功能化碳納米管在腫瘤上的靶向自組裝的制作方法
【專利摘要】本文提供用于將分子原位遞送至細胞的方法和用于經(jīng)由原位遞送治療癌癥的方法。所述方法包括使細胞接觸或向細胞施用作為兩個單獨組分的包含靶向部分的嗎啉代寡核苷酸，隨后是包含與第一嗎啉代寡核苷酸互補的第二嗎啉代寡核苷酸的單壁納米管構(gòu)建體和連接至所述單壁納米管構(gòu)建體的治療或診斷有效負載分子中的一種或兩者。在單壁納米管復合物在細胞處經(jīng)由所述第一嗎啉代和第二互補嗎啉代寡核苷酸雜交而自組裝后，所述有效負載分子被遞送。還提供兩組分自組裝單壁納米管系統(tǒng)和包含第二組分的單壁納米管構(gòu)建體。
【專利說明】功能化碳納米管在腫瘤上的靶向自組裝
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 此國際申請要求在35U.S.C. § 119(e)下的臨時申請美國序號61/581，228的優(yōu)先 權(quán)的益處，所述申請整體通過引用結(jié)合于此。
[0003] 聯(lián)邦出咨說明
[0004] 本發(fā)明利用在由美國國立衛(wèi)生研究院獎勵的資助金POl CA33049、ROl CA55349、 R21 CA128406和GM07739和由美國能源部獎勵的資助金DE-SC0002456下的政府支持形成。 政府具有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 發(fā)明領(lǐng)域
[0007] 本發(fā)明總體上涉及納米醫(yī)藥、癌癥治療和腫瘤靶向的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及 被功能化以將分子原位遞送至細胞，例如癌細胞的自組裝單壁納米管復合物。
[0008] 相關(guān)摶術(shù)描沭
[0009] 快速擴展的納米醫(yī)藥領(lǐng)域已經(jīng)開始在第一代改造藥物納米粒子方面取得臨床成 功（1-2)。納米醫(yī)藥涉及目標在于利用材料的尺寸、形狀和電荷來改善藥物遞送或效率的合 成納米量級粒子的用途。另外，一些納米材料的內(nèi)在性質(zhì)導致獨特的物化性質(zhì)。碳納米管 在生物醫(yī)藥研究中已看到更寬的應用（3)，部分因為附加一組不同的配體的潛力，包括小分 子（4)、肽（5-6)、寡核苷酸（7)、放射性同位素（8)、單克隆抗體（9-10)和其他靶向部分。
[0010] 碳納米管的藥代動力學和藥效學看起來高度依賴于用來使它們成為水可分散和 生物相容的化學方法（11-12)。功能化和分散賦予水性環(huán)境中的穩(wěn)定性并減輕潛在的毒性 作用（13)。共價功能化的單壁化碳納米管的允許其用作藥物載體的一個重要特征是它們經(jīng) 由縱向腎小球濾過的快速腎清除率，不管明顯的大分子量（14-16)。這種清除現(xiàn)象已稱為纖 維狀藥理學并且直接與球狀蛋白質(zhì)的藥代動力學分布對比。
[0011] 典型地，在惡性腫瘤的系統(tǒng)靶向中，藥物遞送載體如mAb或納米粒子附加有細胞 毒性效應物如"單步驟"過程中的化學治療小分子或放射性同位素。然而，體內(nèi)效應物分子， 特別是那些未結(jié)合或過量的效應物分子延長的半衰期，將增大毒性。相反，試劑的短循環(huán)時 間有問題，因為它減少其中在血流中維持足夠濃度以驅(qū)使腫瘤滲透和細胞結(jié)合的時間。
[0012] 兩步驟靶向或預先靶向?qū)⑤d體的所需、緩慢、無毒的腫瘤靶向過程與細胞毒性劑 的必要快速清除率分開以實現(xiàn)所需的藥代動力學目標（17)。在此方法中，首先施用長時間 循環(huán)的腫瘤選擇性試劑，如單克隆抗體，并允許足夠的循環(huán)時間，典型地2-5天，以在腫瘤 處積累并使血流干凈。這隨后是快速清除（即，半衰期為<l〇min)與初始試劑具有高親和 性相互作用的第二步驟試劑（裝配有細胞毒性或診斷效應物）。這種相互作用可以涉及鏈 霉親和素-生物素（18)、雙特異性抗體-半抗原（19)、寡核苷酸雜交（20)，或，最近，共價 '點擊（click)'化學（21)。第二試劑與初始試劑快速平衡，同時還使血流干凈。這種方法 允許提高的腫瘤中細胞毒性或成像劑與血液中那些的比例以及濃度對時間的相應'曲線下 面積'，以及在其他現(xiàn)場組織中。預先靶向方法在之前已被開發(fā)（22-24)，但是不包括遞送大 的有效負載并快速清除，增強治療指數(shù)的第二步驟試劑。
[0013] 由于在這樣的策略中的第二步驟需要快速清除率，所以這種試劑幾乎總是小分子 如改性生物素，或者單獨的短寡核苷酸。然而，小分子限制效力和敏感性，因為它們通常分 別被治療或成像劑單取代。作為第二步驟，高度多價效應物應允許信號擴增，如毒素或診斷 核素、多功能性，以及改善的結(jié)合親和性（25-26)。然而，作為第二步驟，這樣的多價構(gòu)建體 經(jīng)常太大而不允許避免毒性所必需的快速清除時間。因此，共價改性的單壁化碳納米管可 以提供作為高度多價且多功能同時保持其快速清除的獨特優(yōu)勢。
[0014] 因此，本領(lǐng)域?qū)τ谑褂脝伪诩{米管構(gòu)建體的診斷和/或治療分子或化合物的多步 驟遞送的改進方法存在公認的需要?，F(xiàn)有技術(shù)在缺少這樣的自組裝單壁納米管系統(tǒng)方面是 匱乏的，該自組裝單壁納米管系統(tǒng)經(jīng)由兩步細胞靶向方法有效遞送診斷和/或治療化合物 同時在細胞靶向期間沒有延長暴露于細胞毒性試劑。本發(fā)明滿足本領(lǐng)域這種長期的需求和 期望。
[0015] 發(fā)明概述
[0016] 本發(fā)明涉及一種將分子原位遞送至目的細胞的方法。所述方法包括使所述細胞接 觸連接至對所述細胞具有選擇性的靶向部分的嗎啉代寡核苷酸并使經(jīng)由所述靶向部分連 接至目的細胞的所述嗎啉代寡核苷酸接觸可溶性單壁納米管構(gòu)建體，所述可溶性單壁納米 管構(gòu)建體具有與所述連接靶向部分的嗎啉代寡核苷酸互補的多個嗎啉代寡核苷酸和獨立 地連接至所述SWNT的多個分子，所述分子包含可遞送的有效負載。所述嗎啉代寡核苷酸與 所述互補的嗎啉代寡核苷酸雜交以在所述細胞處形成自組裝的可溶性的單壁納米管復合 物，其中在雜交后，所述有效負載分子被原位遞送至所述細胞。
[0017] 本發(fā)明還涉及一種用于診斷受試者中的癌癥的方法。所述方法包括向所述受試 者順序地施用自組裝單壁納米管復合物的第一組分及其第二組分，所述一組分具有靶向部 分，所述靶向部分對于與癌癥相關(guān)的細胞具有選擇性并且綴合至嗎啉代寡核苷酸，所述第 二組分包含單壁納米管構(gòu)建體，所述單壁納米管構(gòu)建體具有多個互補的嗎啉代寡核苷酸和 獨立地與其綴合的多個診斷有效負載分子。在所述復合物的第一和第二組分在所述癌癥相 關(guān)細胞處自組裝后在所述受試者中檢測所述診斷有效負載分子，從而診斷所述癌癥。
[0018] 本發(fā)明還涉及一種治療受試者中的癌癥的方法。所述方法包括向所述受試者順序 地施用用獨立地連接至嗎啉代寡核苷酸的靶向部分和一種或多種治療有效負載分子功能 化的自組裝的SWNT復合物的第一組分和第二組分。所述第一和第二組分在由所述靶向部 分靶向的與所述癌癥相關(guān)的細胞上自組裝，從而將所述治療有效負載遞送至所述細胞以治 療所述癌癥。
[0019] 本發(fā)明還涉及自組裝單壁納米管（SWNT)系統(tǒng)。所述自組裝SWNT系統(tǒng)是具有兩個 組分的系統(tǒng)。第一組分具有連接至單克隆抗體的嗎啉代寡核苷酸。第二組分具有多個互 補的嗎啉代寡核苷酸和各自獨立地連接至所述SWNT的多個診斷或治療分子中的一個或兩 者。
[0020] 本發(fā)明還仍然涉及單壁納米管構(gòu)建體。所述單壁納米管構(gòu)建體包含共價連接至單 壁納米管的多個雙功能螯合劑、螯合至各個雙功能螯合劑的放射性核素和綴合至所述單壁 納米管的多個嗎啉代寡核苷酸。
[0021] 本發(fā)明的其他和進一步方面、特征和優(yōu)點根據(jù)以下本發(fā)明目前優(yōu)選的實施方案的 描述將是明顯。給出這些實施方案用于充分公開的目的。
[0022] 附圖簡述
[0023] 為了使其中將變得明顯的本發(fā)明的上述特征、優(yōu)點和目的，以及其他方面的事情 達成并且可以詳細理解，在附圖中示出了以上簡短概述的本發(fā)明的更具體描述和某些實施 方案。這些附圖形成本說明書的一部分。然而，應注意，附圖舉例說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方 案并因此不認為是限制本發(fā)明的范圍。
[0024] 圖1A-1D示出了自組裝SWNT-cMORF構(gòu)建體的設(shè)計和HPLC表征。圖1A-1B顯示 SWNT-NH2化學功能化以產(chǎn)生放射性和熒光標記的SWNT-cMORF綴合物的合成方案。圖IC是 追蹤洗脫的材料隨時間的譜的化合物3 (SWNT-cM0RF-NH2)的3D凝膠滲透HPLC色譜。僅單 個峰是明顯的并且該譜與用二芳基腙（bis-aryl hydrazone)基團改性的單壁化碳納米管 一致（肩部在λ =?354nm)并且通過600nm吸收降低，其是所有納米管的品質(zhì)。圖ID是 在mAb-MORF靶向的腫瘤細胞上的SWNT-cMORF自組裝的圖示（不成比例）。三角形是腫瘤 抗原；點是附加的細胞毒性或診斷部分。
[0025] 圖2A-2E示出了 SWNT-cMORF在體外并且在血清存在下與多個mAb-MORF雜交。圖 2A顯示單獨的SWNT-cMORF (右側(cè)峰）、單獨的抗-⑶20-M0RF (中間峰）和與抗-⑶20-M0RF 混合的SWNT-cMORF(左側(cè)峰）的尺寸排阻HPLC。此色譜證實當SWNT-cMORF和mAb-MORF 組合時保留時間位移，表明形成了大的、多聚體的mAb-SWNT復合物。圖2B顯示當組合 SWNT-CMORF-111In(DOTA)與抗-CD20-M0RF并追蹤與單獨的SWNT-cMORF(實線）或當與所 述抗體混合時的SWNT-cMORF(虛線）相關(guān)的放射標記時，獲得類似結(jié)果。圖2C顯示在與 抗-A33-M0RF抗體混合的SWNT-cM0RF」 nIn(D0TA)情況下觀察到類似的峰位移模式，證實 復合物形成與抗體身份無關(guān)。圖2D顯示當在100%血清存在下混合兩個組分時仍然發(fā)生復 合物形成（虛線）并且這可以在將過量的游離cMORF添加到混合物中時被阻斷（實線）。 圖2E顯示僅在添加互補的mAb-MORF時SWNT-CMORF- 111In (DOTA)可以由蛋白質(zhì)A小珠俘獲。 雜交的效率不受血清影響，并且可以通過添加過量的游離cMORF阻斷。
[0026] 圖3A-3E示出了在用mAb-MORF預先靶向的腫瘤細胞上SWNT-cMORF的自組裝是高 度特異的和高度親和的。圖3A顯示在HL60細胞上SWNT-CM0RF-AF647的結(jié)合的流式細胞 測定的量化。預處理利用HL60特異性抗-⑶33-M0RF，同種型對照抗-⑶20-M0RF，或特異 性抗-⑶33-M0RF+用過量的游離cMORF阻斷。數(shù)據(jù)表示為中值熒光的變化。圖3B顯示在 DAUDI細胞上SWNT-CM0RF-AF647的結(jié)合的流式細胞測定的量化。預處理利用DAUDI特異性 抗-CD20-M0RF，同種型對照抗-CD33-M0RF，或特異性抗-CD20-M0RF+用過量的游離cMORF 阻斷。圖3C顯示在LS174T細胞上SWNT-CM0RF-AF647的結(jié)合的流式細胞測定的量化。預 處理利用LS174T特異性抗-A33-M0RF，同種型對照抗-CD33-M0RF，或特異性抗-A33-M0RF+ 用過量的游離cMORF阻斷。圖3D顯示在未處理的（紅色）、同種型對照預先靶向的（黑 色）、特異性預先靶向的+cMORF阻斷（藍色）或特異性預先靶向的（綠色）細胞上利用 SWNT-CM0RF-AF647的細胞結(jié)合測定的代表性流式細胞術(shù)圖示。圖3E顯示在抗-CD20預先靶 向的Daudi細胞（方形）和抗-A33預先靶向的LS174T細胞（三角形）上SWNT-CM0RF-AF647 的結(jié)合曲線。使用用于具有可變Hill斜率（R 2 = 0.95, 0.97)的一個位點的特異性結(jié)合的 算法，使用GraphPad Prism來擬合曲線。
[0027] 圖4A-4E證實SWNT-cMORF綴合物當在用mAb-MORF靶向的細胞上自組裝時能夠誘 導抗原加帽和內(nèi)化。圖4A顯示在37°C抗_A33(右）保持穩(wěn)定地結(jié)合至LS174T細胞（右， DAPI核染色）達24小時（顯示了 4小時）以及它們關(guān)于細胞膜均勻地分布。圖4B顯示 抗-A33-M0RF綴合物（右）當結(jié)合至LS174T細胞（右）時表現(xiàn)出類似的表面穩(wěn)定性。圖4C 顯示用A33-M0RF(中間）接著用SWNT-cM0RF-AF647(右）預處理的細胞，允許在37°C自組 裝達4小時，證實結(jié)合的抗體的分布的顯著變化，連同分散的點狀染色的變化。對于30min 和Ih溫育觀察到類似的模式。圖4D是用抗-A33-M0RF接著用SWNT-CM0RF-AF647處理的 單個LS174T細胞的大功率視圖并且示出了抗體的出現(xiàn)和指示囊泡攝取的納米管陽性胞內(nèi) 點狀染色。圖4E顯示用抗-A33-M0RF(中間）并且接著用單獨的CM0RF-AF647 (右）處理 的細胞不展現(xiàn)A33關(guān)于細胞膜的分布的變化?？?A33-M0RF關(guān)于細胞質(zhì)膜均勻分布，并且 CM0RF-AF647與靶向的mAb-MORF共定位。
[0028] 圖5A-5C示出了 SWNT-cMORF可以在體內(nèi)在預先靶向的腫瘤上選擇性地自組裝。 圖5A是收獲自用同種型對照抗-⑶33-M0RF或腫瘤特異性抗-⑶20-M0RF處理的小鼠的 Daudi-GFP細胞的流式細胞術(shù)分析。數(shù)據(jù)表示為與未處理的Daudi-GFP細胞相比的中值熒 光的位移。顯示了兩個代表性小鼠。SWNT-cMORF選擇性地結(jié)合至用特異性抗體預先靶向的 小鼠中的腫瘤細胞，如通過相對于對照的20倍增加所證實的。圖5B是圖4A中的數(shù)據(jù)的代 表性流式細胞術(shù)圖示，顯示未處理的細胞（前側(cè)峰）、同種型mAb-MORF處理的細胞（中間 峰）和特異性mAb-MORF處理的細胞（后側(cè)峰）。圖5C顯示在注射SWNT-CMORF- 111In (DOTA) 后24小時，用特異性HuA33-M0RF或同種型對照抗-⑶33-M0RF預先靶向的LS174T有腫瘤 小鼠的組織血液比。相比于正常組織（肌肉顯示為代表性正常組織），僅在用特異性抗體預 先靶向的組織中SWNT-cMORF的腫瘤積累顯著增加（p〈0. 05)。
[0029] 圖6A-6C顯示SWNT-cM0RF-225Ac (DOTA)減輕放射性同位素毒性并且可以在彌 散性淋巴瘤的多步驟療法中用作有效試劑。圖6A顯示用不同劑量水平的225Ac標記的 SWNT-cMORF-DOTA處理的無腫瘤小鼠的整體動物重量。另外的一組小鼠接受450nCi的游離 225Ac作為對照。數(shù)據(jù)反映平均重量。所有組η = 5。通過星號記錄動物死亡。圖6B顯示 由治療組組織的在暴露于SWCNT-cM0RF-225Ac (DOTA)后140天宰殺的存活小鼠的平均器官 重量。圖6C顯示被注射以5mg/ml熒光素并在5分鐘延遲后成像的之前植入有熒光素酶轉(zhuǎn) 染的Daudi淋巴瘤細胞的小鼠。發(fā)光等級對所有圖像相同。小鼠用如之前所述的多步驟療 法治療并在治療后第〇、3、6和15天成像。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] 如本文使用的，術(shù)語〃一個〃或〃一種〃可以指一個或多個。如本文使用的，在權(quán) 利要求書中，當聯(lián)合詞語〃包括〃使用時，詞語〃一個〃或〃一種〃可以指一個或多于一個。 如本文使用的，"另一個"或"其他"可以指相同或不同權(quán)利要求要素或其組分的至少第二 個或更多個。
[0032] 如本文使用的，除非明確指示僅是指備選或備選是互斥的，術(shù)語"或"在權(quán)利要求 書中是指"和/或"，盡管本公開內(nèi)容支持僅是指備選和"和/或"的定義。
[0033] 如本文使用的，"另一個〃或"其他"可以是指至少第二個或更多個的相同或不同 的權(quán)利要求要素或其組分?！òāㄊ侵浮ò?。
[0034] 如本文使用的，術(shù)語"約"是指這樣的數(shù)值，其包括例如整數(shù)、分數(shù)和百分數(shù)，無論 是否明確指示。術(shù)語"約"通常是指本領(lǐng)域技術(shù)人員會認為與所列出的值相當（例如，具有 相同功能或結(jié)果）的數(shù)值范圍（例如，所列出的值的+/-5-10% )。在一些情況下，術(shù)語"約" 可以包括舍入到最接近有效數(shù)字的數(shù)值。
[0035] 如本文使用的，術(shù)語"接觸"是指使如本文所述的包含自組裝單壁納米管系統(tǒng)的兩 個組分之一或兩者與細胞或包含其的抗原接觸的任何合適方法。在體外或體外，這通過使 細胞暴露于在合適介質(zhì)中的組分而實現(xiàn)。對于體內(nèi)應用，任何已知的施用方法是合適的。
[0036] 如本文使用的，術(shù)語"SWNT"是指這樣的單壁納米管（SWNT)，其具有適合生物綴合 的功能性下垂部分或手柄，如側(cè)壁胺或醛羰基。
[0037] 如本文使用的，術(shù)語"M0RF"和"cMORF"是指具有嗎啉主鏈或嗎啉代寡核苷酸的合 成DNA類似物。cMORF寡核苷酸的序列與MORF寡核苷酸的序列互補。這樣，術(shù)語"mAB-MORF" 或"MORF-mAB"是指經(jīng)由標準化學方法連接至單克隆抗體的嗎啉代寡核苷酸。
[0038] 如本文使用的，"M*"是指可用作病理生理病癥例如癌癥的治療劑或診斷劑的可螯 合放射性金屬或其他放射性核素或可螯合造影劑如非放射性核素。這樣，"M*-D0TA"是指 螯合至雙功能螯合劑（4-異硫氰酸芐基）-1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸 (DOTA)或二乙烯三胺五乙酸（DTPA)(其本身直接連接至SWNT)的放射性金屬。
[0039] 如本文使用的，術(shù)語"SWNT-cMORF"是指具有多個嗎啉代寡核苷酸的單壁納米管， 所述多個嗎啉代寡核苷酸具有的序列與包含mAB-MORF寡核苷酸的MORF寡核苷酸互補。這 樣，術(shù)語" SWNT- (cMORF- (mAB-MORF)) "是指其中cMORF寡核苷酸雜交至MORF寡核苷酸的自 組裝復合物。
[0040] 如本文使用的，SWNT- (M*D0TA) - (cMORF- (mAB-MORF)) "是指這樣的自組裝的 SWNT-(cMORF-(mAB-MORF))復合物，其中單壁納米管還包含經(jīng)由雙功能螯合劑（4-異硫 氰酸芐基）_1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸（DOTA)或二乙烯三胺五乙酸 (DTPA)連接至SWNT的放射性金屬或其他放射性核素或可螯合造影劑。
[0041] 如本文使用的，術(shù)語"受試者"是指如本文所述的SWNT自組裝組分或SWNT構(gòu)建體 的任何接受者。
[0042] 在本發(fā)明的一個實施方案中，提供一種將分子原位遞送至目的細胞的方法，所述 方法包括使細胞接觸連接至對所述細胞具有選擇性的靶向部分的嗎啉代寡核苷酸；使經(jīng)由 所述靶向部分連接至所述目的細胞的嗎啉代寡核苷酸接觸可溶性單壁納米管構(gòu)建體，所述 可溶性單壁納米管構(gòu)建體具有與所述連接靶向部分的嗎啉代寡核苷酸互補的多個嗎啉代 寡核苷酸和獨立地連接至所述單壁納米管的多個分子（M*)，所述分子包含可遞送的有效負 載；和將所述嗎啉代寡核苷酸雜交至所述互補的嗎啉代寡核苷酸以在所述細胞處形成自組 裝的可溶性單壁納米管復合物；其中在雜交后，所述有效負載分子被原位遞送至所述細胞。 在此實施方案的一個方面，原位遞送步驟可以包括經(jīng)由所述自組裝的SWNT - mAB復合物給 位于靶向的細胞上的抗原加帽；以及將所述復合物內(nèi)化到所述細胞中。
[0043] 在此實施方案中，在單壁納米管復合物自組裝后，位于靶向的細胞上的抗原可以 被加帽并且原位遞送步驟可以包括將復合物內(nèi)化到所述細胞中。而且，嗎啉代寡核苷酸和 互補的嗎啉代寡核苷酸都可以是18-聚體寡核苷酸。特別地，嗎啉代寡核苷酸可以具有在 SEQ ID NO: 1中所示的序列，并且互補的嗎啉代寡核苷酸可以具有在SEQ ID NO: 2中所示的 序列。
[0044] 而且在此實施方案中，靶向部分可以是單克隆抗體或其片段或小分子配體，其 各自對與實體或彌散性癌癥相關(guān)的細胞具有選擇性的。在一個方面，單克隆抗體可以是 抗-CD20、抗-CD33或抗-A33單克隆抗體或其單鏈可變片段（scFv)或片段抗原結(jié)合（Fab) 片段。在另一方面，單克隆抗體本身可以是原位遞送的有效負載分子。在另一方面，小分子 配體可以是葉酸受體配體或Arg-Gly-Asp肽。癌癥的代表性實例是淋巴瘤、白血病或結(jié)腸 癌。
[0045] 另外，有效負載分子可以是診斷分子或治療分子中的一種或二者。所述分子可以 是經(jīng)由雙功能螯合劑連接至SWNT的放射性核素。雙功能螯合劑的代表性實例是（4-異硫 氰酸芐基）_1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸（DOTA)或二乙烯三胺五乙酸 (DTPA)。在一方面，診斷分子可以是銦-111、銅-64、碘-124、碘-131、釔-86、釓造影劑、錳 造影劑或熒光團。在另一方面，治療分子可以是錒-225、砹-211、锝-99、镥-177、鎵-68、 欽-166、鉍-212、鉍-213、釔-90、銅-67、釤-117、釤-153、碘-123、碘-125 或碘-131。
[0046] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種用于診斷受試者中的癌癥的方法，所 述方法包括向受試者順序地施用自組裝的單壁納米管復合物的第一組分及其第二組分，所 述第一組分具有靶向部分，所述靶向部分對與癌癥相關(guān)的細胞具有選擇性的，綴合至嗎啉 代寡核苷酸，所述第二組分包含單壁納米管構(gòu)建體，所述單壁納米管構(gòu)建體具有多個互補 的嗎啉代寡核苷酸和獨立地與其綴合的多個診斷有效負載分子；和在所述復合物的第一和 第二組分在所述癌癥相關(guān)細胞處自組裝后檢測所述受試者中的診斷有效負載分子，從而診 斷癌癥。
[0047] 在此實施方案中，第一組分嗎啉代寡核苷酸可以具有在SEQ ID NO: 1中所示的序 列，并且第二組分互補的嗎啉代寡核苷酸可以具有在SEQ ID N0:2中所示的序列。而且， 靶向部分可以是單克隆抗體或其片段或小分子配體。單克隆抗體或其片段以及小分子配 體的代表性實例如上所述。另外，診斷有效負載可以經(jīng)由雙功能螯合劑連接至單壁納米 管。另外，雙功能螯合劑和癌癥如上所述。此外，診斷有效負載分子可以是銦-111、銅-64、 碘-124、碘-131、釔-86、釓造影劑、錳造影劑或熒光團。
[0048] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種治療受試者中的癌癥的方法，所述方 法包括向受試者順序地施用用獨立地連接至嗎啉代寡核苷酸的靶向部分和一種或多種治 療有效負載分子功能化的自組裝的單壁納米管復合物的第一組分和第二組分；其中第一和 第二組分在由靶向部分靶向的與癌癥相關(guān)的細胞上自組裝，從而將治療有效負載遞送至所 述細胞以治療癌癥。
[0049] 在一方面，自組裝的SWNT復合物的第一組分可以包含綴合至靶向部分的第一嗎 啉代寡核苷酸。第一嗎啉代寡核苷酸可以具有在SEQ ID NO: 1中所不的序列。在另一方 面，自組裝的單壁納米管復合物的第二組分可以包含具有與第一嗎啉代寡核苷酸互補的序 列的多個第二嗎啉代寡核苷酸和獨立地連接至可溶性單壁納米管的多個有效負載分子。第 二互補的嗎啉代寡核苷酸可以具有在SEQ ID N0:2中所示的序列。
[0050] 在其所有實施方案和方面中，在復合物自組裝后，位于癌癥相關(guān)細胞上的抗原可 以被加帽并且所述復合物可以被內(nèi)化到細胞中。而且，所述治療有效負載可以是經(jīng)由雙功 能螯合劑連接至單壁納米管的放射性核素。雙功能螯合劑的代表性實例如上所述。治療放 射性核素可以是錒-225、砹-211、锝-99、镥-177、鎵-68、欽-166、鉍-212、鉍-213、釔-90、 銅-64、銅-67、釤-117、釤-153、碘-123、碘-125或碘-131。備選地，單克隆抗體可以是治 療有效負載分子。包括單克隆抗體或其片段和小分子配體在內(nèi)的靶向部分以及癌癥如上所 述。
[0051] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種自組裝單壁納米管復合物，其包括具 有連接至單克隆抗體或其片段的嗎啉代寡核苷酸的第一組分；和具有多個互補的嗎啉代寡 核苷酸和各自獨立地連接至單壁納米管的多個診斷或治療分子之一或二者。
[0052] 在此實施方案中，診斷和治療分子可以是經(jīng)由雙功能螯合劑如DOTA或DTPA連 接至單壁納米管的放射性核素，如上所述。放射性核素的代表性實例是錒-225、砹-211、 銦-111、锝-99、镥-177、鎵-68、欽-166、鉍-212、鉍-213、釔-86、釔-90、銅-64、銅-67、 釤-117、釤-153、碘-123、碘-124、碘-125或碘-131。另外，單克隆抗體可以是所述治療 分子。單克隆抗體或其片段的實例可以是抗-CD20、抗-CD33或抗-A33抗體或其單鏈可變 片段（scFv)或片段抗原結(jié)合（Fab)片段。
[0053] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種單壁納米管構(gòu)建體，其包括共價連接 至單壁納米管的多個雙功能螯合劑；螯合至每個雙功能螯合劑的放射性核素；和綴合至單 壁納米管的多個嗎啉代寡核苷酸。在此實施方案中，用于診斷或治療分子或有效負載分子 的雙功能螯合劑和放射性核素如上所述。
[0054] 本文提供在用于將分子或有效負載遞送至細胞的多步自組裝方法中有用的單壁 納米管構(gòu)建體、系統(tǒng)和方法。單壁化碳納米管與嗎啉代寡核苷酸序列的綴合（SWNT-cMORF) 給它們提供以次納摩爾親和性并且在生理條件下與附帶有互補的寡核苷酸的癌癥選擇性 抗體（mAb-MORF)自組裝的能力。自組裝促進靶抗原復合物內(nèi)化，這使得能夠經(jīng)由通常非內(nèi) 化的祀標將診斷和/或治療劑遞送到細胞中。
[0055] -般地，自組裝單壁納米管（SWNT)系統(tǒng)包括兩個組分。第一組分包含連接至靶 向部分（如單克隆抗體或其片段或其他靶向肽或配體）的嗎啉代寡核苷酸。優(yōu)選地，靶 向部分是單克隆抗體或其單鏈可變片段（scFv)或片段抗原結(jié)合（Fab)片段，并且第一組 分具有結(jié)構(gòu)mAb-MORF或MORF-mAb。備選地，靶向部分可以是小分子配體，如但不限于， Arg-Gly-Asp(RGD)肽或葉酸受體配體。靶向部分可以經(jīng)由標準化學方法連接至嗎啉代寡核 苷酸。優(yōu)選地，靶向部分將靶向與癌癥相關(guān)的細胞。
[0056] 所述系統(tǒng)中的第二組分包含合成的、共價改性的SWNT，其帶有多個副本的合成寡 核苷酸類似物，例如，嗎啉代寡核苷酸（cMORF)和熒光團和/或放射性同位素或其他核素。 SWNT和嗎啉代（morpholino)之間的連接（SWNT-cMORF)可用光譜量化，其中200nm的SWNT 約5-15個嗎啉代。SWNT-cMORF綴合物可以經(jīng)由雜交至嗎啉代寡核苷酸MORF以優(yōu)異特異性 和高親和性在抗體靶向的癌細胞表面上自組裝。
[0057] 嗎啉代寡核苷酸及其補體可以是短寡核苷酸，如18-聚體寡核苷酸，例如，但不限 于，在SEQ ID N0S:1和2中的互補序列，如實施例1中所示。與基于蛋白質(zhì)的對相比，嗎啉 代寡核苷酸免疫原性更低（28)。這允許多次施用和潛在更復雜的多步驟自組裝構(gòu)建體、復 合物和系統(tǒng)。
[0058] 多價自組裝系統(tǒng)可以觸發(fā)抗原加帽和mAb-MORF靶標的內(nèi)化，即使是在其他表面 穩(wěn)定抗原中。這種內(nèi)化可以是SWNT-cMORF與多個mAb-MORF靶標自組裝（模擬表面受體的 交聯(lián)）的能力的結(jié)果。通過系統(tǒng)組分的自組裝觸發(fā)表面抗原內(nèi)化的能力可以增強附加到 SWNT的試劑的治療效力。因此，自組裝中的第二步也可以觸發(fā)初始靶向試劑的內(nèi)化，從而在 靶向細胞內(nèi)俘獲細胞毒性試劑并改善治療指數(shù)。
[0059] 這樣，本發(fā)明的自組裝構(gòu)建體、系統(tǒng)和復合物在用于治療病理生理狀態(tài)，如實體或 彌散性癌癥中是有效的載體。代表性實體和彌散性癌癥可以是但不限于結(jié)腸癌、淋巴瘤和 白血病。治療放射性核素可以使用SWNT-cMORF構(gòu)建體遞送至癌細胞。治療放射性核素可 以是但不限于錒-225、砹-211、锝-99、镥-177、鎵-68、欽-166、鉍-212、鉍-213、釔-90、 銅-67、釤-117、釤-153、碘-123、碘-125 或碘-131。
[0060] 而且，所述自組裝構(gòu)建體、系統(tǒng)和復合物可用于在診斷測定中在體內(nèi)在體外檢測 和診斷病理生理狀態(tài)或病癥。SWNT-cMORF可以包含連接至SWNT的造影劑、診斷放射性核 素或熒光團。例如，診斷放射性核素可以是但不限于銦-111、銅-64、碘-124、碘-131或 釔-86。其他非放射性核素診斷試劑可以是釓造影劑、錳造影劑或熒光團，如本領(lǐng)域已知的。 預期基于超順磁性氧化鐵的造影劑也可以用作本文提供的方法和組合物中的診斷試劑。
[0061] 給出以下實施例用于舉例說明本發(fā)明的不同實施方案的目的而不意圖以任何方 式限制本發(fā)明。
[0062] 實施例1
[0063] 方法和材料
[0064] SWNT 的改件
[0065] 高純度（>90% )單壁化碳納米管獲自NanoLab Inc (Waltham, MA)。這些電弧放電 制備的單壁化碳納米管根據(jù)所描述的方案（33)反應以制備SWNT-NH215 SWNT-NH2產(chǎn)物通過施 用并在20%乙腈：0· IM乙酸三乙胺中洗漆而在C18Seppak(Waters)上純化。純化的產(chǎn)物用 50%乙腈：水洗脫。然后將此溶液凍干以得到深褐色SWNT-NH2固體，或直接稀釋到碳酸氫 鹽緩沖液（〇· IM Na HC03, pH 9)中。向 SWNT-NH2 加入 0· 6mmol/g 的 PEG4/PFB(Solulink) 長鏈交聯(lián)劑。允許此反應在室溫進行2小時。然后反應混合物在一次性臺式10-DG尺寸排 阻柱（Biorad)上純化，其中帶有SWNT-4FB-NH 2產(chǎn)物的醛和胺洗脫到0. IM MES，0. 15M NaCl, pH 5. 5緩沖液中。
[0066] MORF和cMORF與納米管和抗體的綴合
[0067] 嗎啉代寡核苷酸（M0RF，序列：TCTTCTACTTCACAACTA，SEQ ID N0:l)cM0RF，序列： TAGTTGTGAAGTAGAAGA，SEQIDN0:2)慣例合成（GeneToolsInc·)，并且在3'端上含有 伯胺。該伯胺用醛或肼部分加帽用于分別綴合抗體或納米管。M0RF-NH 2/cM0RF-NH2在 含有20 %乙腈的0. IM碳酸氫鈉緩沖液中與20倍過量的琥珀酰亞胺基4-甲?；郊姿?酯（succinimidyl 4-formyl benzoate) (Thermo Scientific)或玻拍醜亞胺基餅基煙醜 胺（succinimidyl hydrazinonicotinamide) (Thermo Scientific)反應。游離的銜接物通 過凝膠過濾色譜在10-DG柱（Bio-Rad)上除去，并且嗎啉代（morpholinos)純化到0. IM MES, (λ 15M NaCl, pH 5. 5 的緩沖液中。
[0068] 在含有 25 % 乙腈的 0· IM MES, 0· 15M NaCl, ρΗ5· 5 緩沖液中，cMORF-HyNic 與 SWNT-4FB-NH2以每克單壁碳納米管0. 2mmol的cMORF的比例混合。允許反應在37°C進行6 小時，然后在振蕩下在室溫過夜。SWNT-cM0RF-NH 2產(chǎn)物通過用在0. IM TEAA中的25%乙腈 在C18Seppak(Waters)上洗滌進行純化。產(chǎn)物用50%乙腈：水洗脫然后凍干以獲得固體產(chǎn) 物。產(chǎn)物通過反相C18HPLC驗證沒有cMORF-HyNic。
[0069] 將單克隆抗體 HuM195 (Lintuzumab ;Sloan_Kettering) / 抗-CD33, Rituximab/ 抗-CD20 (Genentech)和 huA33/ 抗-A33 (Ludwig Institute)稀釋到 0· IM 憐酸鈉，0· 15M NaCl，pH 7. 6的改性緩沖液中。向抗體溶液中緩慢加入10至15倍過量的琥珀酰亞胺基肼 煙酰胺?？贵w反應2小時接著在10-DG凝膠過濾柱上純化。腙改性的mAbs(mAb-HyNic)洗 脫到 0. 1MMES, 0. 15M NaCl, pH 5. 5 中。然后 HiAb-HyNic 與醛改性的 M0RF-4FB 以 8 個 MORF/ 抗體的比率反應并在溫和振蕩下在室溫反應至少12小時。剩余的游離M0RF-4FB通過在 100, 000MWC0離心過濾裝置（Amicon Ultra, Millipore)上純化而除去，其中在PBS中至少 洗滌三次。蛋白質(zhì)通過Dc蛋白質(zhì)測定（Biorad)量化并且附著的嗎啉代通過二芳基腙生色 團（bis-aryl hydrazone chromophore)(Amax = 354nm)利用光譜量化。mAb-MORF 綴合物 的純度通過HPLC在Superdex 200柱上驗證。
[0070] 放射標記
[0071] Swnt-CMORF-NH2溶解在0. IM碳酸氫鈉的緩沖液中，該緩沖液之前用Chelex 100樹脂（BiO-Rad)處理以使緩沖液沒有二價金屬。向此溶液中添加比例為IOmmol/ g的胺反應性2-(4-異硫氰酸芐基）-1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸 (DOTA-SCN，Macrocyclics)。將此反應在室溫保持2小時，接著在10-DG凝膠過濾柱上純化， 該過濾柱之前用25mM DTPA處理以使基質(zhì)不含金屬。產(chǎn)物在無金屬蒸餾H2O中洗脫并凍干 以獲得固體SWNT-cMORF-DOTA產(chǎn)物。此產(chǎn)物在50°C通過添加在含有20%乙腈的乙酸銨緩 沖液（IM)，pH 5中的放射性同位素用111InCl3 (MDS Nordion)放射標記達0. 5小時的時間。 標記混合物通過加入50mM DTPA猝滅并在IO-DG凝膠過濾柱上純化到PBS中。放射化學純 度通過即時薄層色譜法（使用的流動相為IOmM EDTA和0. 9 % NaCL/lOmM NaOH)測量（8)。 ITLC條使用System 400Imaging Scanner (Bioscan, Inc.)計數(shù)。放射化學純度在5次重復 標記反應中為>90%并且通過在HPLC上的放射性檢測確認。
[0072] HPLC 測丨定
[0073] 所有高效液相色譜法在配有內(nèi)嵌的Y -RAM模式3放射性檢測器（IN/US)的 System Gold Bioessential 125/168 二極管陣列檢測儀器（Beckman Coulter)上進行。使 用32Karat色譜法軟件（Beckman Coulter)和Prism圖形化和分析軟件（Graphpad)二者進 行分析。凝膠過濾色譜法在20mM乙酸鈉，0. 15M氯化鈉 ，pH 6. 5等度流動相中在Superdex 200柱上進行。反相HPLC利用在0. IM TEAA中的20%乙腈至100%乙腈的梯度在Gemini C18柱（Phenomenex)上進行。對于抗體-納米管雜交測定，樣品在磷酸鹽緩沖鹽水中混合， 除非另有說明，在注入到HPLC柱上之前，在150 μ L總體積中達5分鐘。
[0074] 共焦顯微鏡
[0075] LS174T細胞以50, 000個細胞/mL接種到組織培養(yǎng)物處理的、聚賴氨酸涂覆的、多 孔分室載玻片（Nunc)上達24小時。這些載玻片在37°C用IOnM的抗-A33-M0RF、抗-A33 或?qū)φ湛?CD19-M0RF抗體中的一種處理4小時。然后洗掉未結(jié)合的抗體，并且細胞用單獨 的培養(yǎng)基、含有7. 5 μ g/mL SWNT-CM0RF-AF647綴合物的培養(yǎng)基或含有IOOnM熒光標記的 CM0RF-AF647的培養(yǎng)基處理。然后細胞在37°C溫育達4小時。在規(guī)定的時間點（30min、lh、 4h)，將細胞用PBS洗滌并用4%中性緩沖的多聚甲醛固定。為了可視化抗-A33抗體，細胞 用含有 0· 5% BSA 和 0· 2% Triton-X 的 PBS 緩沖液透性化（permeabilized)，然后用 Alexa Fluor 488標記的抗-人IgG(Invitrogen)的1:500稀釋液染色。在染色后，洗漆細胞并安 放在含有 DAPI 核染色劑（Invitrogen)的 Prolong Gold 介質(zhì)中。SWNT-cMORF 和 cMORF 可 以通過連接的AF647熒光團直接可視化。在激光掃描共焦成像系統(tǒng)（Leica)上進行成像， 其中設(shè)置在不同細胞處理條件的可視化上保持。
[0076] 細朐結(jié)合
[0077] Daudi B細胞淋巴瘤，LS174T結(jié)腸腺癌和HL60早幼粒細胞性白血病細胞系獲 自ATCC并在37°C在5 % CO2中，在含有10% FBS的RPMI中培養(yǎng)。GFP轉(zhuǎn)染的Daudi通過 如之前所述（9)的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染制備。在流式細胞術(shù)測定之前，將細胞懸浮在含有2% 人血清作為封閉劑的冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)或（或當注明時）100%人血清中。懸 浮培養(yǎng)物通過離心和重懸洗滌，同時使粘附細胞在含有EDTA的0. 05%胰蛋白酶（Gibco) 中胰蛋白酶化，接著洗滌。懸浮液中的細胞首先在冰上或在37°C與IOnM的mAb-MORF結(jié) 合1小時。在mAb-MORF處理后，細胞用結(jié)合緩沖液洗滌，然后與濃度范圍達10 μ g/mL的 SWNT-CM0RF-AF647綴合物結(jié)合。細胞通過離心/重懸洗滌并在Accuri C6流式細胞儀 (Accuri, Inc.)上讀數(shù)。數(shù)據(jù)使用Flojo分析軟件（TreeStar, Inc.)處理。
[0078] 體內(nèi)結(jié)合研究
[0079] 所有小鼠都是雌性NCI nu/nu，4_6周齡，并且所有動物研究在實驗動物護理 和使用委員會（Institutional Animal Care and Use Committee)批準下進行。對 于Daudi淋巴瘤模型，Daudi細胞在懸浮液中培養(yǎng)，接著用冷PBS洗滌并重懸在0. 9 % NaCl (Hospira, Inc.)中。然后給小鼠注射2千萬個細胞/小鼠。在6小時后，小鼠接 著用Daudi特異性抗-⑶20利妥昔單抗（Rituximab)(抗-⑶20-M0RF)或同種型對照 抗-⑶33HuM195 (抗-⑶33-M0RF)的3 μ g嗎啉代綴合物處理。16小時后，小鼠接著腹膜內(nèi) 注射2 μ g的SWNT-CM0RF-AF647。允許SWNT-CM0RF-AF647循環(huán)和靶向達4小時，之后殺死 小鼠并通過用冰冷PBS灌洗腹膜內(nèi)腔收集淋巴瘤細胞。此細胞懸浮液用PBS洗滌，通過細 胞粗濾器以除去碎片，并在Accuri C6流式細胞儀上運行。細胞懸浮液在FLl通道中門控 Daudi-GFP細胞，然后在FL4通道中測量SWNT-CM0RF-AF647的熒光。數(shù)據(jù)在FloJo細胞術(shù) 軟件（TreeStar, Inc.)上分析。
[0080] 對于實體瘤研究，4-6周齡雌性NCI nu/nu小鼠皮下異種移植5百萬個LS174T細 胞到右側(cè)腹中。細胞懸浮在Matrigel基質(zhì)（BD)和冰冷的PBS的1:1混合物中。一旦腫 瘤達到?150mm 3,在約7天，小鼠用腹膜內(nèi)注射稀釋在生理鹽水中的20 μ g的腫瘤特異性 抗-A33-M0RF或同種型對照抗-⑶33-M0RF抗體處理。在用抗體處理后72小時，經(jīng)由眼眶 后靜脈竇給小鼠靜脈內(nèi)注射12μ g的SWNT-CMORF-111In(DOTA)。利用汽化室（VetEquip)施 用異氟烷麻醉。SWNT-cMORF-lllIn(DOTA)的典型特異性活性為?2-3Ci/g并且施用每只 小鼠24-36 μ Ci的總活性。在不同時間點，殺死小鼠，收獲它們的器官并稱重，并在Cobra Π Y計數(shù)器（Packard)上計數(shù)放射性。
[0081] 牛物分布
[0082] SWNT-cMORF-DOTA如之前所述用99. 7 %放射化學純度的111 In標記。30只4-6周 齡的BALB/c小鼠 （NCI Labs)隨機分成6組，每組5只小鼠。每只小鼠腹膜內(nèi)注射在200uL 無菌生理鹽水中的3200nCi的SWNT-cMORF-lllIn(DOTA)。在1、4、8、12和24小時殺死小 鼠。收集含有排泄的尿液和糞便的來自籠子的墊層用于量化。從殺死的小鼠收獲腎、肺、肌 肉、心臟、血液、肝、脾、腸和骨，并且如之前所述量化每種器官的％注射劑量。
[0083] 體內(nèi)毒件學研究
[0084] 51階^]\?)1^-0(7^用98.4%放射化學純度的2254(3標記。45只4-6周齡的841^/ C小鼠 （NCI Labs)。小鼠隨機分成9組，每組5只小鼠，并接受如表1所示的單次注射。
[0085] 表 1
[0086]
【權(quán)利要求】
1. 用于將分子原位遞送至目的細胞的方法，所述方法包括： 使所述細胞與連接至對所述細胞是選擇性的靶向部分的嗎啉代寡核苷酸接觸； 使經(jīng)由所述靶向部分連接至所述目的細胞的所述嗎啉代寡核苷酸與可溶性單壁納米 管構(gòu)建體接觸，所述可溶性單壁納米管構(gòu)建體具有多個與所述連接靶向部分的嗎啉代寡核 苷酸互補的嗎啉代寡核苷酸和獨立地連接至所述單壁納米管的多個分子（M*)，所述分子包 含可遞送的有效負載；和 使所述嗎啉代寡核苷酸與所述互補的嗎啉代寡核苷酸雜交以在所述細胞處形成自組 裝的可溶性單壁納米管復合物，其中在雜交后，所述有效負載分子被原位遞送至所述細胞。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述單壁納米管復合物自組裝后，位于所述靶向的 細胞上的抗原被加帽并且所述原位遞送步驟包括將所述復合物內(nèi)化到所述細胞中。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述嗎啉代寡核苷酸和所述互補的嗎啉代寡核苷酸都 是18-聚體寡核苷酸。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中所述嗎啉代寡核苷酸具有在SEQ ID NO: 1中所示的序 列并且所述互補的嗎啉代寡核苷酸具有在SEQ ID N0:2中所示的序列。
5. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶向部分是單克隆抗體或其片段或小分子配體， 其各自對于與實體或彌散性癌癥相關(guān)的細胞是選擇性的。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其中所述單克隆抗體是抗-CD20、抗-CD33或抗-A33單克 隆抗體或其單鏈可變片段（scFv)或片段抗原結(jié)合（Fab)片段。
7. 權(quán)利要求5所述的方法，其中所述單克隆抗體是所述原位遞送的有效負載分子。
8. 權(quán)利要求5所述的方法，其中所述小分子配體是葉酸受體配體或Arg-Gly-Asp肽。
9. 權(quán)利要求5所述的方法，其中所述癌癥是淋巴瘤、白血病或結(jié)腸癌。
10. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述有效負載分子是診斷分子或治療分子中的一種 或兩者。
11. 權(quán)利要求10所述的方法，其中所述分子是經(jīng)由雙功能螯合劑連接至所述單壁納米 管的放射性核素。
12. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所述雙功能螯合劑是（4-異硫氰酸芐 基）-1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸（D0TA)或二乙烯三胺五乙酸（DTPA)。
13. 權(quán)利要求10所述的方法，其中所述診斷分子是銦-111、銅-64、碘-124、碘-131、 釔-86、釓造影劑、錳造影劑或熒光團。
14. 權(quán)利要求10所述的方法，其中所述治療分子是錒-225、砹-211、锝-99、镥-177、 鎵-68、欽-166、鉍-212、鉍-213、釔-90、銅-67、釤-117、釤-153、碘-123 或碘-131。
15. 用于診斷受試者中的癌癥的方法，所述方法包括： 向所述受試者順序地施用自組裝的單壁納米管復合物的第一組分及其第二組分，所述 第一組分具有對與所述癌癥相關(guān)的細胞具有選擇性、綴合至嗎啉代寡核苷酸的靶向部分， 所述第二組分包含單壁納米管構(gòu)建體，所述單壁納米管構(gòu)建體具有多個互補的嗎啉代寡核 苷酸和獨立地與其綴合的診斷有效負載分子；和 在所述復合物的所述第一和第二組分在所述癌癥相關(guān)細胞處自組裝后，檢測所述受試 者中的所述診斷有效負載分子，從而診斷所述癌癥。
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一組分嗎啉代寡核苷酸具有在SEQ ID NO: 1 中所示的序列并且所述第二組分互補的嗎啉代寡核苷酸具有在SEQ ID N0:2中所示的序 列。
17. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述靶向部分是單克隆抗體或其片段或小分子配 體。
18. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所述單克隆抗體是抗-CD20、抗-CD33或抗-A33單 克隆抗體或其單鏈可變片段（scFv)或片段抗原結(jié)合（Fab)片段。
19. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所述小分子配體是葉酸受體配體或Arg-Gly-Asp肽。
20. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述診斷有效負載分子是銦-111、銅-64、碘-124、 碘-131、釔-86、釓造影劑、錳造影劑或熒光團。
21. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述診斷有效負載經(jīng)由雙功能螯合劑連接至所述單 壁納米管。
22. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述雙功能螯合劑是（4-異硫氰酸芐 基）-1，4,7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4,7，10-四乙酸（0(7^)或二乙烯三胺五乙酸（0了?八）。
23. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述癌癥是淋巴瘤、白血病或結(jié)腸癌。
24. 治療受試者中的癌癥的方法，所述方法包括： 向所述受試者順序地施用用獨立地連接至嗎啉代寡核苷酸的靶向部分以及一種或多 種治療有效負載分子功能化的自組裝的單壁納米管復合物的第一組分和第二組分；其中所 述第一和第二組分在由所述靶向部分靶向的與所述癌癥相關(guān)的細胞上自組裝，從而將所述 治療有效負載遞送至所述細胞以治療所述癌癥。
25. 權(quán)利要求24所述的方法，其中在自組裝后，位于所述癌癥相關(guān)細胞上的抗原被加 帽并且所述復合物被內(nèi)化到所述細胞中。
26. 權(quán)利要求24所述的方法，其中所述自組裝的單壁納米管復合物的第一組分包含綴 合至所述靶向部分的第一嗎啉代寡核苷酸。
27. 權(quán)利要求26所述的方法，其中所述第一嗎啉代寡核苷酸具有在SEQ ID NO: 1中所 示的序列。
28. 權(quán)利要求24所述的方法，其中所述自組裝的單壁納米管復合物的第二組分包含具 有與所述第一嗎啉代寡核苷酸互補的序列的多個第二嗎啉代寡核苷酸和獨立地連接至所 述可溶性單壁納米管的多個所述有效負載分子。
29. 權(quán)利要求28所述的方法，其中所述第二互補的寡核苷酸各自具有在SEQ ID NO:2 中所示的序列。
30. 權(quán)利要求24所述的方法，其中所述治療有效負載是經(jīng)由雙功能螯合劑連接至所述 單壁納米管的放射性核素。
31. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述雙功能螯合劑是（4-異硫氰酸芐 基）-1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸（D0TA)或二乙烯三胺五乙酸（DTPA)。
32. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述放射性核素是錒-225、砹-211、锝-99、镥-177、 鎵-68、欽-166、鉍-212、鉍-213、釔-90、銅-67、釤-117、釤-153、碘-123、碘-125 或 碘-131。
33. 權(quán)利要求24所述的方法，其中所述靶向部分是單克隆抗體或其片段或小分子配 體，其各自對與實體或彌散性癌癥相關(guān)的細胞是選擇性的。
34. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述單克隆抗體是抗-CD20、抗-CD33或抗-A33單 克隆抗體或其單鏈可變片段（scFv)或片段抗原結(jié)合（Fab)片段。
35. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述單克隆抗體是所述治療有效負載分子。
36. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述小分子配體是葉酸受體配體或Arg-Gly-Asp肽。
37. 權(quán)利要求24所述的方法，其中所述癌癥是淋巴瘤、白血病或結(jié)腸癌。
38. 自組裝單壁納米管系統(tǒng)，所述自組裝單壁納米管系統(tǒng)包括： 具有連接至單克隆抗體或其片段的嗎啉代寡核苷酸的第一組分；和 具有多個互補的嗎啉代寡核苷酸和各自獨立地連接至所述單壁納米管的多個診斷或 治療分子中的一種或兩者的第二組分。
39. 權(quán)利要求38所述的自組裝單壁納米管系統(tǒng)，其中所述診斷和治療分子是經(jīng)由雙功 能螯合劑連接至所述單壁納米的放射性核素。
40. 權(quán)利要求39所述的自組裝單壁納米管系統(tǒng)，其中所述雙功能螯合劑是（4-異硫 氰酸芐基）_1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸（DOTA)或二乙烯三胺五乙酸 (DTPA)。
41. 權(quán)利要求39所述的自組裝單壁納米管系統(tǒng)，其中所述放射性核素是錒-225、 砹-211、銦-111、锝-99、镥-177、鎵-68、欽-166、鉍-212、鉍-213、釔-86、釔-90、銅-64、 銅-67、釤-117、釤-153、碘-123、碘-124、碘-125 或碘-131。
42. 權(quán)利要求38所述的自組裝單壁納米管系統(tǒng)，其中所述單克隆抗體是所述治療分 子。
43. 權(quán)利要求38所述的自組裝單壁納米管系統(tǒng)，其中所述單克隆抗體是抗-CD20、 抗-CD33或抗-A33抗體或其單鏈可變片段（scFv)或片段抗原結(jié)合（Fab)片段。
44. 單壁納米管構(gòu)建體，所述單壁納米管構(gòu)建體包括 共價連接至所述單壁納米管的多個雙功能螯合劑； 螯合至各個雙功能螯合劑的放射性核素；和 綴合至所述單壁納米管的多個嗎啉代寡核苷酸。
45. 權(quán)利要求44所述的單壁納米管構(gòu)建體，其中所述雙功能螯合劑是（4-異硫氰酸芐 基）-1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸或二乙烯三胺五乙酸（DTPA)。
46. 權(quán)利要求44所述的單壁納米管構(gòu)建體，其中所述放射性核素是錒-225、砹-211、 銦-111、锝-99、镥-177、鎵-68、欽-166、鉍-212、鉍-213、釔-86、釔-90、銅-64、銅-67、 釤-117、釤-153、碘-123、碘-124、碘-125 或碘-131。
【文檔編號】C12N15/113GK104334178SQ201280070820
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月29日
【發(fā)明者】戴維·A·沙因貝格, 邁克爾·R·麥克德維特, 卡洛斯·H·維拉, J·賈斯廷·馬爾維 申請人:斯隆-凱特琳癌癥研究院