核酸分子延伸。此外，不需要檢測(cè)前的擴(kuò)增步驟。因此，本發(fā)明的方法允許檢測(cè)在一 整群核酸分子內(nèi)的一個(gè)單一分子。因?yàn)橛帽景l(fā)明的方法可獲得單分子分辨率，可以檢測(cè)每 個(gè)攜帶特異序列的分子。因此，本發(fā)明使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠計(jì)數(shù)攜帶所述序列的核酸 分子的數(shù)目。本發(fā)明的方法允許簡(jiǎn)單和精確地定量在整群核酸分子中的特異核酸序列。
[0056] 因此，在本發(fā)明的另一方面提供定量樣本中含有特異序列的一個(gè)種類（species) 的雙鏈核酸分子的方法，所述方法包括以下步驟：
[0057] a)通過(guò)向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性；
[0058] b)提供與所述序列相對(duì)應(yīng)的單鏈核酸分子；
[0059] c)在所述單鏈核酸分子存在時(shí)使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復(fù)性；以及
[0060] d)檢測(cè)在其中復(fù)性被阻斷的雙鏈核酸分子；以及
[0061] e)計(jì)數(shù)步驟d)的雙鏈核酸分子。
[0062] 待定量的核酸種類（species)是含有所述特異序列的核酸分子的群。因此，它們 與其它核酸分子的不同之處在于它們含有這種特異序列。雖然這些分子都具有這種序列， 它們可以相同或可以不相同。在某些實(shí)施方式中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可優(yōu)選測(cè)量在所述特定 序列之外不相同的核酸種類的數(shù)量；例如，可令人感興趣的是本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)量G1細(xì)胞 周期蛋白轉(zhuǎn)錄物CLN1和CLN2的數(shù)量，所述CLN1和CLN2在出芽酵母細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期時(shí) 表達(dá)。在一些其它實(shí)施方式中，可更優(yōu)選的定量一群相同的核酸分子，例如，由差異剪接所 得的基因的不同亞型。這可以通過(guò)仔細(xì)選擇所述特異序列來(lái)容易地實(shí)現(xiàn)：在可公開(kāi)獲得的 序列數(shù)據(jù)庫(kù)（例如，Genbank)的幫助下，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何設(shè)計(jì)與上述情況中的一 個(gè)或其它相對(duì)應(yīng)的序列，而無(wú)須在此進(jìn)一步詳述。
[0063] 也可能使用一個(gè)以上的單鏈核酸，所述一個(gè)或更多個(gè)單鏈核酸能夠與在變性雙鏈 核酸分子上的一個(gè)或更多個(gè)不同序列進(jìn)行雜交。
[0064] 當(dāng)使用一個(gè)以上單鏈核酸分子時(shí)，有利地是所述一個(gè)或更多個(gè)單鏈核酸對(duì)應(yīng)于一 個(gè)或更多個(gè)不同的序列。在這種情況下，可以同時(shí)或相繼地將所述單鏈核酸分子加至變性 雙鏈核酸分子中。所述不同的單鏈核酸可在不同位置阻斷所述變性雙鏈核酸的復(fù)性?；?每個(gè)單鏈核酸序列與所述雙鏈核酸序列的相似程度，重新雜交期間的阻斷數(shù)量和位置限定 出獨(dú)特的指紋。因此，指紋是阻斷的模式，其在所述變性雙鏈核酸分子復(fù)性階段期間作為一 個(gè)或更多個(gè)單鏈核酸與雙鏈核酸分子相雜交的結(jié)果被觀察到。這種指紋可用于在DNA樣本 中鑒定和計(jì)數(shù)各種雙鏈分子。
[0065] 所建議的方法學(xué)不需要使用熒光標(biāo)記的探針，并提供額外的位置信息（超出僅僅 的探針雜交）。例如，使用這種方法可以比較地檢查成千上萬(wàn)的個(gè)體文庫(kù)片段。將具有類似 指紋的cDNA分成群集，從而其提供關(guān)于表達(dá)基因數(shù)目以及基因相對(duì)表達(dá)水平的信息。
[0066] 因此，在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的方法涉及用于定量在樣本中的含有一個(gè) 或更多個(gè)特異序列的一個(gè)種類的雙鏈核酸分子的方法，所述方法包括以下步驟：
[0067] a)通過(guò)向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性；
[0068] b)提供與所述一個(gè)或更多個(gè)序列相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或更多個(gè)單鏈核酸分子；
[0069] c)在所述單鏈核酸分子存在時(shí)使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復(fù)性；
[0070] d)檢測(cè)在其中復(fù)性被所述一個(gè)或更多個(gè)單鏈核酸分子阻斷的雙鏈核酸分子；以 及
[0071] e)計(jì)數(shù)步驟d)的分子。
[0072] 優(yōu)選地，在步驟b)提供至少2種單鏈分子；更優(yōu)選地，至少3種；又更優(yōu)選地，至少 5種；甚至更優(yōu)選地，至少10種；最優(yōu)選地至少15種。
[0073] 本發(fā)明的樣本是任何類型的樣本，其可含有所需核酸種類（species)，如，例如反 應(yīng)混合物。其也可以是，例如生物樣本。"生物樣本"可以是可含有生物有機(jī)體的任何樣本， 如，例如細(xì)菌、病毒、植物、酵母等。根據(jù)本發(fā)明的"生物樣本"還涉及可從生物有機(jī)體獲得 的樣本，如獲自細(xì)菌、病毒、植物、酵母等的細(xì)胞提取物。具體地，生物樣本可以是取自受試 者的任何樣本，如血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、血液樣本、淋巴樣本、或活檢樣本。這樣的 樣本必須允許定量染色體序列。用于定量基因組序列的優(yōu)選生物樣本，包括樣本如血液樣 本、血漿樣本、淋巴樣本、或活檢樣本。優(yōu)選地，所述生物樣本是血液樣本。實(shí)際上，可以通 過(guò)完全無(wú)害的血液采集從孕婦獲得這種血液樣本，從而因此允許，例如胎兒非整倍體的非 侵入性診斷。另外，可以使用來(lái)自癌癥患者的血液樣本，例如用于通過(guò)本發(fā)明的方法來(lái)表征 液體腫瘤。
[0074] 當(dāng)癌癥是實(shí)體癌癥時(shí)，本文所用的"生物樣本"還包括待測(cè)患者的實(shí)體癌癥樣本。 這樣的實(shí)體癌癥樣本允許技術(shù)人員通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行所需核酸水平的測(cè)量。在一些情 況下，根據(jù)本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括從患者取出實(shí)體癌癥樣本的預(yù)備步驟。"實(shí)體癌癥樣 本"指腫瘤組織樣本。即使在癌性患者中，腫瘤位點(diǎn)的組織仍然包含非腫瘤健康組織。因 此，"癌癥樣本"應(yīng)當(dāng)限制為取自患者的腫瘤組織。所述"癌癥樣本"可以是活檢樣本或取自 手術(shù)切除治療的樣本。根據(jù)一方面，來(lái)自患者的樣本是癌細(xì)胞或癌組織。
[0075] 根據(jù)本發(fā)明的樣本可僅含有待定量種類的核酸，但其也可含有其它分子。在優(yōu)選 的實(shí)施方式中，所述樣本含有其它種類的核酸分子。根據(jù)這種實(shí)施方式，本發(fā)明還涉及用于 定量含有不同種類核酸分子的樣本中一個(gè)種類含有特異序列的核酸分子的方法，所述方法 包括以下步驟：
[0076] a)通過(guò)向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性；
[0077] b)提供與所述特異序列相對(duì)應(yīng)的單鏈核酸分子；
[0078] c)在所述單鏈核酸分子存在時(shí)，使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復(fù)性；
[0079] d)檢測(cè)在其中復(fù)性被阻斷的雙鏈核酸分子；以及
[0080] e)計(jì)數(shù)步驟d)的雙鏈核酸分子。
[0081] 如上所述，還可能使用與一個(gè)或更多個(gè)序列相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或更多個(gè)單鏈核酸分 子，從而允許確定特異指紋。在這種實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法基于定量顯示這種指紋的雙 鏈分子。因此，根據(jù)這種實(shí)施方式，本發(fā)明還涉及用于定量含有不同種類核酸分子的樣本中 含有一個(gè)或更多個(gè)特異序列的一個(gè)種類的核酸分子的方法，所述方法包括以下步驟：
[0082] a)通過(guò)向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性；
[0083] b)提供與所述一個(gè)或更多個(gè)序列相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或更多個(gè)單鏈核酸分子；
[0084] c)在所述單鏈核酸分子存在時(shí)使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復(fù)性；
[0085] d)檢測(cè)在其中復(fù)性被所述一個(gè)或更多個(gè)單鏈核酸分子所阻斷的雙鏈核酸分子； 以及
[0086] e)計(jì)數(shù)步驟d)的分子。
[0087] 優(yōu)選地，在步驟b)提供至少2種單鏈分子；更優(yōu)選地，至少3種；又更優(yōu)選地，至少 5種；甚至更優(yōu)選地，至少10種；最優(yōu)選地至少15種。
[0088] 因此，每當(dāng)需要定量核酸序列時(shí)可使用本發(fā)明。應(yīng)用包括體外診斷領(lǐng)域，包括臨床 診斷、分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究、高通量藥物篩選、獸醫(yī)診斷、農(nóng)業(yè)遺傳學(xué)測(cè)試、環(huán)境試驗(yàn)、食 品測(cè)試、工業(yè)過(guò)程監(jiān)測(cè)、生物安全、法醫(yī)和保險(xiǎn)領(lǐng)域測(cè)試。體外診斷和臨床診斷涉及分析由 身體提取的核酸樣本以便檢測(cè)疾病或病癥的存在、其發(fā)展階段和/或嚴(yán)重性、以及患者對(duì) 治療的反應(yīng)。在高通量藥物篩選和開(kāi)發(fā)中，將核酸類似地用于其它試劑，例如抗原、抗體、受 體等，以便分析在高樣本數(shù)量設(shè)置中生物系統(tǒng)在暴露至化合物文庫(kù)時(shí)的反應(yīng)，鑒定藥物先 導(dǎo)物。獸醫(yī)診斷和農(nóng)業(yè)遺傳學(xué)測(cè)試涉及來(lái)自非人類動(dòng)物或植物物品種的樣本，其類似體外 診斷，并提供農(nóng)業(yè)遺傳產(chǎn)品和加工過(guò)程的質(zhì)量控制方法。在環(huán)境測(cè)試中分析表明環(huán)境介質(zhì) 如土壤、水、空氣等污染的生物體及其毒素。食品測(cè)試包括定量生物體如細(xì)菌、真菌等作為 質(zhì)量控制的方法。在工業(yè)過(guò)程監(jiān)控中，檢測(cè)和/或定量核酸以便表示生產(chǎn)過(guò)程的合適控制 和/或如果過(guò)程失控則生成信號(hào)。在保險(xiǎn)測(cè)試中生物體和/或其毒素在篩選測(cè)試中鑒定以 確定客戶的風(fēng)險(xiǎn)類別或幫助審批候選人。已經(jīng)有核酸的檢測(cè)和/或定量的其它各種應(yīng)用， 并且正在不斷地開(kāi)發(fā)新應(yīng)用。
[0089] 這些應(yīng)用之一是基因表達(dá)的分析。許多用于分析基因表達(dá)的方法已經(jīng)描述在本領(lǐng) 域中。然而，最常用的方法，例如RT-PCR和DNA-微陣列使用昂貴的熒光核苷酸。此外，為 獲得所需的靈敏度必需進(jìn)行之前的PCR擴(kuò)增。通過(guò)比較，本發(fā)明提供不需擴(kuò)增或熒光核苷 酸的在單分子水平上測(cè)量基因表達(dá)的方法。
[0090] 因此，在第一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于測(cè)量樣本中基因表達(dá)的方法。"基因 表達(dá)"在本文中指所述基因的轉(zhuǎn)錄，即通過(guò)RNA聚合酶從基因 DNA模板合成信使RNA(mRNA) 分子；本文所用的"測(cè)量基因的表達(dá)"意為測(cè)量與所述基因相對(duì)應(yīng)的特異mRNA的量。
[0091] 因此，根據(jù)本實(shí)施方式，通過(guò)上述定量方法之一來(lái)測(cè)量與所述基因相對(duì)應(yīng)的所述 mRNA的量。
[0092] 對(duì)技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)，有利地在雙鏈核酸分子上進(jìn)行所述定量方法。優(yōu)選地， 在第一步驟中通過(guò)RNA轉(zhuǎn)錄物的復(fù)制來(lái)獲得雙鏈核酸分子。因此，根據(jù)本實(shí)施方式，本發(fā)明 提供用于測(cè)量在樣本中基因表達(dá)的方法，其包括以下步驟：
[0093] a)通過(guò)復(fù)制存在于樣本中的RNA分子來(lái)合成雙鏈核酸分子，以及
[0094] b)通過(guò)上述方法之一定量與所述基因相對(duì)應(yīng)的mRNA分子種類。
[0095] 已知一些酶，其使用單鏈RNA為模板以生成雙鏈核酸。例如，可通過(guò)RNA依賴性RNA 聚合酶的作用來(lái)獲得雙鏈RNA分子。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄物首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到逆轉(zhuǎn)錄具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如，其可以從已錨定到固體表面上的聚-T寡核 苷酸啟動(dòng)。此外，可以將所得的RNA/cDNA雜合體先用RNA酶處理，然后用DNA聚合酶處理， 從而導(dǎo)致RNA部分降解以及新的互補(bǔ)DNA鏈合成。有利地，發(fā)夾序列被連接在cDNA鏈的游 離端，并且發(fā)夾序列可以用作新DNA鏈合成的引物。
[0096] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于確定染色體異常的方法。"染色體異常"在本 文中指染色體的非典型數(shù)目或在一條或更多條染色體中的結(jié)構(gòu)異常。染色體的非典型數(shù)目 被稱為"非整倍體"：因而其是具有少于或多于正常染色體二倍體數(shù)目的病狀。當(dāng)個(gè)體從染 色體對(duì)中缺失一條色體（單倍體）或具有多于兩條染色體的染色體對(duì)時(shí)，發(fā)生非整倍體。 "三體"是非整倍體，其中有特定染色體的三個(gè)拷貝而不是正常的兩個(gè)拷貝。"染色體中結(jié)構(gòu) 異常"在本文中意為影響部分染色體拷貝數(shù)的事件，例如缺失、易位、重復(fù)、成環(huán)等。
[0097] 在細(xì)胞分裂期間當(dāng)全部或部分染色體沒(méi)有正確分離時(shí)，這樣的染色體異常發(fā)生。 例如，當(dāng)在腫瘤發(fā)生中癌性細(xì)胞進(jìn)展時(shí)，其積累染色體異常，例如缺失、易位，得到或失去整 條染色體。這些染色體異常被認(rèn)為是與癌性表型的獲得相關(guān)聯(lián)并且對(duì)每種癌癥類型特異。 癌癥越晚期則染色體異常的數(shù)目越多。因此，檢測(cè)這種染色體異常通常提供關(guān)于腫瘤侵襲 性和患者預(yù)后的很多信息。
[0098] 在本實(shí)施方式中，本發(fā)明因而提供用于檢測(cè)來(lái)自受試者的生物樣本中特定染色體 部分的異常分布的方法。更具體地，所述方法包括以下步驟：
[0099] a)通過(guò)上述方法之一來(lái)定量所述特定染色體部分的水平；
[0100] b)通過(guò)上述方法來(lái)定量另一染色體部分的水平；
[0101] c)計(jì)算在a)中獲得的水平與在b)中獲得的水平之間的比率；以及
[0102] d)確定所述特定染色體部分是否異常分布。
[0103] 如上所述，癌細(xì)胞在腫瘤發(fā)生的不同階段進(jìn)展時(shí)積累染色體異常。因此，染色體在 腫瘤細(xì)胞中異常分布的檢測(cè)是所述腫瘤侵襲性的指征：染色體部分異常分布得越多，則腫 瘤侵襲越強(qiáng)。
[0104] 根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，因此本發(fā)明的受試者是患癌癥的患者。在本實(shí)施方式中，本發(fā) 明提供用于在患癌癥患者的癌癥樣本中診斷癌癥侵襲性的方法，所述方法包括以下步驟：
[0105] a)定量在所述患者癌癥樣本中第一特定染色體部分的水平；
[0106] b)定量在所述患者癌癥樣本中第二染色體部分的水平；
[0107] c)計(jì)算在a)中獲得的水平與在b)中獲得的水平之間的比率；
[0108] d)確定所述特定染色體部分是否異常分布；以及
[0109] e)如果所述染色體部分是異常分布，則診斷為侵襲性。
[0110] 根據(jù)本發(fā)明的"染色體部分"指整個(gè)染色體或染色體的重要片段。例如，中度唐氏 綜合癥已與部分三體21q22. 2 - qter相關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明提供一種方法，其用于定量疑 似異常分布的染色體部分（步驟a)的染色體部分）并將此定量與參考染色體部分之一相 比較。因此，根據(jù)本發(fā)明的"參考染色體部分"是已知的非異常分布的染色體部分。在本發(fā) 明的本實(shí)施方式中，步驟b)的染色體部分為參考染色體部分。
[0111] 當(dāng)然，重要的是選擇用于定量步驟a)和b)的染色體部分的序列以使得所述序列 對(duì)于對(duì)應(yīng)的染色體部分是特異的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到需要的信息可獲自可公 開(kāi)獲得的序列數(shù)據(jù)庫(kù)，例如Genbank。
[0112] 通過(guò)稀有切點(diǎn)的限制性酶消化第一染色體從而方便地獲得雙鏈核酸分子的群。如 本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，稀有切點(diǎn)的限制性酶是在基因組中識(shí)別非常稀有地存在的序列的限 制性酶，例如識(shí)別序列含有7或8個(gè)堿基。這種罕見(jiàn)切點(diǎn)酶的實(shí)例包括Sfi I、Xma I、Asc I、AsiS 1(同裂酶 Sgf I)、Not 1(同裂酶 CciN I)、Sbf 1(同裂酶 Sse8387 I、Sda I)、Fse I、Pac I等。所有這些酶都是商業(yè)上可獲得的。在第二步驟中，將因此獲得的限制性片段 通過(guò)常見(jiàn)的6堿基限制性酶，如EcoRI、BamHI、Xhol等進(jìn)行消化。隨后，所得線性雙鏈片段 可以被轉(zhuǎn)化成發(fā)夾。已知允許雙鏈的游離端連接在一起的技術(shù)，并且一些將在下文中進(jìn)一 步詳述。
[0113] 胎兒非整倍體通常是在父母生殖細(xì)胞系中減數(shù)分裂期間染色體分離缺陷的結(jié)果。 雖然胎兒非整倍體不像其它影響1000出生者中9個(gè)的出生缺陷一樣常見(jiàn)，其檢測(cè)仍然提供 了相當(dāng)大的技術(shù)挑戰(zhàn)。
[0114] 母體血液中含有游離的母方DNA和游離的胎兒DNA，所述胎兒DNA作為 細(xì)胞死亡、剪切等的結(jié)果結(jié)束在血液中（Herzenberg等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:1453-1455, 1979 ;Bianchi 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3279-3283, 1990)。 已知無(wú)細(xì)胞的胎兒DNA僅代表母體血漿中存在的DNA的3-6 % (Lo等人，Am J Hum Genet, 62:768-775, 1998)。已描述了用于從母體血液診斷胎兒非整倍體的方 法；然而，這些方法需要遺傳材料的擴(kuò)增步驟或使用鳥(niǎo)槍法測(cè)序，其是使用基于之 前 PCR 富集的方法（Lo，BJ0G，116:152-157, 2009 疋&11等人，？1'〇(3.恥七1.六。&(1.5(^· USA，105(42):16266-16271，2008;Chiu 等人，BMJ, 342: c7401, 2011 doi :10.1136/bmj. c7401)，因此這些方法易受潛在偏見(jiàn)的影響。
[0115] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，因而所述受試者是孕婦。根據(jù)本實(shí)施方式，本發(fā)明提供 用于從所述孕婦的血液樣本中診斷胎兒非整倍體的方法，其包括：
[0116] a)定量在所述血液樣本中第一特定染色體部分的水平；
[0117] b)定量在所述血液樣本中第二染色體部分的水平；
[0118] c)計(jì)算在a)中獲得的水平與在b)中獲得的水平之間的比率；
[0119] d)確定所述特定染色體部分是否異常分布；以及
[0120] e)如果所述染色體部分是異常分布，則診斷為胎兒非整倍體。
[0121] 優(yōu)選地，所述特定染色體部分是疑似在胎兒中異常分布的染色體部分。有利地，第 二染色體部分是參考染色體部分，即不受異常分布影響的染色體部分；因此，所述第二染色 體部分優(yōu)選為在胎兒細(xì)胞中的二體。
[0122] 可通過(guò)本發(fā)明的方法來(lái)確定的優(yōu)選的胎兒染色體非整倍體和伴發(fā)疾病或病癥包 括：特納綜合癥（性染色體單體性）、克氏綜合癥（XXY性染色體）、三X綜合癥（XXX性染 色體）、唐氏綜合癥（21三體）、愛(ài)德華茲綜合癥（18三體）或帕陶（Patau)綜合癥（13 三體）。已知針對(duì)15染色體的單親二體癥（uniparenteral disomy)為普拉德-威利 (Prader-Willi)綜合癥。如果待檢測(cè)這樣的單親二體癥，則還必須以對(duì)其是否為母方或 父方遺傳加以區(qū)分的方式來(lái)分析DNA。本文所用的非平衡易位包括，優(yōu)選為非平衡的羅 伯遜三體rob (13q ;14q)。可通過(guò)本發(fā)明的方法優(yōu)選地確定的其它結(jié)構(gòu)畸變包括4q缺失 (Wolf-Hirschhorn (無(wú)對(duì)應(yīng)中譯文）綜合癥）、5q_缺失（貓叫（cri du chat)綜合癥）或 微缺失綜合癥，特別是17ql 1. 2缺失（史密斯-馬蓋尼斯（Smith-Magenis)綜合癥）或 22ql 1. 2缺失（狄喬治（DiGeorge)綜合癥）。
[0123] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟a)和b)中使用的序列是對(duì)胎兒DNA特異的序列。 例如，所述序列對(duì)應(yīng)于來(lái)自父親遺傳的等位基因。在另一個(gè)實(shí)施方式中，序列對(duì)胎兒和母方 DNA都不特異。然而，因?yàn)檠褐写嬖诘腄NA的10%是胎兒來(lái)源的，三體應(yīng)導(dǎo)致1.05的步 驟c)的比率。對(duì)應(yīng)每個(gè)染色體，需要大約100萬(wàn)個(gè)小珠探測(cè)（通過(guò)掃描樣本）平均2 X104 個(gè)序列，其中約2X103個(gè)是胎兒來(lái)源的。預(yù)計(jì)的統(tǒng)計(jì)（計(jì)算）誤差將是大約1%，其允許對(duì) 診斷而言足夠大的S/N。
[0124] 本發(fā)明方法的實(shí)現(xiàn)已成為可能，特別是通過(guò)設(shè)計(jì)用于在單分子水平探測(cè)實(shí)時(shí)核酸 相互作用的裝置的存在。這種裝置描述于，例如美國(guó)專利No. 7, 052, 650和No. 7, 244, 391。 其中描述的設(shè)備使用磁阱來(lái)向微米尺寸的超順磁性珠施加皮牛頓尺度的力。簡(jiǎn)要地說(shuō)，所 述設(shè)備包括光學(xué)顯微鏡、磁體和PC。雙鏈核酸分子的一端在多個(gè)點(diǎn)上被錨定至靜止元件，如 表面，并且另一端被錨定至可移動(dòng)的表面，在這種情況下所述可移動(dòng)的表面是磁珠。提供磁 體以便作用于珠。特別是，磁體可用于拉動(dòng)小珠離開(kāi)表面。然而，本發(fā)明方法的實(shí)施并不限 于上述設(shè)備。任何允許完全延伸然后重新折疊雙鏈核酸分子并在同一時(shí)間同時(shí)監(jiān)測(cè)所述分 子的延伸的裝置可用來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。例如，可使用光鑷（optical tweezer);然而它 們需要事先進(jìn)行力的校準(zhǔn)，并且不容易進(jìn)行并行化以便用于高通量測(cè)量。其它缺點(diǎn)是缺乏 核酸的總扭轉(zhuǎn)控制（total torsional control)以及可能的通過(guò)聚焦激光進(jìn)行的溶液局部 加熱，其可改變雜交條件。
[0125] 雙鏈核酸在充足小珠（例如，鏈霉親和素包被的小珠）的溶液中孵育數(shù)分鐘，雙鏈 核酸通過(guò)其標(biāo)記（例如生物素）端之一結(jié)合至小珠。如果之后使用光鑷進(jìn)行操作，那么小 珠可以是透明的，或者如果使用磁阱或鑷子進(jìn)行操作，那么小珠可以是磁性的。
[0126] 將組裝的小珠-核酸注射至流體室，其表面已被處理過(guò)，這樣以便結(jié)合分子的另 一標(biāo)記端（例如抗地高辛包被的表面結(jié)合至核酸的地高辛標(biāo)記端）。因此，小珠經(jīng)由核酸發(fā) 夾錨定至表面，參見(jiàn)圖la。然后，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種手段監(jiān)測(cè)小珠到表面的 距離：例如，其在相機(jī)圖像上的衍射環(huán)可用來(lái)推導(dǎo)其距離，或者當(dāng)以隱失模式（evanescent mode)照亮?xí)r它們散射（或通過(guò)熒光發(fā)射）的光強(qiáng)度可以用來(lái)測(cè)量其距離?；蛘?，（使用磁 傳感器，如GMR或Hall傳感器）可以測(cè)量它們所產(chǎn)生的磁場(chǎng)從而推導(dǎo)它們到錨定表面上的 傳感器的距離。
[0127] 為將牽拉將小珠錨定至表面的核酸分子，各種技術(shù)已被描述?？梢允褂镁劢辜?光束的光來(lái)捕獲（trap)靠近聚焦點(diǎn)的透明珠。通過(guò)相對(duì)于錨定表面的相對(duì)光束平移 (translation)，可以向栓系分子施加力（典型的光鑷實(shí)驗(yàn)）。施加的力與小珠從其平衡位 置的位移（displacement)成比例，為了對(duì)栓系分子施加恒定的力，需要捕獲束上的反饋環(huán) 路。
[0128] 為在小珠上施加恒定力，已描述使用通過(guò)環(huán)繞小珠的流動(dòng)所產(chǎn)生的流體動(dòng)力阻力 (hydrodynamic drag)，但它通常產(chǎn)生低的空間精確度（>100nm)。優(yōu)選的實(shí)施方式使用磁講 來(lái)拉動(dòng)通過(guò)如上所述的核酸發(fā)夾來(lái)錨定到表面上的超順磁性珠。在此構(gòu)型中，放置在樣本 之上的小磁體用于在錨定的小珠上施加恒定的力，其位置可以以〈lnm的精確度來(lái)確定（取 決于拉力和歸因于流體動(dòng)力阻力的損耗）。
[0129] 在每一個(gè)情況下，注意到可以通過(guò)用大于約16pN的力拉動(dòng)小珠來(lái)機(jī)械地完全打 開(kāi)栓系發(fā)夾。分子上的拉力降低至約llpN之下時(shí)允許發(fā)夾自發(fā)地重新拉上拉鏈（拉開(kāi)拉 鏈的轉(zhuǎn)換盡管滯后但是可逆的）。如果在打開(kāi)拉鏈階段期間，溶液中一些分子（例如蛋白 質(zhì)或DNA、RNA、LNA或PNA的互補(bǔ)寡核苷酸）已結(jié)合至伸展開(kāi)的單鏈核酸，當(dāng)力降低到llpN 之下時(shí)這些分子將阻斷重新拉上發(fā)夾。因此，分析原理是兩種力之間的切換：大者FiTff用于 打開(kāi)發(fā)夾以及較小者？_?用于允許重新拉上拉鏈以及測(cè)量在瞬時(shí)阻斷時(shí)分子的延伸。在完 全延伸和阻斷部分之間，阻斷位置和序列以線性關(guān)系相關(guān)聯(lián)。對(duì)于最佳的精確度，優(yōu)選地在 測(cè)試力測(cè)量完全延伸。這通過(guò)設(shè)計(jì)這樣的發(fā)夾環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)，即一旦力從F iTff降低到 ?，發(fā)夾環(huán)瞬間就重新折疊。
[0130] 可以使用本領(lǐng)域中已知的任一技術(shù)將核酸附至表面或支持物。實(shí)質(zhì)上，核酸直接 錨定至支持物如微珠，其涉及所述表面的官能化，例如通過(guò)使用鏈霉親和素、C00H基團(tuán)等對(duì) 所述表面進(jìn)行包被，以便能夠與核酸官能化的末端進(jìn)行作用。
[0131] 在一般情況下，這樣的方法必須官能化核酸，尤其在3'和5'端，也就是說(shuō)在其上 接枝合適的化學(xué)基團(tuán)。此外，優(yōu)選通過(guò)環(huán)連接分子的另兩個(gè)游離端以防止鏈在操作結(jié)束時(shí) 解離，從而如果適當(dāng)時(shí)可以重復(fù)后者。為了這個(gè)目的，可以采用不同的程序。
[0132] 最簡(jiǎn)單的是使用合成的寡核苷酸用兩個(gè)不同的官能團(tuán)（例如，生物素和胺）對(duì)雙 鏈核酸末端之一進(jìn)行官能化，其允許錨定到兩個(gè)不同的預(yù)處理表面。使用部分配對(duì)的合成 核苷酸可以使兩條鏈在其另一端被連接成環(huán)的形狀。以這種方式，從雙鏈核酸產(chǎn)生配對(duì)的 單鏈核酸，即發(fā)夾。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于它能夠官能化大核酸片段的異質(zhì)群（如通過(guò)基因 或染色體的片段化（fractionation)所獲得的），然后可以對(duì)其進(jìn)行同時(shí)分析。在這種情況 下，使用兩種（或更多）限制性酶將核酸樣本片段化，其使得能夠獲得在其端部具有兩種不 同的限制性位點(diǎn)的亞群這在所有片段中都是相似的。這使兩端能夠被差別處理（例如，通 過(guò)環(huán)的形式將在其端部具有適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)的一端連接到寡核苷酸）。這種方法的缺點(diǎn) 在于兩個(gè)相鄰官能團(tuán)之間的立體干擾，其可使得難以結(jié)合至表面。為了解決這個(gè)問(wèn)題，有利 地可在發(fā)夾分子每個(gè)游離端添加堿基的"間隔"序列，然后向堿基"間隔"序列的末端加入官 能團(tuán)；兩個(gè)間隔序列是非互補(bǔ)的，為每一個(gè)官能團(tuán)提供足夠的空間來(lái)結(jié)合至其專門(mén)的表面。 更有利的是，設(shè)計(jì)每一個(gè)間隔序列的序列以便在本發(fā)明的測(cè)序方法中使用已知序列的單鏈 測(cè)序引物?？梢杂梅肿由飳W(xué)中任何常用方法向雙鏈核酸分子添加環(huán)和/或間隔。這些方 法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，因此沒(méi)有必要在此詳述。
[0133] 至于實(shí)際的錨定技術(shù)，有許多這種技術(shù)并且它們?cè)醋杂糜趯⒋蠓肿樱ǖ鞍踪|(zhì)、DNA 等）錨定至的商業(yè)上可獲得的預(yù)處理表面的技術(shù)。大多數(shù)這些技術(shù)已被開(kāi)發(fā)用于免疫學(xué)測(cè) 試以及將蛋白（免疫球蛋白）連接至表面，所述表面攜帶能夠與蛋白羧基（-COOH)或氨基 (-NH2)端反應(yīng)的基團(tuán)（-COOH、-NH 2、-0H 等）。
[0134] 可以通過(guò)分子5'端的游離磷酸直接完成核酸的共價(jià)錨定，其中游離磷酸與仲胺 (由斯特拉斯堡的Polylabo銷售的Covalink-NH表面）反應(yīng)形成共價(jià)鍵。也可以用氨基將 DNA官能化，然后如同處理蛋白質(zhì)一樣進(jìn)行處理。
[0135] 也有鏈霉親和素包被的表面（Dynal小珠等），其許可鏈霉親和素和生物素化DNA 分子之間的準(zhǔn)共價(jià)錨定。最后，通過(guò)將直接針對(duì)地高辛的抗體接枝到表面上（通過(guò)上面提 到的方法），用地高辛官能化的核酸可以錨定于此表面。這僅僅代表許多可能的錨定技術(shù)中 的一個(gè)示例。
[0136] 在附著與錨定技術(shù)當(dāng)中還應(yīng)該提到的是，例如在專利EP 152 886所描述的技術(shù)， 其使用酶偶聯(lián)用于將DNA附著到固體支持物如纖維素上。
[0137] 專利EP 146 815也描述了各種將DNA附著到支持物上的方法。
[0138] 相似地，專利申請(qǐng)W0 92/16659建議使用聚合物來(lái)附著DNA的方法。
[0139] 當(dāng)然，核酸可以直接附著至支持物，但必要時(shí)，特別是考慮到限制表面的影響時(shí)， 核酸可以附著至肽或其他性質(zhì)的惰性臂的末端，例如在歐洲專利EP 329 198中描述的。
[0140] 下面的實(shí)施例將帶出本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0141] 圖1 :檢測(cè)在重新雜交期間寡核苷酸誘導(dǎo)的阻斷。（a)具有在莖上預(yù)先安置的靶的 發(fā)夾構(gòu)建設(shè)計(jì)。（b)在83 bp發(fā)夾上兩個(gè)寡核苷酸（SEQ ID NO. 1:5'-ACAGCCAGC-3'、SEQ ID N0.2:5'-ATGACAATCAG-3'）雜交引發(fā)的障礙實(shí)例（參見(jiàn)方法）。左側(cè)（panel):在F打開(kāi) =17. 8pN(橙色）和F#w= 11. 4pN(藍(lán)色；參見(jiàn)在頂部的力軌跡）記錄的實(shí)驗(yàn)軌跡。觀察 到五個(gè)不同延伸水平從上到下對(duì)應(yīng)于：（i)在FiTff處打開(kāi)的發(fā)夾、（ii )在打開(kāi)的 發(fā)夾、（iii)被第一寡核苷酸阻斷的部分退火的發(fā)夾、（iv )被第二寡核苷酸阻斷的部分退 火的發(fā)夾和（v)折疊的發(fā)夾。黑色曲線對(duì)應(yīng)于平均1秒的原始數(shù)據(jù)。右側(cè)（panel):阻斷 (ii)-(iv)的直方圖。黑色曲線代表在F測(cè)試處重新雜交時(shí)在發(fā)夾的給定延伸中每個(gè)循環(huán) 的阻斷數(shù)的直方圖；其中在堿基對(duì)上的Λ Z = 獲自在單一發(fā)夾上?23個(gè)力循 環(huán)。數(shù)據(jù)的高斯擬合（Gaussian fits)顯示為紅色。這些擬合的方差（〇?lnm)定義設(shè)備 的分辨率。在發(fā)夾上的39. 60bp和28. 66bp處觀察到阻礙ZPM1和Z_2，這與40bp和29bp 處的預(yù)期位置（以綠色顯示）很好地吻合。
[0142] 圖2 :通過(guò)雜交的序列鑒定。通過(guò)2種不同寡核苷酸（標(biāo)記為寡核苷酸1和2)鑒 定3種不同發(fā)夾（標(biāo)記為分子1、2、3)(參見(jiàn)方法）。左側(cè)：在發(fā)夾打開(kāi)-閉合循環(huán)過(guò)程中記 錄的實(shí)驗(yàn)軌跡。為顯示對(duì)應(yīng)的阻斷，將寡核苷酸1和2相繼加入溶液中：寡核苷酸1雜交在 分子2和3上，而寡核苷酸2雜交在分子1和2上。右側(cè)：寡核苷酸1 (桔色）和2 (藍(lán)色） 在每個(gè)分子上阻斷的直方圖，所述分子的完全延伸是灰色陰影。
[0143] 圖3 :照相機(jī)視野顯示許多小珠通過(guò)單發(fā)夾附著至玻璃表面。通過(guò)使用來(lái)自亮紅 LED的平行照明經(jīng)由顯微鏡可看到這些。圍繞小珠的小衍射環(huán)用來(lái)測(cè)量其垂直位置。
[0144] 圖4 :顯示發(fā)夾設(shè)計(jì)的方案。
[0145] 圖5 :用于從mRNA生成cDNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的方案。 實(shí)施例
[0146] 方法
[0147] DNA發(fā)夾構(gòu)建
[0148] 如圖4所示，通過(guò)連接3個(gè)分離的合成寡核苷酸（Eurogentec and Integrated DNA科技）來(lái)構(gòu)建短DNA發(fā)夾（在圖1和圖2中83bp，或在圖2中179bp)。在第一步，通 過(guò)加熱至95°C持續(xù)5分鐘，然后快速冷卻至80°C，接著每10秒緩慢降低0. 7°C直至4°C， 使得在dH20中的寡核苷酸（oligo)A-l(SEQIDN0·3:5'-生物素 -TTTTTTTTTTTTTTT τττ τττ τττ TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTTTT TTG GAT TCG CGG GTC TCT-3'）和寡核 苷酸 A-2(SEQ ID N0.4:5'-AAC CGT CCT TTA CTT GTC ATG CGC TCT AAT CTC TGG GCA TCT GGC TAT GAT GTT GAT GGA ACT GAC CAA ACG TCG GTG GG-3'）退火至互補(bǔ)的寡核苷 酸 A-3 (SEQ ID NO. 5:5' -磷酸化 AGG AAG AGA CCC GCG AAT CCC CCA CCG ACG TTT GGT CAG TT-3'）。使用NucleoSpin Extract II試劑盒（Clontech)來(lái)清洗這些退火產(chǎn)物，即標(biāo) 記的部分A。對(duì)于對(duì)應(yīng)于83 bp發(fā)夾的中間部分的寡核苷酸B-l (SEQ ID NO. 6:5'-磷酸化 的-TCC TGA TTG TCA TCG GCT GGC TGT TCG GTT AGT TTC GAA GAC TT-3'）和寡核苷酸 B-2(SEQIDN0·7:5'-磷酸化的-GCGMAGTCTTCGMACTAACCGAACAGCCAGCCGATGA CAA TC-3'），或者對(duì)應(yīng)于179 bp發(fā)夾的中間部分的寡核苷酸B'-l (SEQ ID NO. 8:5'-磷酸化 的-TCC TCG TGC GTG AGC GAG CGC GGT CGG TCG GTC GGT AGC GAG CGC GTG CGT GCG TGC GTG GGC TGG CTG GCT GGC TCG GTC GGT CGT GCG TGC GGT CGG TGG CTG GCT AGC GAG CGA GCG AGC GGG CTG GCT GAA GAC TT-3'）和寡核苷酸 B'-2 (SEQ ID NO. 9:5'-磷酸化的-GCG AAA GTC TTC AGC CAG CCC GCT CGC TCG CTC GCT AGC CAG CCA CCG ACC GCA CGC ACG ACC GAC CGA GCC AGC CAG CCA GCC CAC GCA CGC ACG CAC GCG CTC GCT ACC GAC CGA CCG ACC GCG CTC GCT CAC GCA CG-3'），重復(fù)退火和清洗步驟。這些退火產(chǎn)物是標(biāo)記的部分B或B'或 B〃。通過(guò)在25°C中在1XT4連接酶反應(yīng)緩沖液中使用T4連接酶（5υ/μ I，F(xiàn)ermentas)持 續(xù)1.5小時(shí)，我們將部分A、部分B(或部分B'、B〃）連接至寡核苷酸C (SEQ ID NO. 10:5'-磷 酸化的-TCG CGC CTG ATC GTC CAC TTT TTT TTT AGT GGA CGA TCA GGC-3'），其是發(fā)夾的 環(huán)，然后通過(guò)加熱至65°C持續(xù)20分鐘來(lái)停止反應(yīng)。使用NucleoSpin Extract II試劑盒來(lái) 清洗連接混合物。最后，在具有ImM地高辛-dUTP(R〇che)的1XNEB2緩沖液中使用克列諾 酶（Klenow) (3 - 5'外切）（New England Biolabs)在37°C持續(xù)15分鐘進(jìn)行填充反應(yīng)，由 此加入地高辛標(biāo)記，然后通過(guò)加熱至75°C持續(xù)20分鐘來(lái)停止反應(yīng)。再次使用NucleoSpin Extract II試劑盒來(lái)清洗發(fā)夾產(chǎn)物。
[0149] 對(duì)1241bp發(fā)夾（圖2)的制備方法描述在Manosas等人（似1:.〇16111· Biol.5:904-912, 2009)〇
[0150] 單分子分析
[0151] 在一端用地高辛標(biāo)記、而在另一端用生物素標(biāo)記的構(gòu)建發(fā)夾被附著至顯微鏡流體 室的玻璃表面，所述玻璃表面預(yù)先使用抗-地高辛進(jìn)行包被并使用牛血清白蛋白（BSA)進(jìn) 行鈍化，所述構(gòu)建的發(fā)夾還吸附至使用鏈霉親和素 （DYNAL MyOne)包被的Ιμπι超順磁性 珠。小磁體用于拉動(dòng)附著在小珠上的單一 DNA分子。使用CCD照相機(jī)在31Hz獲得分子延 伸Z(t)。平均經(jīng)過(guò)1秒的原始數(shù)據(jù)，達(dá)到?lnm的分辨率，同時(shí)伸展力F以10%的精確度 測(cè)量。數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，我們從垂直位置軌跡Z(t)減去粘至表面的參考小珠的垂直位置 (Zref)，這有利于減少設(shè)置漂移。對(duì)于每一個(gè)打開(kāi)/關(guān)閉循環(huán)，我們采用的高 斯擬合的中心作為關(guān)閉發(fā)夾的參考位置（延伸Onm)。類似的高斯擬合用于確定 在一個(gè)Z打開(kāi)（F測(cè)試）和Z阻斷（F測(cè)試）循環(huán)的平均位置。誤差線代表s. e. m。
[0152] 對(duì)于圖2中的雜交鑒定，分子1是1214bp發(fā)夾，分子2是83bp發(fā)夾，以及分子3 是179bp發(fā)夾，而寡核苷酸1是SEQ ID NO. 11:5' -GAAGAGACCC-3'和寡核苷酸2是SEQ ID NO. 12:5'-CAGCCGATGAC-3'。
[0153] 結(jié)果
[0154] 檢測(cè)在發(fā)夾重新拉上拉鏈的途徑中的障礙
[0155] 在目前的方法中，DNA發(fā)夾在一端通過(guò)地高辛（Dig)-抗-地高辛鍵附著至蓋玻片， 在另一端通過(guò)生物素-鏈霉親和素鍵附著至磁性珠?？梢砸愿鞣N方式來(lái)生成所述DNA發(fā)夾。 例如，通過(guò)將基因組DNA片段在其一端連接至DNA環(huán)并在其另一端連接至使用生物素和地 高辛標(biāo)記的DNA叉結(jié)構(gòu)（圖la)。或者，可從在聚-T包被的小珠上俘獲mRNA并反轉(zhuǎn)錄后獲 得的cDNA來(lái)生成這種發(fā)夾（圖5)。
[0156] 樣本附近的小磁體用于對(duì)栓系小珠施加垂直力。小珠至表面的距離（即， 發(fā)夾的端至端的距離）可以從小珠的圖像實(shí)時(shí)推導(dǎo)出（Gosse&Croquette, Biop ys. J. , 82:3314-3329, 2002) 〇 或者，可以使用漸逝場(chǎng)照明（evanescent field illumination)從經(jīng)由小珠分散的光強(qiáng)度來(lái)推斷出小珠至表面的距離。雖然設(shè) 置類似于使用光鑷進(jìn)行的DNA拉開(kāi)拉鏈實(shí)驗(yàn)（Brower-Toland等人，？1"〇〇.似1:1· Acad. Sci. USA，99:1960-1965, 2002)，使用磁阱通過(guò)在許多分子同時(shí)應(yīng)用相同 力允許高度并行（Gosse&Croquette, Biophys.J·，82:3314-3329, 2002 ;Strick 等，Science, 271:1835-1837, 1996)。
[0157] 我們調(diào)節(jié)力來(lái)周期性地打開(kāi)和關(guān)閉在溶液中的DNA發(fā)夾（Essevaz-Roulet等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11935-11940, 1997)，溶液含有互補(bǔ)于部分發(fā)夾的寡核苷 酸。在圖lb中，通過(guò)施加力FiTff (>15pN)來(lái)周期性地展開(kāi)83bp發(fā)夾，以及通過(guò)減少力至F (?10pN)來(lái)重新拉合上發(fā)夾。在展開(kāi)或打開(kāi)狀態(tài)，在溶液中的兩種不同的寡核苷酸可 以雜交至在發(fā)夾上的其各自的互補(bǔ)序列。其瞬時(shí)阻斷在低力下的發(fā)夾的重新折疊，這很容 易觀察到，因?yàn)樵诎l(fā)夾的延伸中在其重新折疊的時(shí)間過(guò)程中的兩次暫停。
[0158] 這種測(cè)量方案提供兩件有價(jià)值的信息：沿發(fā)夾阻斷的位置和存在期。一個(gè)堿基對(duì) 的打開(kāi)導(dǎo)致在發(fā)夾延伸上約〇. 85納米的改變。我們的設(shè)備目前具有的分辨率（?lnm)，我 們可因此記錄具有約一個(gè)核苷酸精確度的阻斷位置。應(yīng)注意發(fā)夾的打開(kāi)和關(guān)閉狀態(tài)之間的 切換提供對(duì)慢實(shí)驗(yàn)漂移不敏感的差分延展測(cè)量。此外，只要所施加力保持恒定，所施加力的 精確值不是非常重要的。
[0159] 關(guān)于阻斷的存在期，其涉及到雜合體的穩(wěn)定性，我們發(fā)現(xiàn)其取決于應(yīng)用的拉力、互 補(bǔ)寡核苷酸的尺寸以及在寡核苷酸和發(fā)夾之間的錯(cuò)配的存在與定位（數(shù)據(jù)未示出）。
[0160] 通過(guò)雜交指紋或單循環(huán)連接進(jìn)行的序列鑒定
[0161] 在給定樣本中對(duì)所期望的DNA的鑒定是在許多情況下的相關(guān)問(wèn)題，例如檢測(cè)基因 突變、基因復(fù)制、mRNA表達(dá)模式等。這種鑒定問(wèn)題使用本方案非常容易。其需要在DNA發(fā) 夾樣本上檢測(cè)使用一組選擇的短（?lOnt)寡核苷酸獲得的給定的雜交指紋。這可以通過(guò) 在存在一個(gè)或幾個(gè)探針寡核苷酸時(shí)在發(fā)夾的重新雜交期間對(duì)阻斷進(jìn)行測(cè)試來(lái)實(shí)現(xiàn)。如圖 2所示，可通過(guò)兩種不同寡核苷酸的雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)三種不同DNA序列的鑒定。應(yīng)當(dāng)注意到因 為我們可以檢測(cè)雜合體的確切位置，沒(méi)有必要如通常所做的按順序測(cè)試每個(gè)探針。人們可 以鑒定幾個(gè)選擇的探針沿發(fā)夾的阻斷位置，并使用這種雜交模式，而不是僅僅鑒定作為DNA 序列指紋的雜交存在。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于定量樣本中含有特異核酸序列的一個(gè)種類的雙鏈核酸分子的方法，所述方 法包括以下步驟： a) 通過(guò)向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性； b) 提供與所述序列相對(duì)應(yīng)的單鏈核酸分子； c) 在所述單鏈核酸分子存在時(shí)使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復(fù)性； d) 檢測(cè)在其中復(fù)性被阻斷的雙鏈核酸分子；以及 e) 計(jì)數(shù)步驟d)的雙鏈核酸分子。
2. -種用于定量樣本中含有一個(gè)或更多個(gè)特異序列的一個(gè)種類的雙鏈核酸分子的方 法，所述方法包括以下步驟： a) 通過(guò)向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性； b) 提供與所述一個(gè)或更多個(gè)序列相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或更多個(gè)單鏈核酸分子； c) 在所述單鏈核酸分子存在時(shí)使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復(fù)性；以及 d) 檢測(cè)在其中復(fù)性被所述一個(gè)或更多個(gè)單鏈核酸分子所阻斷的雙鏈核酸分子；以及 e) 計(jì)數(shù)步驟d)的雙鏈核酸分子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述雙鏈核酸分子是發(fā)夾。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中雙鏈核酸的一條鏈的至少一個(gè)堿基 直接或間接地附著至表面，并且其中雙鏈核酸的另一條鏈的至少一個(gè)堿基附著至可移動(dòng)的 表面。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟a)中通過(guò)移開(kāi)支持物使雙鏈 核酸變性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中通過(guò)移開(kāi)支持物向雙鏈分子施加物理力，所述物 理力高于或等于15pN，優(yōu)選地高于或等于17pN，更優(yōu)選地高于或等于18pN。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟c)中通過(guò)將支持物合在一起 使變性雙鏈核酸復(fù)性。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中通過(guò)使支持物合在一起將施加至雙鏈分子的力降 低至小于或等于12pN，優(yōu)選地小于或等于llpN，更優(yōu)選地小于或等于ΙΟρΝ。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中雙鏈核酸未附著至支持物的末端彼 此共價(jià)或非共價(jià)地連接。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中重復(fù)步驟a)至d)若干次（以便積 累測(cè)量并提高信號(hào)/噪音比率）。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟d)的檢測(cè)包括測(cè)量附著至支 持物的雙鏈核酸分子的兩末端之間的距離（z)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，當(dāng)所述雙鏈核酸分子變性時(shí)，所述方法包括測(cè)量附 著至支持物的雙鏈核酸分子的兩末端之間的距離（z s)的進(jìn)一步的步驟。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟： a) 比較z和z ^，以及 b) 確定阻斷的位置。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其包括測(cè)量阻斷的持續(xù)時(shí)間的進(jìn)一步 的步驟。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其包括將阻斷的持續(xù)時(shí)間與參考值進(jìn)行比較的進(jìn)一 步的步驟。
16. -種用于測(cè)量樣本中基因表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟： a) 通過(guò)復(fù)制在樣本中存在的RNA分子來(lái)合成雙鏈核酸分子，以及 b) 通過(guò)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法來(lái)定量與所述基因相對(duì)應(yīng)的mRNA分子種 類。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述雙鏈核酸分子通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16或17中任一項(xiàng)所述的方法，其中從錨定至固體表面的聚T寡核苷 酸起始反轉(zhuǎn)錄。
19. 一種用于在來(lái)自受試者的生物樣本中檢測(cè)特定染色體部分的異常分布的方法，所 述方法包括以下步驟： a) 通過(guò)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法來(lái)定量所述特定染色體部分的水平； b) 通過(guò)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法來(lái)定量其他染色體部分的水平； c) 計(jì)算在a)中獲得的水平與在b)中獲得的水平之間的比率；以及 d) 確定所述特定染色體部分是否異常分布。
20. -種用于在患癌癥患者的癌癥樣本中診斷癌癥侵襲性的方法，所述方法包括以下 步驟： a) 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法來(lái)確定所述特定染色體部分是否在所述患者的癌癥樣 本中異常分布；以及 b) 如果所述染色體部分是異常分布，則診斷為侵襲性。
21. -種用于從所述孕婦的血液樣本中診斷胎兒非整倍體的方法，所述方法包括： a) 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法來(lái)確定特定染色體部分是否在所述血液樣本中異常分 布；以及 b) 如果所述染色體部分是異常分布，則診斷為胎兒非整倍體。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104254617SQ201280070163
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月22日
【發(fā)明者】D·本西蒙, J-F·阿萊曼德, F-Y·丁, V·克羅凱特 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)研究中心, 巴黎高等師范學(xué)院, 皮埃爾和瑪利居里大學(xué)(巴黎第六大學(xué))