專利名稱：丹波黑大豆SGF14a基因的植物表達載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丹波黑大豆(簡稱RB)的14-3-3a基因(5GF7辦)的植物表達載體及其在提高植物耐鋁能力中的應(yīng)用，屬于植物分子基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
14-3-3蛋白最早是在動物腦組織中發(fā)現(xiàn)的，根據(jù)其在DEAE中的遷移率將其命名為14-3-3蛋白，起初被認識是腦組織中特異性蛋白。最近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3蛋白存在于所有真核生物中，包括動物、植物和微生物。植物14-3-3蛋白是一個大的基因家族，存在很多不同的亞型。擬南芥中存在12種不同亞型的14-3-3基因，煙草中有12種，水稻中有6種，大豆中存在18種14-3-3基因，其中有16種能夠發(fā)生轉(zhuǎn)錄，并且不同亞型的14_3_3基因表達還存在明顯的組織特異性。植物14-3-3蛋白通常以同源或異源二聚體的形式存在，并且能夠與磷酸化靶蛋白相互作用，調(diào)節(jié)一系列生物過程，如代謝、生長、發(fā)育和信號傳導(dǎo)途徑等。植物14-3-3蛋白能夠參與多種生物過程的調(diào)節(jié)。14-3-3蛋白能夠參與GA、ΑΒΑ、BR和乙烯等植物激素信號通路來調(diào)控植物生長發(fā)育過程。植物14-3-3蛋白在調(diào)控植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)代謝過程中也發(fā)揮著重要作用，14-3-3蛋白能夠通過調(diào)節(jié)NR、SPS和GS等代謝酶的活性來調(diào)控植物體內(nèi)碳氮代謝過程。并且14-3-3蛋白也能夠調(diào)節(jié)質(zhì)膜中的K+泵和H+-ATPase酶的活性來維持細胞內(nèi)外電化學梯度，來調(diào)控植·物體內(nèi)的物質(zhì)運輸過程。同時，植物14-3-3蛋白通過調(diào)節(jié)葉片中質(zhì)膜H+-ATPase的活性，來調(diào)控氣孔的開閉，從而對滲透脅迫作出響應(yīng)。植物14-3-3蛋白也能夠參與多種脅迫的應(yīng)答。在逆境脅迫的條件下，植物14-3-3蛋白也能對多種生物和非生物脅迫作出應(yīng)答，包括鹽脅迫、磷缺乏、干旱脅迫、冷脅迫和重金屬脅迫等非生物脅迫，以及損傷和病原菌侵染等生物脅迫。用鹽和冷處理的水稻愈傷組織和幼苗中整個14-3-3基因家族的表達上調(diào)。此外，其他的脅迫包括熱、氧化和重金屬對水稻OsGFM基因的表達也有不同程度的影響，必和OsGFMg幾乎可以被所有的脅迫誘導(dǎo)，水稻經(jīng)損傷處理48h后能夠降低0sGF14e基因的表達。磷饑餓使擬南芥中14-3-3y、m的轉(zhuǎn)錄水平下降。長期的鉀缺乏導(dǎo)致擬南芥中14_3_3c、j的蛋白表達水平下降，14-3-3 的蛋白表達水平增加。另外，14-3-3蛋白在植物免疫響應(yīng)中具有重要作用。在Cf9/Avr9介導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答中10個番茄14_3_3基因中有3個能夠被特異性誘導(dǎo)表達。最近研究表明，擬南芥14-3-3蛋白能夠與RPW8. 2蛋白相互作用，在R蛋白介導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。最近，許多研究者通過基因工程的手段增強或抑制植物14-3-3蛋白的表達來研究其功能。在馬鈴薯中過量表達14-3-3蛋白能夠改變脂類、氨基酸和礦物質(zhì)的組成，并且提高抗氧化能力提高，而抑制14-3-3蛋白的表達則出現(xiàn)相反的結(jié)果。在水稻中過量表達玉米的基因后能夠增強水稻的抗旱能力，并且在棉花中過量表達擬南芥的
基因后能夠使棉花保持“常青”及增強了棉花對干旱脅迫的耐受。通過反義技術(shù)抑制擬南芥14-3-3蛋白的表達，促進了葉片中淀粉的積累及增加了植物的生長。
全世界大約有50%的可耕地屬于酸性土壤，而鋁毒是酸性土壤中限制作物生長的主要因素之一。鋁毒早期最明顯的癥狀是抑制根尖細胞生長和細胞分裂，從而抑制根生長，導(dǎo)致根系損傷，影響水分和養(yǎng)分的吸收，限制了植物的生長。近年來許多研究者都致力于植物耐鋁機制的研究，目前的研究的結(jié)果表明能適應(yīng)酸性土壤生長的植物有兩種耐鋁機制外部排斥機制和內(nèi)部耐受機制。外部排斥機制是根尖對鋁的排斥，將鋁阻止在細胞外；主要包括鋁誘導(dǎo)有機酸分泌、根際PH的升高和細胞壁對鋁離子的固定等。內(nèi)部耐受機制主要是利用有機酸在共質(zhì)體中螯合鋁離子從而賦予植物對鋁的耐受能力，減小鋁的毒害。因此無論是外部排斥機制還是內(nèi)部耐受機制都涉及到有機酸的參與，可見有機酸在緩解鋁毒方面具有重要的作用。在鋁脅迫下，許多鋁耐受型的植物能夠分泌不同的有機酸，從而抵御鋁的毒害。例如，在鋁脅迫后，大豆和玉米能夠分泌檸檬酸、蕎麥能夠分泌草酸、鋁耐受型小麥能夠分泌蘋果酸。植物質(zhì)膜H+-ATPase是細胞膜上含量最豐富的蛋白，是植物生長所必須的，能夠參與多種脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)，包括對鋁毒和磷缺乏的調(diào)節(jié)等。并且，質(zhì)膜H+-ATPase主要是通過調(diào)節(jié)有機酸的分泌來調(diào)控植物對鋁脅迫的應(yīng)答。Shen等(2005)研究表明大豆能夠通過增加質(zhì)膜H+-ATPase基因表達、促進質(zhì)膜H+-ATPase翻譯后磷酸化，最終增強了大豆根尖檸檬酸的分泌，從而賦予了大豆對鋁的高度耐受。而多年來的研究結(jié)果表明14-3-3蛋白在調(diào)節(jié)質(zhì)膜H+-ATPase的活性中發(fā)揮著重要作用。質(zhì)膜H+-ATPase是14_3_3蛋白在質(zhì)膜上的主要結(jié)合祀點，14-3-3蛋白能夠通過與質(zhì)膜H+-ATPase的C末端結(jié)合而維持其磷酸化的穩(wěn)定性并增加其活性。然而目前有關(guān)14-3-3蛋白能否參與鋁脅迫應(yīng)答的研究報道非常少，還缺少具體可信的實驗數(shù)據(jù)來確信14-3-3蛋白在鋁脅迫應(yīng)答中的作用。并且關(guān)于鋁脅迫下14-3-3蛋白能否參與調(diào)節(jié)質(zhì)膜H+-ATPase活性的研究還未見報道。本發(fā)明技術(shù)是通過Gateway技術(shù)構(gòu)建植物表達載體PK-35S-515F7辦，為研究大豆SGFMa基因在植物耐鋁機制中的作用提供了有效的分子基因工程技術(shù)工具，方便了利用分子生物學的手段研究大豆辦基因的功能。以及通過該載體轉(zhuǎn)染野生型煙草所獲得的轉(zhuǎn)辦基因的煙草在提高煙草耐鋁能力中的應(yīng)用，為通過基因工程的方法提高植物耐鋁能力奠定了理論基礎(chǔ)。同時，本發(fā)明中所獲得的結(jié)果能夠為我們通過基因工`程手段提高植物耐鋁能力提高了更多的基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過Gateway技術(shù)構(gòu)建丹波黑大豆(RB)的#Ha基因{SGF14a)的植物表達載體pK-35S-515F7辦，該載體中SGF14a基因在35S組成型啟動子的控制下表達，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將該植物表達載體轉(zhuǎn)入野生型煙草中后，外源SGFMa基因在35S組成型啟動子控制下能夠準確高效表達，同時獲得的轉(zhuǎn)基因煙草的耐鋁能力及耐受酸性土壤的能力也明顯提高。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方法1、外源515F7辦基因的獲得
根據(jù)GenBank上發(fā)表的大豆辦)基因全長序列，設(shè)計如下特異性引物 SGF14a 上游5’ -AAGCTTATGTCGGATTCTTCTCGGGAGGAG-3> (含 HindIII 酶切位點) SGF14a 下游5，-CTCGAGCTATTCACCTGGTTGTTGCTTAGAT-3，(含有 XhoI 酶切位點)2、植物表達載體ρΚ-355-5Κ^Μ3的構(gòu)建
Gateway (通路克隆)技術(shù)的LR反應(yīng)構(gòu)建目的基因的表達載體時，通過重組過程將外源基因連入植物表達載體PK2GW7. O中，不需要經(jīng)過復(fù)雜的限制性內(nèi)切酶的酶切和連接酶的連接過程,只需要把入門克隆載體和目的載體的質(zhì)粒DNA混合并加入DNA整合或切離所需要的酶就能夠完成目的基因表達載體的構(gòu)建，因此用Gateway技術(shù)構(gòu)建目的基因的表達載體不僅成功幾率高，而且可以節(jié)省很多時間。因此，本文利用該技術(shù)來構(gòu)建目的基因辦的植物表達載體。構(gòu)建策略如圖3所示，以大豆cDNA為模板，用51^7辦基因的特異性引物，通過RT-PCR的方法擴增獲得SGFMa基因的全長。然后通過T/A克隆獲得pMD18T_515F7辦載體，對獲得的陽性克隆進行測序檢測外源基因辦是否發(fā)生突變，再經(jīng)過HindIII和XhoI雙酶切pMD18T-5iF7^3和pENTR載體，將SGFMa基因片段亞克隆到pENTR載體上，形成入門克隆載體PENTR-515F7辦。最后，在LR Mix Enzyme的作用下，入門克隆載體PENTR-515F7辦和植物載體pK2GW7. O進行LR反應(yīng)，形成植物表達載體簡稱pK-35S-515F7辦。、植物表達載體PK-35S-515F7辦轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及轉(zhuǎn)基因煙草篩選
通過電轉(zhuǎn)化法將植物表達載體PK-35S-515F7辦轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌pMP105菌中，經(jīng)壯觀霉素(Spe)篩選得到陽性克隆，經(jīng)菌液PCR檢測陽性克隆中是否含有外源植物表達載體^hS-SGFMa質(zhì)粒。然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)染野生型煙草，將轉(zhuǎn)染后的葉片在含有篩選因子Km (卡那抗生素WPCef (頭孢噻肟鈉抗生素)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS4固體上誘導(dǎo)外植體發(fā)芽，約15天繼代一次。待有芽生成后，將芽從外植體上切下轉(zhuǎn)入含Km和Cef的生根培養(yǎng)基MS上，進行根誘導(dǎo)生長，得到的能夠抗Km的煙草幼苗還需進一步在基因和蛋白水平上檢測外源基因是否正確表達。、轉(zhuǎn)基因煙草的檢測
經(jīng)Km篩選得到的能夠抗Km的煙草植株，用CTAB法提取其基因組，分別以野生型煙草和轉(zhuǎn)基因型煙草基因組為模板，用外源基因辦的特異性引物，經(jīng)過PCR分析檢測，外源基因是否插入到野生型煙草 基因組中。用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的RNA，在反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以SGFMa基因的特異性引物，經(jīng)過RT-PCR法檢測外源基因515F7辦能夠正確轉(zhuǎn)錄。最后通過Western-blotting法從蛋白水平上分析外源基因在煙草中的表達情況。、轉(zhuǎn)基因煙草耐鋁能力分析
由于我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鋁脅迫能夠誘導(dǎo)RB根中SGF14a基因的表達，因此我們在野生型煙草中過量表達來自RB飽SGFMa基因后，考察轉(zhuǎn)基因煙草對鋁脅迫的響應(yīng)情況。將生長一致的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草在水培條件下培養(yǎng)2周后，再用50μΜ的AlCl3 (ρΗ4. 3)處理24h后，檢測煙草根相對生長量的變化，以及鋁脅迫后野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性總蛋白、MDA和H2O2含量的變化。最后，由于鋁毒是酸性土壤中限制作物生長的主要因素之一，因此為了模擬在實際生產(chǎn)中本發(fā)明的應(yīng)用，我們將野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草在酸性土壤中培養(yǎng)，觀察其在酸性土壤中的生長情況，考察本發(fā)明在實際生長條件下是否具有潛在的利用價值。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點和技術(shù)效果如下
本發(fā)明提供的植物表達載體為進一步研究辦對鋁脅迫的應(yīng)答提供了更好的基因工程操作手段和工具，以及通過該載體轉(zhuǎn)染野生型煙草所獲得的轉(zhuǎn)辦基因的煙草擴大了在增強作物對酸性土壤耐受性及在提高煙草耐鋁能力中的應(yīng)用，為通過基因工程的方法提高植物耐鋁能力奠定了理論基礎(chǔ)。同時，本發(fā)明中所獲得的結(jié)果能夠為我們通過基因工程手段提高植物耐鋁能力奠定理論基礎(chǔ)以及提供更多的基因資源。


圖1為本發(fā)明中鋁脅迫下SGF14a基因轉(zhuǎn)錄水平變化電泳示意 圖2為本發(fā)明中外源515F7辦基因的獲得電泳示意圖；其中A ..SGFMa基因PCR產(chǎn)物；B ..SGFMa 基因 PCR 膠回收，圖中 M Maker III ；
圖3為本發(fā)明中植物表達載體ρΚ-355-5Κ^Μ3的構(gòu)建策略示意 圖4為本發(fā)明中TA克隆載體ρΜ0-18Τ-5Κ^7辦的檢測電泳示意圖；其中A :pMD18T-515F743酶切檢測，圖中1_4表示不同質(zhì)粒的編號，對照是沒有經(jīng)過酶切；B :ΡΜ 18 -SGFl4a質(zhì)粒和菌液PCR檢測，圖中M為Maker III ；
圖5為本發(fā)明中入門克隆載體pENTR-515F7辦的檢測電泳示意圖，其中A是2B(pENTR)和pMD18T-5^F7^3的HindIII和XhoI雙酶切后膠回收產(chǎn)物；B是入門克隆載體PENTR-515F7辦雙酶切檢測，圖中1_4表示不同質(zhì)粒的編號，對照是沒有經(jīng)過酶切；C是入門克隆載體pENTR-5iF7^3菌液和質(zhì)粒PCR檢測，圖中M為Maker III ；
圖6為本發(fā)明中植物表達載體pK-35S-515F7辦的檢測電泳示意圖，其中A是植物表達載體的HindIII和XhoI雙酶切以及HindIII單酶切檢測，圖中A-D表示不同編號質(zhì)粒經(jīng)過HindIII和XhoI雙酶切，a-d表示不同編號質(zhì)粒經(jīng)HindIII單酶切；B是植物表達載體pK-35S-5^F7辦的質(zhì)粒和菌液PCR檢測，圖中M =Maker III ；
圖7為本發(fā)明中植物表達載體pK-35S-5K^M3電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌pMP105后的菌液PCR檢測電泳示意圖；其中1-6是獲得的不 同農(nóng)桿菌單菌落編號，圖中對照為沒有加農(nóng)桿菌單菌落;M為 Maker III ；
圖8是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因煙草的篩選流程示意 圖9是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定電泳示意圖，其中A是基因組PCR檢測示意圖，圖中負對照是沒有加基因組；CK是以ρΚ-355-5Κ^7辦的質(zhì)粒為模板，作為正對照；WT :野生型煙草；4、9、11、12、13、19和23是獲得的不同的轉(zhuǎn)基因柱系；M :Maker III ;B是轉(zhuǎn)基因植物的RT-PCR檢測示意圖，圖中WT :野生型煙草；4、9、11、12、13、19和23是獲得的不同的轉(zhuǎn)基因柱系；M :Maker III ;C是轉(zhuǎn)基因煙草Western-blotting檢測示意圖，圖中WT :野生型煙草；S1US19和S23是最終獲得的轉(zhuǎn)SGFMa基因煙草植株；
圖10是本發(fā)明鋁脅迫處理后轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草相對根生長量和根中可溶性總蛋白含量的變化示意圖，其中A是野生型煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(S11、S19和S23)經(jīng)50μΜ的A1C13溶液處理24h后根相對生長量(RRG)的變化示意圖；B是野生型煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(S11、S19和S23)經(jīng)50μΜ的A1C13溶液處理24h后可溶性總蛋白含量變化示意圖；圖11是本發(fā)明鋁脅迫處理后轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草根中丙二醛和H2O2含量的變化，其中A是野生型煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(Sll、S19和S23)經(jīng)50μΜ的AlCl3溶液處理24h后MDA變化示意圖；B是野生型煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(Sll、S19和S23)經(jīng)50μΜ的AlCl3溶液處理24h后H2O2的變化示意 圖12是本發(fā)明酸性土壤中轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的生長30天的狀況示意圖，圖中WT是是野生型煙草；S11、S19和S23是獲得的不同轉(zhuǎn)基因柱系；
圖13是本發(fā)明酸性土壤中轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的生長90天的狀況示意圖，圖中WT是是野生型煙草；S11、S19和S23是獲得的不同轉(zhuǎn)基因柱系。
具體實施例方式本實施中采用的試劑主要分為分子生物學實驗試劑。各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購自博大泰克生物技術(shù)有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。所有引物序列均在大連寶生物公司合成。本發(fā)明實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1 :外源SGF14a基因的獲得
(I)鋁脅迫下SGF14a基因的表達水平檢測
選取水培2周的生長一致的丹波黑大豆(RB)幼苗，先用pH4. 3的O. 5mM CaCl2預(yù)處理過夜后，然后置 于50μΜ的AlCl3溶液(含有O. 5mM CaCl2, pH 4. 3)分別處理O (CK)、2、4、8、12和24 h后，收集的O. 3g的1-2 cm根尖樣品，速用液氮凍存，使用Trolz試劑盒提取根尖總RNA，用DNase消化RNA中可能殘留的DNA，經(jīng)苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)抽提純化。從各 RNA 樣品中取 5Kg,用 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega 公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行RT-PCR擴增，以28s rRNA為內(nèi)參進行RT-PCR分析。根據(jù)SGF14a基因序列設(shè)計引物為5-AGGTTGAGGAGTTGACGGTGGA-3，下游5-GCGGATGGGATGAGGTTGGAC-3 ；28S rRNA 的引物序列上游5-CCCGTCTCAGATTGGTGTCATT_3，下游5-ATAGCGAGCAAGTCGGTGGATT-3。結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，隨著鋁處理時間的延長，SGF14a呈現(xiàn)出逐漸上升的表達的趨勢，這說明在鋁脅迫下，能夠顯著誘導(dǎo)SGF14a基因的表達。(2)外源SGF14a基因的克隆
提取RB根中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用帶有合適酶切位點的SGF14a基因引物擴增獲得的基因片段。引物序列上游為5_AAGCTTATGTCGGATTCTTCTCGGGAGGAG-3 (含 HindIII 酶切位點)，下游為5_CTCGAGCTATTCACCTGGTTGTTGCTTAGAT-3 C^XhoI酶切位點)。實驗結(jié)果如圖2顯示，從圖中可以看出PCR產(chǎn)物大小大約在O. 8Kb(圖2A)，與目的基因SGF14a的大小(774)類似。然后將PCR產(chǎn)物切膠，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物(圖2B)，以便后續(xù)的T/A克隆。實施例2 :植物表達載體pK-35S-515F7辦的構(gòu)建 (1)T/A克隆載體的構(gòu)建
植物表達載體的構(gòu)建策略如圖3所示，將經(jīng)膠回收得到的PCR產(chǎn)物(兩端帶有HindIII和XhoI酶切位點)，在T4-DNA連接酶的作用下與pMD-18T載體進行連接，得到重組載體ΡΜ 18 -SGFMa0然后通過酶切和PCR來檢測重組載體pMD18T_515F7辦是否連接正確。由于SGFMa基因兩端含有HindIII和XhoI酶切位點，用這兩個酶酶切重組載體的質(zhì)粒，如果連接正確能夠酶切出與目的基因大小類似的片段O. 8Kb (圖4A)。同時，經(jīng)過菌液和質(zhì)粒PCR檢測發(fā)現(xiàn)都能夠擴增出與目的基因大小類似的片段O. 8Kb (圖4B)，而負對照并不能擴增出目的基因大小的片段。
(2)入門克隆載體pENTR_SGF14a載體的構(gòu)建
用HindIII和XhoI雙酶切pMD18T-5^F7辦載體和原始入門克隆載體pENTR_2B，經(jīng)過膠回收試劑盒分別回收酶切后的SGFMa和2B片段，結(jié)果如圖5A所示。然后在T4-DNA連接酶的作用下將這兩個回收的片段連接，得到入門克隆載體pENTR-5^F7辦，最后在經(jīng)過HindIII和XhoI雙酶切和PCR檢測該入門克隆載體pENTR_515F7辦連接是否正確。雙酶切結(jié)果顯示入門克隆載體酶切后能夠切出與目的基因大小類似的片段O. 8Kb (圖5B)，并且質(zhì)粒和菌液PCR檢測都能夠擴增出目的基因大小的片段(圖5C)，這與預(yù)期結(jié)果是一致的。
(3)最終植物表達載體ρΚ-355-5Κ^7辦的構(gòu)建
在LR mix enzyme的作用下，將入門克隆載體pENTR-515F7辦與植物表達載體pK2WG7. O進行LR重組反應(yīng)。然后對獲得的重組反應(yīng)后的最終植物表達載體進行酶切和PCR檢測。LR反應(yīng)步驟為在Gateway的LR反應(yīng)體系中加入pENTR-515F743和Gateway的目的載體pK2GW7. O 各 150 ng, I μ L LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen),混均勻于 25°C反應(yīng)過夜，通過整合酶的作用把515F7辦基因整合到PK2GW7中，獲得515F7辦的植物表達載體卩1(-355-5斯7辦。由于在？1(2167.0載體上含有把11(1111酶切位點，如果外源目的基因51^7辦(兩端帶有HindIII和XhoI酶切位點)正確重組進入pK2WG7. O中，則經(jīng)過HindIII和XhoI雙酶切后能夠得到O. 8Kb和O. 4Kb (片段太短酶切后不易觀察到)片段，以及經(jīng)過HindIII單酶切后能夠得到1. 2Kb的片段，酶切后的結(jié)果與預(yù)期都一致(圖6A)。菌液和質(zhì)粒PCR后也擴增到了與目的基因大小一致的O. 8Kb片段(圖6B)。實施例3 :植物表達載體pK-35S_SGF14a的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及轉(zhuǎn)基因煙草篩選
取少量檢測正確的植物表達載體PK-35S-515F7辦質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀滑槽中，電擊后，立即取出電轉(zhuǎn)化杯迅速加入O. 5mL SOC培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中；28°C 200rpm搖床培養(yǎng)3_5h ;室溫下,7500rpm離心Imin,棄其上清至100 μ I將細胞懸?。粚⒓毦坎紟в锌股氐腖B固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2天；挑選陽性克隆，進行菌液PCR檢測，菌液PCR擴增結(jié)果中可以看到能夠得到O. 8Kb的大小片段(見圖7,表 I)。
權(quán)利要求
1.一種丹波黑大豆基因的植物表達載體pK-35S-515F743，其特征在于該載體通過Gateway技術(shù)構(gòu)建，該載體中含有35S組成型啟動子和SGFMa基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述丹波黑大豆SGFMa基因的植物表達載體pK-35S_515F7辦，其特征在于'SGFMa基因來源于丹波黑大豆，其GenBank登錄號為HM004359。
3.權(quán)利要求1所述的丹波黑大豆515F7辦基因的植物表達載體pK-35S-515F7辦在增強作物對酸性土壤耐受性及提高作物耐鋁能力中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種丹波黑大豆SGF14a基因的植物表達載體及其應(yīng)用，本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)在鋁脅迫下RB根中SGF14a基因被顯著誘導(dǎo)表達，然后從RB根中克隆得到SGF14a基因的全長序列，并通過Gateway技術(shù)構(gòu)建了植物表達載體pK-35S-SGF14a，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型煙草，篩選得到能夠正確表達SGF14a基因的轉(zhuǎn)基因煙草，最后對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草進行了耐鋁能力分析。實驗結(jié)果表明在煙草中過量表達外源SGF14a基因能夠顯著提高煙草的耐鋁及耐受酸性土壤能力。本發(fā)明中首次報道SGF14a基因能夠參與鋁脅迫應(yīng)答，并且通過Gateway技術(shù)構(gòu)建的植物表達載體pK-35S-SGF14a和獲得的轉(zhuǎn)基因煙草能夠為進一步研究SGF14a基因的在鋁脅迫應(yīng)答中的功能奠定基礎(chǔ)，以及為研究鋁脅迫應(yīng)答機制提供了新的基因資源和基因工程操作手段。
文檔編號C12N15/82GK103045640SQ20131000046
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月4日
發(fā)明者陳麗梅, 郭傳龍, 李松, 周磊, 王琳 申請人:昆明理工大學