專利名稱：一種可用作免疫佐劑的改良型鞭毛蛋白及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可用作免疫佐劑的改良型鞭毛蛋白及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鞭毛蛋白含有494個氨基酸，具有4個球形結(jié)構(gòu)域(DO，Dl, D2和D3)，其中DO和Dl結(jié)構(gòu)域高度保守。來自各類細菌的鞭毛蛋白的氨基酸序列可在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得。其中，已知來自鼠傷寒沙門菌I (S. Typhimurium I)、幽門螺桿菌(H. Pylori)、霍亂弧菌(V. Cholera)、粘質(zhì)沙雷氏菌(S. marcesens)、福氏痢疾桿菌(S. flexneri)、梅毒螺旋體(T. Pallidum)、嗜肺軍團菌(L. pneumophila)、伯氏疏螺旋體(B. burgdorferei)、艱難梭狀芽孢桿菌(C. difficile)、苜猜根瘤菌(R. meliloti)、根癌農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)、羽扇豆根瘤菌(R.1upini)、卡氏巴爾通體(B. clarridgeiae)、奇異變形桿菌(P. Mirabilis)、枯草桿菌(B. subtilus)、單核細胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)、銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)和大腸桿菌(E. coli)的鞭毛蛋白序列。鞭毛蛋白具有佐劑效應(yīng)，但 其產(chǎn)生佐劑效應(yīng)的機制還不清楚。研究表明，鞭毛蛋白通過與宿主細胞的TLR5受體結(jié)合，刺激細胞產(chǎn)生大量的促炎性細胞因子從而激發(fā)佐劑效應(yīng)。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，鞭毛蛋白與卵清白蛋白(OVA)混合免疫TLRSm小鼠后，其誘導(dǎo)OVA蛋白體液免疫應(yīng)答的佐劑能力沒有發(fā)生變化，從而推斷TLR5介導(dǎo)的天然應(yīng)答不是鞭毛蛋白產(chǎn)生佐劑效應(yīng)的必需條件。另外，鞭毛蛋白作用于TLR5受體后，激發(fā)產(chǎn)生的強烈天然免疫應(yīng)答會導(dǎo)致系統(tǒng)性不良反應(yīng)，如膿毒癥等。鞭毛蛋白對機體的副作用制約了其作為佐劑的應(yīng)用前景。因此，亟需研究開發(fā)出一種改良型鞭毛蛋白，該蛋白既能保留野生型鞭毛蛋白免疫佐劑的特點，同時又能降低其激發(fā)的天然免疫應(yīng)答，減輕其對機體的副作用，這對于新型疫苗研發(fā)具有現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種改良型鞭毛蛋白及其制備與應(yīng)用，該蛋白既能保留野生型鞭毛蛋白免疫佐劑的特點，同時又能降低其激發(fā)的天然免疫應(yīng)答，減輕其對機體的副作用，使鞭毛蛋白作為佐劑具有高度的安全性。本發(fā)明一方面提供了一種鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體，具有鞭毛蛋白的生物活性，與野生型鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白相比，含有141IA突變(鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白f IiC基因第411位上的異亮氨酸(1411)定點突變成丙氨酸(A))。進一步的，所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體具有免疫佐劑活性。相比野生型鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白，對Toll樣受體5 (Toll-like5, TLR5)的刺激活性減弱。
進一步的，本發(fā)明所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:權(quán)利要求
1.一種鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體，具有鞭毛蛋白的生物活性，與野生型鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白相比，含有I411A突變。
2.如權(quán)利要求1所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體，其特征在于，相比野生型鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白，所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體對Toll樣受體5的刺激活性減弱。
3.如權(quán)利要求1所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體，其特征在于，所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:5。
4.一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體。
5.如權(quán)利要求4所述多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列為SEQID N0:6。
6.—種表達載體,其含有權(quán)利要求4或5所述多核苷酸。
7.—種宿主細胞，其被權(quán)利要求6所述表達載體所轉(zhuǎn)化。
8.如權(quán)利要求7所述宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為沙門菌。
9.權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體的制備方法，包括下列步驟 1)將所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體的基因克隆入fIiC基因與f I jB基因雙缺失的鼠傷寒沙門菌，并在合適條件下培養(yǎng)所述鼠傷寒沙門菌，使得鞭毛蛋白在其菌體表面表達； 2)從培養(yǎng)物中分離出所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體。
10.如權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體在制備疫苗中的用途。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體在制備疫苗時，用作免疫佐劑。
12.—種疫苗佐劑，其佐劑活性成分含有權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體。
13.一種疫苗，包括權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體以及一種或多種抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可用作免疫佐劑的改良型鞭毛蛋白及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明的鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體，具有鞭毛蛋白的生物活性，與野生型鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白相比，含有I411A突變。本發(fā)明的鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白突變體可使TLR5介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答減弱，且具有顯著的佐劑活性。
文檔編號C12N15/31GK103044530SQ20131000202
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月4日
發(fā)明者焦新安, 潘志明, 張磊, 孫林, 楊蕓, 康喜龍, 王靜 申請人:揚州大學(xué)