具有修飾的生物堿含量的大紅罌粟的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及遺傳修飾的大紅罌粟(Papaver bracteatum)物種植物，其中由所述植物產(chǎn)生一種或多種生物堿的類型或量已被改變。具體地，相對(duì)于野生型大紅罌粟(P.bracteatum)，所述遺傳修飾的植物具有蒂巴因6-O-脫甲基酶、可待因O-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶中的一種或多種的增加的表達(dá)，從而使所述遺傳修飾的罌粟植物相對(duì)于野生型大紅罌粟產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。還提供以上述遺傳修飾的罌粟植物作為親本的子代植物；上述植物的突變體或衍生植物；來(lái)源于上述植物的繁殖材料，由上述植物產(chǎn)生的稈，由上述植物產(chǎn)生的稈濃縮物，來(lái)源于上述植物的膠乳，或來(lái)源于上述植物的一種或多種分離的細(xì)胞。還提供由上述植物產(chǎn)生生物堿的方法以及6-O-脫甲基酶和可待因O-脫甲基酶基因的核酸和氨基酸序列變體。
【專利說(shuō)明】具有修飾的生物堿含量的大紅罌粟 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及遺傳修飾的大紅S粟（Papaver bracteatum)物種植物，其中由所述植 物產(chǎn)生的一種或多種生物堿的類型或量已被改變。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 許多國(guó)家在調(diào)控下商業(yè)化培育阿片S粟（Opium poppies)(鴉片s粟（Papaver somniferum))。通過(guò)切開(kāi)特有的蒴果得到的膠乳稱為阿片，并且是一些藥理學(xué)上重要的生 物堿的來(lái)源。嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁和罌粟堿是由該植物產(chǎn)生的最重要的生物堿，并 且在制藥工業(yè)上用作止痛藥、鎮(zhèn)咳藥和鎮(zhèn)痙藥。
[0004] 然而，在商業(yè)規(guī)模上，罌粟桿和桿濃縮物（而不是膠乳）是用于生產(chǎn)嗎啡和其他罌 粟來(lái)源的生物堿的最常用的原料。例如，現(xiàn)在，世界上多于50%的嗎啡是由罌粟桿或罌粟桿 濃縮物制備的。
[0005] 澳大利亞生產(chǎn)世界上很大部分的（2006年約為30% )用于嗎啡生產(chǎn)的罌粟桿濃縮 物。此外，澳大利亞的塔斯馬尼亞是世界上最大的用于制藥市場(chǎng)的阿片生物堿生產(chǎn)地。在 塔斯馬尼亞，播種罌粟的面積在2011年接近34, OOOha。
[0006] 目前，有價(jià)值的生物堿，如嗎啡，由一年生罌粟物種鴉片罌粟（Papaver somniferum)產(chǎn)生。
[0007] 然而，本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，與一年生植物物種相比，多年生的植物物種提供多種 農(nóng)業(yè)益處，諸如增加的硬度，增加的水分和/或營(yíng)養(yǎng)利用效率，消除每個(gè)季節(jié)重新種植的需 要，減少與作物建立相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)以及基本上減少作物輪作的需要。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到上文列出的 益處中的一種或多種具有增加生物堿總產(chǎn)率和/或效率的潛力。
[0008] 大紅罌粟（本文稱作P. bracteatum)是一種產(chǎn)生大量的生物堿蒂巴因的多年生罌 粟物種。蒂巴因本身不用于治療，然而，這種生物堿用作制備其他生物堿的給料，包括用作 制備羥考酮的給料。
[0009] 然而，在本領(lǐng)域中認(rèn)識(shí)到，大紅罌粟不產(chǎn)生大量的其他商業(yè)價(jià)值的生物堿，如可待 因、東罌粟堿和/或嗎啡。
[0010] 此外，盡管已經(jīng)利用誘變來(lái)改變由一年生罌粟物種鴉片罌粟（Papaver somniferum)產(chǎn)生的生物堿的類型（例如，參見(jiàn)WO 98/02033)，但是，本發(fā)明人沒(méi)有獲知任 何描述改變大紅罌粟（P. bracteatum)的生物堿類型的報(bào)道。
[0011] 在至少一些罌粟種植地區(qū)（包括澳大利亞的塔斯馬尼亞）影響大紅罌粟的耕作的 更顯著的問(wèn)題是多個(gè)品種在種子萌發(fā)后的第一個(gè)生長(zhǎng)季不產(chǎn)生種皮和大量的生物堿。
[0012] 因此，產(chǎn)生可提取量的可待因、東罌粟堿和/或嗎啡中的一種或多種生物堿的多 年生罌粟植物（諸如大紅罌粟物種）將是特別合乎需要的。此外，在至少溫帶罌粟種植地 區(qū)（如澳大利亞的塔斯馬尼亞），此類耕種品種在萌發(fā)后的第一個(gè)生長(zhǎng)季產(chǎn)生如嗎啡和/或 可待因的生物堿的能力也將是合乎需要的。
[0013] 在本說(shuō)明書(shū)中對(duì)任意現(xiàn)有技術(shù)的引用不是，并且不應(yīng)該視為承認(rèn)或以任何形式暗 示該現(xiàn)有技術(shù)在任何國(guó)家形成常識(shí)的一部分。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 在第一方面，本發(fā)明提供遺傳修飾的大紅罌粟物種的罌粟植物，或其雜交體，其 中，相對(duì)于野生型大紅罌粟，蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因0-脫甲基酶和/或可待因酮還 原酶中的一種或多種的表達(dá)增加，并且，其中相對(duì)于野生型大紅罌粟，所述遺傳修飾的罌粟 植物產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型大紅罌粟，至少蒂巴因 6-0-脫甲基酶的表達(dá)增 加。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，所述罌粟植物包含一種或多種編碼蒂巴因6-0-脫甲基酶、可 待因0-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶的轉(zhuǎn)基因。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種轉(zhuǎn) 基因包含SEQ ID NOs : 1-8,12和13中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)列出的核苷酸序列。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，蒂巴因6-0-脫甲基酶包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基 酸序列。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，所述罌粟植物在溫帶罌粟種植地區(qū)在萌發(fā)后的第一個(gè)生長(zhǎng)季 產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，所述罌粟植物在40° -44°的緯度在萌發(fā)后的第一個(gè)生長(zhǎng)季 產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，所述罌粟植物在澳大利亞的塔斯馬尼亞在萌發(fā)后的第一個(gè)生 長(zhǎng)季產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，所述罌粟植物包括不開(kāi)裂的種皮或開(kāi)裂的種皮。
[0023] 在第二方面，本發(fā)明提供以本發(fā)明第一方面的罌粟植物作為親本的子代植物，其 中，相對(duì)于野生型大紅罌粟，所述子代植物包含蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因0-脫甲基酶 和/或可待因酮還原酶中的一種或多種的增加的表達(dá)，并且，其中相對(duì)于野生型大紅罌粟， 所述子代植物產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0024] 在第三方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一或第二方面的植物的突變體或衍生植物，其 中，相對(duì)于野生型大紅罌粟，所述突變體或衍生植物包含蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因 〇-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶中的一種或多種的增加的表達(dá)，并且，其中相對(duì)于野生 型大紅罌粟，所述突變體或衍生植物產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生 物堿。
[0025] 在第四方面，本發(fā)明提供來(lái)源于本發(fā)明的第一、第二或第三方面中的任一方面的 植物的繁殖材料。在一些實(shí)施方案中，所述繁殖材料包括種子。
[0026] 在第五方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明的第一、第二或第三方面中任一方面的植物產(chǎn) 生的桿。
[0027] 在第六方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明的第一、第二或第三方面中任一方面的植物產(chǎn) 生的桿濃縮物。
[0028] 在第七方面，本發(fā)明提供來(lái)源于本發(fā)明的第一、第二或第三方面中任一方面的植 物的膠乳。
[0029] 在第八方面，本發(fā)明提供一片穩(wěn)定繁殖的本發(fā)明的第一、第二或第三方面中任一 方面的罌粟植物。
[0030] 在第九方面，本發(fā)明提供來(lái)源于本發(fā)明的第一、第二或第三方面中任一方面的植 物的分離的細(xì)胞。
[0031] 在第十方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明第九方面的細(xì)胞中的一種或多種的體外培養(yǎng) 物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)物產(chǎn)生選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0032] 在第十一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿的方 法，所述方法包括種植本發(fā)明第一、第二或第三方面中任一方面的植物，以使所述植物產(chǎn)生 選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿；并且從所述罌粟植物或其部分提取可待因、東 罌粟堿和/或嗎啡。
[0033] 在第十二方面，本發(fā)明提供按照本發(fā)明第十一方面的方法生產(chǎn)的選自可待因、東 罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0034] 在第十三方面，本發(fā)明提供包含一種或多種編碼蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因 〇-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述一種或多種轉(zhuǎn)基因可 操作性地連接到在大紅罌粟中有活性的轉(zhuǎn)錄控制序列上。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種轉(zhuǎn)基因包括SEQ ID NOs : 1-8,12和13中任一 項(xiàng)或多項(xiàng)列出的核苷酸序列。
[0036] 在本發(fā)明第十三方面的一些實(shí)施方案中，所述蒂巴因6-0-脫甲基酶包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列。
[0037] 在第十四方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID NOs :1-8,12和13中任一項(xiàng)列出的核苷酸 序列的分尚的核酸分子。
[0038] 在第十五方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，所述分離的核酸分子選自由下述組 成的組：
[0039] ⑴包含與SEQ ID NOs :1-8,12和13中任一項(xiàng)列出的核苷酸序列至少50%相同 的核苷酸序列的核酸分子；和
[0040] (ii)在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NOs :1-8,12和13中任一項(xiàng)列出的核苷酸序列 的核酸分子雜交的核酸分子。
[0041] 在第十六方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列的分離 的多肽。
[0042] 在第十七方面，本發(fā)明提供包含與SEQ ID NOs :9-11中任一項(xiàng)列出的氨基酸序列 至少50%相同的氨基酸序列的分離的多肽。
[0043] 附圖簡(jiǎn)述
[0044] 圖1是顯示在鴉片罌粟中由蒂巴因生物合成嗎啡的示意圖。T60DM-蒂巴因6-0-脫 甲基酶；CODM-可待因0-脫甲基酶；COR-可待因酮還原酶。
[0045] 圖2時(shí)顯示使用針對(duì)T60DM和CODM基因的引物對(duì)由鴉片罌粟和大紅罌粟分離的 DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳凝膠照片。與凝膠中的每個(gè)泳道相對(duì)應(yīng)的引物組合提供在表2 中。鴉片罌粟基因組DNA作為模板（上圖）；大紅罌粟基因組DNA作為模板（下圖）。
[0046] 圖3是顯示CODM和T60DM基因中用PCR擴(kuò)增圖2種顯示的產(chǎn)物的引物的位置的 示意圖。
[0047] 圖4是T60DM變體（克隆21，22, 23和11)與用于T60DM的參比cDNA序列 (GQ500139)(在比對(duì)中稱為"cDNA"）的核苷酸序列比對(duì)。克隆序列以黑色框出，內(nèi)含子序 列以灰色框出。核苷酸序列差別以白色框出。
[0048] 圖5是由圖4的核苷酸序列編碼的T60DM變體的氨基酸序列比對(duì)。與用于T60DM 的參比cDNA序列（GQ500139)(在比對(duì)中稱為"cDNA"）編碼的氨基酸序列相比較，顯示變體 克隆21、22和23的氨基酸序列。
[0049] 圖6是CODM變體（克隆21)與用于CODM的參比cDNA序列（GQ500141)(在比對(duì) 中稱為"cDNA"）的核苷酸序列比對(duì)。克隆序列以黑色框出，內(nèi)含子序列以灰色框出。核苷 酸序列差別以白色框出。
[0050] 圖7是顯示在實(shí)施例4中產(chǎn)生的T60DM的構(gòu)建體的載體圖譜的示意圖。
[0051] 圖8是顯示在實(shí)施例4中產(chǎn)生的bar (Basta)構(gòu)建體的載體圖譜的示意圖。
[0052] 圖9時(shí)顯示在實(shí)施例4中產(chǎn)生的CODM構(gòu)建體的載體圖譜的示意圖。
[0053] 圖10是顯示在實(shí)施例4中產(chǎn)生的CORL 1構(gòu)建體的載體圖譜的示意圖。
[0054] 圖11提供證明大紅罌粟var PB-I的愈傷組織誘導(dǎo)和植物再生的照片。（A)8周后 來(lái)自種子的愈傷組織；(B) 20周后莖再生；（C) 24周后具有根的小植株；(D，E和F)在分別用 35S: :Basta、35S: :C0DM和35S: :T60DM進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化后，在選擇條件下的新的 愈傷組織生長(zhǎng)。
[0055] 發(fā)明描述
[0056] 在本文中核苷酸和氨基酸序列由序列標(biāo)識(shí)號(hào)（SEQ ID NO :)表示。表1中提供了 序列識(shí)別的概述。在本說(shuō)明書(shū)終了提供序列表。
[0057] 表 1
[0058] 序列標(biāo)識(shí)的概述
[0059]
【權(quán)利要求】
1. 遺傳修飾的大紅II粟（Papaver bracteatum)物種的II粟植物，或其雜交體，其中， 相對(duì)于野生型大紅罌粟（P. bracteatum)，蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因0-脫甲基酶和/或 可待因酮還原酶中的一種或多種的表達(dá)增加，并且，其中相對(duì)于野生型大紅罌粟，所述遺傳 修飾的罌粟植物產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
2. 權(quán)利要求1的罌粟植物，其中，相對(duì)于野生型大紅罌粟，至少蒂巴因6-0-脫甲基酶的 表達(dá)增加。
3. 權(quán)利要求1或2的罌粟植物，其中所述罌粟植物包含編碼蒂巴因6-0-脫甲基酶、可 待因0-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶的一種或多種轉(zhuǎn)基因。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的罌粟植物，其中所述罌粟植物包含編碼蒂巴因6-0-脫甲基 酶的一種或多種轉(zhuǎn)基因。
5. 權(quán)利要求4的罌粟植物，其中所述一種或多種轉(zhuǎn)基因包含SEQ ID N0s:l-8,12和13 中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)列出的核苷酸序列。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)或多項(xiàng)的罌粟植物，其中所述蒂巴因6-0-脫甲基酶包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的罌粟植物，其中所述植物在溫帶罌粟種植地區(qū)在萌發(fā)后的 第一個(gè)生長(zhǎng)季產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的罌粟植物，其中所述植物在40° -44°的緯度在萌發(fā)后的 第一個(gè)生長(zhǎng)季產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
9. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的罌粟植物，其中所述植物在澳大利亞的塔斯馬尼亞在萌 發(fā)后的第一個(gè)生長(zhǎng)季產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
10. 權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的罌粟植物，其中所述植物包括不開(kāi)裂的種皮。
11. 權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的罌粟植物，其中所述植物包括開(kāi)裂的種皮。
12. 以權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的罌粟植物作為親本的子代植物，其中，相對(duì)于野生型 大紅罌粟，所述子代植物包含蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因0-脫甲基酶和/或可待因酮還 原酶中的一種或多種的增加的表達(dá)，并且，其中相對(duì)于野生型大紅罌粟，所述子代植物產(chǎn)生 增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
13. 權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的植物的突變體或衍生植物，其中，相對(duì)于野生型大紅罌 粟，所述突變體或衍生植物包含蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因0-脫甲基酶和/或可待因酮 還原酶中的一種或多種的增加的表達(dá)，并且，其中相對(duì)于野生型大紅罌粟，所述突變體或衍 生植物產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
14. 來(lái)源于權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的植物的繁殖材料。
15. 權(quán)利要求14的繁殖材料，其中所述繁殖材料包括種子。
16. 由權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的植物產(chǎn)生的桿。
17. 由權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的植物或由權(quán)利要求16的桿產(chǎn)生的桿濃縮物。
18. 來(lái)源于權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的植物的膠乳。
19. 一片穩(wěn)定繁殖的權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的罌粟植物。
20. 來(lái)源于權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的植物的分離的細(xì)胞。
21. 包含權(quán)利要求20的細(xì)胞中的一種或多種的體外培養(yǎng)物。
22. 權(quán)利要求21的體外培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物產(chǎn)生選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡 的生物堿。
23. -種生產(chǎn)選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿的方法，所述方法包括種植權(quán) 利要求1-13中任一項(xiàng)的植物，以使所述植物產(chǎn)生選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物 堿；并且從所述罌粟植物或其部分提取所述可待因、東罌粟堿和/或嗎啡。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法產(chǎn)生的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
25. 包含編碼蒂巴因 6-0-脫甲基酶、可待因 0-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶的一種 或多種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述一種或多種轉(zhuǎn)基因可操作性地連接到在大紅罌粟中 有活性的轉(zhuǎn)錄控制序列。
26. 權(quán)利要求25的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述一種或多種轉(zhuǎn)基因包含SEQ ID NOs : 1-8,12 和13中任一項(xiàng)或多項(xiàng)列出的核苷酸序列。
27. 權(quán)利要求25或權(quán)利要求26的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述蒂巴因 6-0-脫甲基酶包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列。
28. 包含SEQ ID NOs :1-8,12和13中任一項(xiàng)中列出的核苷酸序列的分離的核酸分子。
29. -種分離的核酸分子，其選自由下述組成的組： (i) 包含與SEQ ID NOs : 1-8,12和13中任一項(xiàng)列出的核苷酸序列至少50%相同的核 苷酸序列的核酸分子；和 (ii) 在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NOs :1-8,12和13中任一項(xiàng)列出的核苷酸序列的核 酸分子雜交的核酸分子。
30. 包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列的分離的多肽。
31. 包含與SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列至少50%相同的氨基酸序列的分 離的多肽。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK104487576SQ201280073863
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2012年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月30日
【發(fā)明者】賈斯廷·泰勒·庫(kù)姆斯, 賈羅德·戴維·里奇, 馬克·阿爾弗雷德·特斯特, 達(dá)明·萊特富特, 迪帕·杰哈 申請(qǐng)人:Tpi企業(yè)有限公司