一種采用實(shí)時(shí)定量pcr技術(shù)檢測(cè)茶樹(shù)cbf1基因表達(dá)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR技術(shù))檢測(cè)不同處理下茶樹(shù)CBF1(CsCBF1)基因相對(duì)表達(dá)量的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。包括茶苗處理、所取組織RNA提取、cDNA合成、內(nèi)參基因選擇、熒光定量引物設(shè)計(jì)、熒光定量PCR反應(yīng)及CsCBF1基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算七個(gè)主要步驟。其特點(diǎn)是以不同處理下茶樹(shù)葉片cDNA為模板，甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(glyceraldehyde-3-phos-phate?dehydrogenase，GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參基因，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)，在mRNA水平上對(duì)CsCBF1進(jìn)行相對(duì)定量分析，為研究CsCBF1基因表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法所需時(shí)間短，且可以同時(shí)分析不同環(huán)境處理下CsCBF1基因的表達(dá)變化情況，找出能顯著誘導(dǎo)CsCBF1基因表達(dá)的條件，操作方法簡(jiǎn)單，所得結(jié)果具有重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】—種采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)茶樹(shù)CBF1基因表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā) 明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及用于檢測(cè)CsCBFl基因表達(dá)的特異性引物，更具體的說(shuō)一種采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR技術(shù))檢測(cè)不同處理下，CsCBFl基因相對(duì)表達(dá)量的方法。主要用于CsCBFl基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究。
技術(shù)背景
[0002]轉(zhuǎn)錄因子CBF(C-repeat_binding factor)廣泛存在于各種植物中，在低溫逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，能夠感受上游傳遞的低溫信號(hào)，激活冷誘導(dǎo)(和)或脫水誘導(dǎo)基因的表達(dá)，從而引起植物體內(nèi)的多種生理生化變化，并產(chǎn)生一定的抗寒、抗旱和耐鹽能力，是植物抗逆過(guò)程中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。已有研究表明，CBF基因的表達(dá)不僅受低溫誘導(dǎo)，而且也與機(jī)械損傷、干旱、高滲透壓等逆境脅迫有密不可分的聯(lián)系，同時(shí)一些與抗冷密切相關(guān)的植物激素(如ΑΒΑ、乙烯、油菜素內(nèi)酯等)對(duì)CBF基因的表達(dá)也有調(diào)控作用。而CsCBFl基因表達(dá)與其發(fā)揮作用的機(jī)理仍不清楚。我們應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立檢測(cè)CsCBFl基因mRNA表達(dá)水平的方法，對(duì)于闡明CsCBFl基因表達(dá)的作用機(jī)理具有一定指導(dǎo)作用。
[0003]在分子生物學(xué)領(lǐng)域，很多方法都可以用來(lái)進(jìn)行靶基因的定量研究，這些方法包括Northern/Southern雜交、高效液相色譜(HPLC)、PCR-ELISA、RNA酶保護(hù)分析、原位雜交等。但這些方法均存在耗時(shí)、費(fèi)力、敏感性差、需要運(yùn)用放射性元素或潛在交叉污染的可能性等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)茶樹(shù)CBFl基因表達(dá)的方法，從而為闡明CsCBFl基因表達(dá)的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0006]一種采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)茶樹(shù)CBFl基因表達(dá)的方法，其特征在于包括茶苗處理、所取組織RNA提取、cDNA合成、內(nèi)參基因選擇、熒光定量引物設(shè)計(jì)及熒光定量PCR反應(yīng)、CsCBFl基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算七個(gè)主要步驟，具體操作方法如下:
[0007](1)實(shí)驗(yàn)材料的處理:將茶苗進(jìn)行4°C、_5°C、干旱、激素處理，分別于不同時(shí)間(O、
0.5h、lh、2h、4h、8h、16h、24h、48h)進(jìn)行取樣，迅速用液氮收集，_70°C保存，備用；
[0008](2)總RNA的提取與純化:取不同處理下的茶樹(shù)葉片，利用RNA提取試劑盒，從茶樹(shù)葉片中提取得到純化的總RNA ；
[0009](3) cDNA第一鏈的合成:以茶樹(shù)葉片總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系為20ul ；
[0010](4)內(nèi)參基因的選擇:內(nèi)參須滿足:①在研究中樣本之間的表達(dá)是相似的；②處理因素不會(huì)影響其表達(dá)與待測(cè)基因同時(shí)進(jìn)行相同的擴(kuò)增等要求。
[0011](5)熒光定量引物設(shè)計(jì):根據(jù)CsCBFl基因序列設(shè)計(jì)符合熒光定量PCR反應(yīng)特點(diǎn)的特異引物:[0012]yF:5’ -TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3’ ；
[0013]yR:5，-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3，；
[0014]以及作為內(nèi)參基因的GAPDH特異上下游引物:
[0015]GAPDH-F:5，-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3，
[0016]GAPDH-R:5，-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3
[0017](6)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:以上述(3)中合成的cDNA第一鏈為模板，上述(5)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R為特異性引物，其中每條引物分別配制成IOu mol/L的工作濃度。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反映，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增后所得到3個(gè)重復(fù)管的Ct值取平均數(shù)；
[0018](7)不同處理下，CsCBFl基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算:實(shí)時(shí)熒光定量PCR完成后，根據(jù)Ct值計(jì)算每種處理不同時(shí)間下的ACt、Δ ACt、2_""et值，計(jì)算方式如下:[0019]ACt = Ct (CsCBFl 基因)_Ct(GAPDH 基因)
[0020]A ACt = Λ Ct (處理N小時(shí))-Λ Ct (處理O小時(shí))
[0021]以2_ΔΔΜ數(shù)值表示處理時(shí)間N小時(shí)時(shí)，CsCBFl基因相對(duì)于GAPDH基因的表達(dá)量。
[0022]本發(fā)明更加詳細(xì)的試驗(yàn)方法如下:
[0023](I)實(shí)驗(yàn)材料的處理:將兩年生扦插苗烏牛早移至營(yíng)養(yǎng)缽中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周，培養(yǎng)條件:白天25°C (16h)，晚上18°C (8h)。然后進(jìn)行如下處理:
[0024]A.低溫處理:以正常生長(zhǎng)條件下(25°C )培養(yǎng)的茶苗為對(duì)照，在光照培養(yǎng)箱中對(duì)茶苗進(jìn)行4、-5°C低溫處理(無(wú)光照)，處理0、0.5h、lh、2h、4h、8h、16h、24h、48h分別取一芽?jī)扇~,迅速用液氮收集，-70保存,備用。
[0025]B.脫水處理:向生長(zhǎng)植株的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)一次性澆以15% -30%的PEG600溶液20ml，對(duì)照組澆以等量的蒸餾水；處理0、0.5h、lh、2h、4h、8h、16h、24h、48h分別取一芽?jī)扇~，迅速
用液氮收集，-70保存，備用。
[0026]C.激素處理:油菜素內(nèi)酯(BR)處理:在25°C條件下向茶苗噴施0.1-1.5mg/L的BR溶液處理0、0.5h、lh、2h、4h、8h、16h、24h、48h分別取一芽?jī)扇~，迅速用液氮收集，-70保
存，備用。
[0027](2)總RNA的提取與純化:EASY spin植物RNA快速提取試劑盒，從所取的一芽?jī)扇~中提取得到總RNA。
[0028](3)cDNA第一鏈的合成:cDNA第一鏈的合成采用Fermentas公司的RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒,反轉(zhuǎn)錄引物使用試劑盒所提供的Oligo (dT) 18引物，以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系為20ul。
[0029](4)內(nèi)參基因的選擇:內(nèi)參須滿足:①在研究中樣本之間的表達(dá)是相似的；②處理因素不會(huì)影響其表達(dá)與待測(cè)基因同時(shí)進(jìn)行相同的擴(kuò)增等要求。根據(jù)以上原則本實(shí)驗(yàn)選擇GAPDH為內(nèi)參基因。
[0030](5)熒光定量引物設(shè)計(jì):根據(jù)CsCBFl基因的全長(zhǎng)序列，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)適用于熒光定量PCR檢測(cè)的特異性引物，引物序列如下:
[0031]yF:5’ -TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3J ；
[0032]yR:5，-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3J ；
[0033]CsCBFl基因的PCR產(chǎn)物預(yù)計(jì)長(zhǎng)度為235bp，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增后的長(zhǎng)度與預(yù)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度一致，且為但一條帶，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物具有很強(qiáng)的特異性，適合用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。
[0034]作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因GAPDH的引物序列如下:
[0035]GAPDH-F:5，-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3，
[0036]GAPDH-R:5，-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3
[0037]GAPDH的PCR產(chǎn)物預(yù)計(jì)長(zhǎng)度為206bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增后的產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度一致，且為但一條帶，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物具有很強(qiáng)的特異性，適合用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2。
[0038](6)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用德國(guó)羅氏公司LigntCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(配有該公司提供的LigntCycler480熒光定量分析軟件)、Fermentas公司的Maxima SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行。以上述(3)中合成的cDNA第一鏈為模板，上述(5)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R為特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反映，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增后所得到3個(gè)重復(fù)管的Ct值(即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值所經(jīng)歷的反應(yīng)循環(huán)數(shù))取平均數(shù)；
[0039]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系如下:
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)茶樹(shù)CBFl基因表達(dá)的方法，其特征在于包括茶苗處理、所取組織RNA提取、cDNA合成、內(nèi)參基因選擇、熒光定量引物設(shè)計(jì)、熒光定量PCR反應(yīng)及CsCBFl基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算七個(gè)主要步驟，具體操作方法如下: (1)茶苗處理:將茶苗分別置于低溫(4°C、_5°C)、干旱、激素環(huán)境下處理不同時(shí)間； (2)所取組織RNA提取:取不同處理下的茶樹(shù)葉片，利用RNA提取試劑盒，從茶樹(shù)葉片中提取得到純化的總RNA ； (3)cDNA的合成:以茶樹(shù)葉片總RNA為模板合成cDNA第一鏈； (4)內(nèi)參基因選擇:根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)內(nèi)參基因選擇要求，選擇甘油醛-3-磷酸-脫氫!酶(glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase, GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參基因； (5)熒光定量引物設(shè)計(jì):根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)CsCBFl基因、GAPDH基因特異性上下游引物yF、yR和GAPDH-F、GAPDH-R ； (6)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng):以上述合成的cDNA第一鏈為模板，yF、yR和GAPDH-F、GAPDH-R為特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 (7)不同處理下，CsCBFl基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算:實(shí)時(shí)熒光定量PCR完成后，根據(jù)Ct值計(jì)算每種處理不同時(shí)間下的ACt、Δ八以、2_"吣值，計(jì)算方式如下:
Λ Ct = Ct (CsCBFl 基因)-Ct (GAPDH 基因) A ACt = Λ Ct (處理N小時(shí))-Λ Ct (處理O小時(shí)) 以2_ΔΔα數(shù)值表示處理時(shí)間N小時(shí)時(shí)，CsCBFl基因相對(duì)于GAPDH基因的表達(dá)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述一種采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)茶樹(shù)CBFl基因表達(dá)的方法，其特征在于茶苗處理步驟中，低溫處理與以往實(shí)驗(yàn)相比增加了 _5°C，使低溫處理的溫度范圍更寬。干旱處理采用的是通過(guò)澆灌15% -30%的聚乙二醇(PEG)來(lái)模擬干旱環(huán)境，使實(shí)驗(yàn)更嚴(yán)謹(jǐn)；激素處理是通過(guò)噴施0.1-1.5mg/L油菜素內(nèi)酯(BR)。在處理時(shí)間0、0.5h、lh、2h、4h、8h、16h、24h、48h分別取樣，處理時(shí)間的設(shè)定上體現(xiàn)了取樣時(shí)間間隔短、時(shí)間持久等優(yōu)點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述一種采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)茶樹(shù)CBFl基因表達(dá)的方法，其特征在于RNA提取步驟中，所取的組織為一芽?jī)扇~。
4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述一種采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)茶樹(shù)CBFl基因表達(dá)的方法，其特征在于熒光定量引物設(shè)計(jì)步驟中，根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了 CsCBFl基因特異性上下游引物:
yF:5’ -TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3’ ；
yR:5’ -TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3’ ； 以及作為內(nèi)參基因的GAPDH基因特異性上下游引物:
GAPDH-F:5’ -TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’
GAPDH-R:5，-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3
5.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述一種采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)茶樹(shù)CBFl基因表達(dá)的方法，其特征在于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)步驟中，以上述(3)合成的cDNA第一鏈為模板，上述(5)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R為特異性引物，其中每條引物分別配制成IOu mo I/L的工作濃度。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反映，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增后所得到3個(gè)重復(fù)管的Ct值取平均數(shù)；
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103911425SQ201310000481
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月4日
【發(fā)明者】丁兆堂, 郭秀麗, 王玉, 賈玉輝 申請(qǐng)人:即墨瑞草園茶業(yè)研究院