專利名稱：一種鮐魚活性肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種鮐魚活性肽的制備方法。
背景技術(shù)：
生物活性肽因其具有特殊的生理活性，主要體現(xiàn)在免疫活性、抗高血壓、抗血脂、抗氧化、促生長(zhǎng)活性、腫瘤抑制活性等，從而廣泛應(yīng)用于食品及化妝品行業(yè)、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域。鮐魚，又名青鲇魚，是海洋中上層低值魚類，在我國(guó)各海域均有分布，尤以東海產(chǎn)量最多。鮐魚是我國(guó)重要的加工魚種，每年加工成各類冷凍魚片和魚罐頭數(shù)量達(dá)數(shù)萬(wàn)噸。然而，鮐魚的經(jīng)濟(jì)價(jià)值未得到充分利用，如何高值利用鮐魚成為亟待解決的問(wèn)題，已引起高度關(guān)注。酶解法制備蛋白的研究一直是熱點(diǎn)，其水解效率高，水解條件溫和可控，在營(yíng)養(yǎng)成分的保留上具有化學(xué)法無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，適于生產(chǎn)魚類水解蛋白。以往發(fā)明均以水解度為指標(biāo)，本發(fā)明以多肽含量為指標(biāo)，采用酶法水解制備高含量的鮐魚活性肽，并研究其生理活性，對(duì)于鮐魚的高值化利用是非常有意義的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鮐魚活性肽的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種鮐魚活性肽的制備方法，以鮐魚作為原材料經(jīng)絞碎，加入去離子水置于恒溫水浴中經(jīng)攪拌保溫5 10min，再調(diào)節(jié)pH值；調(diào)節(jié)pH值后加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)5tT8h，反應(yīng)完畢后，酶滅活，離心，收集上清液，冷凍干燥，即得鮐魚活性肽；其中每克經(jīng)絞碎的原材料鮐魚中加入1000擴(kuò)2000U酶活力單位的蛋白酶。

取以經(jīng)絞碎的鮐魚魚糜按照物料重量比為l:l(Tl:20的比例加入去離子水，在恒溫水浴中不斷攪拌至酶解溫度后，保溫5 lOmin，再加NaOH或HCL調(diào)節(jié)pH值，調(diào)節(jié)PH值后在攪拌條件下加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)4tT8h，反應(yīng)完畢后，并將溫度迅速升溫到95 0C ^lOO 0C加熱l(Tl5min鈍化滅酶，再用酸或堿調(diào)節(jié)漿液pH至中性，4°C低溫下以10000r/min,離心15 30min,收集上清液_20°C保藏備用。所述蛋白酶為風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或酸性蛋白酶(湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司)。取以經(jīng)絞碎的鮐魚肉魚糜按照物料重量比為l:l(Tl:25的比例加入去離子水，在恒溫水浴中不斷攪拌至酶解溫度為3(T50°C后，保溫5 lOmin，再用NaOH或HCL調(diào)節(jié)pH值至6 8，調(diào)節(jié)pH值后在攪拌條件下加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)4tT7h，反應(yīng)完畢后，并將溫度迅速升溫到95°C 100°C加熱10-15min鈍化滅酶，再用酸或堿調(diào)節(jié)漿液pH至中性，4°C低溫下以10000r/min,離心15 30min,收集上清液_20°C保藏備用；其中每克經(jīng)絞碎的原材料魚臺(tái)魚中加入1400U 1800U酶活力單位的蛋白酶。取以經(jīng)絞碎的鮐魚內(nèi)臟魚糜按照物料重量比為l:l(Tl:25的比例加入去離子水，在恒溫水浴中不斷攪拌至酶解溫度為3(T50°C后，保溫5 lOmin，再用NaOH或HCL調(diào)節(jié)pH值至6 8，調(diào)節(jié)pH值后在攪拌條件下加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)4tT7h，反應(yīng)完畢后，并將溫度迅速升溫到95°C 100°C加熱l(Tl5min鈍化滅酶，再用酸或堿調(diào)節(jié)漿液pH至中性，4°C低溫下以10000r/min,離心15 30min,收集上清液_20°C保藏備用；其中每克經(jīng)絞碎的原材料鮐魚中加入1400U 1800U酶活力單位的蛋白酶。取以經(jīng)絞碎的鮐魚頭尾的魚糜按照物料重量比為l:l(Tl:20的比例加入去離子水，在恒溫水浴中不斷攪拌至酶解溫度為3(T50°C后，保溫5 lOmin，再用NaOH或HCL調(diào)節(jié)PH值至7、，調(diào)節(jié)pH值后在攪拌條件下加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)5 8h，反應(yīng)完畢后，并將溫度迅速升溫到95°C 100°C加熱l(Tl5min鈍化滅酶，再用酸或堿調(diào)節(jié)漿液pH至中性，4°C低溫下以10000r/min,離心15 30min,收集上清液_20°C保藏備用；其中每克經(jīng)絞碎的原材料鮐魚中加入100(Tl400U酶活力單位的蛋白酶。將上述所得鮐魚活性肽采用雙縮脲法進(jìn)行檢測(cè)，或凝膠樹脂SuperdeX75柱純化分離，采用含有濃度為0.15-0.5M NaCl的pH7.820mMTris-HCl緩沖液洗脫，流速為0.2-0.5mL min-1，收集洗脫液。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):1.以往發(fā)明均以水解度為指標(biāo)制備活性肽，實(shí)際上水解度高的酶解液其多肽含量并不一定高。本發(fā)明以多肽含量為指標(biāo)，采用酶法水解制備高含量的鮐魚活性肽。2.本發(fā)明采用SuperdeX75分離鮐魚各組分酶解液，具有流速快、分辨率高的特點(diǎn)。3.本發(fā)明制備所得鮐魚活性肽具有清除羥自由基、清除超氧陰離子、還原能力、清除DPPH和抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的活性，可作為潛在的抗氧化劑來(lái)應(yīng)用到醫(yī)療行業(yè)。4.本發(fā)明的制備方法反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少、不破壞氨基酸、且設(shè)備簡(jiǎn)單安全。制得的多肽粉外觀呈淡黃色粉末，易溶于水，氨基酸組成全面，含量豐富，是一種無(wú)色素、無(wú)添加劑的營(yíng)養(yǎng)食品。


圖1為本發(fā)明實(shí)例提供的蛋白酶水解制備鮐魚活性肽的技術(shù)路線圖。圖2為本發(fā)明實(shí)例提供的采用水提法和蛋白酶水解法處理鮐魚肉蛋白后分子量變化的差異圖。其中標(biāo)線采用的標(biāo)準(zhǔn)品為細(xì)胞色素c (12400Da)，抑肽酶(6511.4Da)，維生素 B12 (1355.38Da),谷胱甘肽(612.63Da)，胞嘧啶核苷酸(242.2Da)。圖3為本發(fā)明實(shí)例提供的鮐魚魚肉、內(nèi)臟、頭尾三組分最優(yōu)酶解液凍干品清除羥基自由基的能力圖。圖4為本發(fā)明實(shí)例提供的鮐魚魚肉、內(nèi)臟、頭尾三組分最優(yōu)酶解液凍干品抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力圖。
具體實(shí)施例下面結(jié)合說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并且本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實(shí)施例。 鮐魚活性肽的制備:分別取鮐魚魚肉，內(nèi)臟，魚頭魚尾三組分為原材料，洗凈、絞碎，加入一定體積去離子水，在適當(dāng)?shù)暮銣厮≈胁粩鄶嚢柽_(dá)到蛋白酶的最適酶解溫度后，保溫5min左右,用Imol的NaOH或HCL分別調(diào)節(jié)pH至各蛋白酶的最適值。加入一定量的蛋白酶，水解一段時(shí)間，反應(yīng)完畢后，酶滅活，離心，收集上清液，冷凍干燥，即得鮐魚活性肽。上述鮐魚活性肽的制備方法，加入去離子水比例為l:l(Tl:20，所述蛋白酶分別為風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶。上述各蛋白酶均購(gòu)于湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司。實(shí)施例1稱取鮐魚魚肉100g，將鮐魚魚肉用去離子水洗凈，用高速攪碎機(jī)搗碎，所得魚糜與水混合，按照質(zhì)量比魚糜:水=1:20的比例加入去離子水，即使底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，在35°C的恒溫水浴中不斷攪拌，達(dá)到中性蛋白酶的最適酶解溫度后，保溫5min左右，用Imol的NaOH或HCL調(diào)節(jié)pH為7.0,并不斷攪拌，以每克魚糜加入1746.4U/g酶活力單位加入中性蛋白酶反應(yīng)5.5h。酶解結(jié)束后，停止攪拌，并將溫度迅速升溫到95 100°C加熱IOmin鈍化滅酶，再用酸或堿調(diào)節(jié)衆(zhòng)液pH至中性,4°C低溫離心(7000r/min, 20min),上清液_20°C保藏備用。將上述所得鮐魚活性肽采用雙縮脲法進(jìn)行檢測(cè)。雙縮脲試劑配制方法:溶解1.5g硫酸銅和6.0g酒石酸鉀鈉于500ml蒸餾水中，在攪拌下加入300ml 10%氫氧化鈉溶液，用水稀釋到IOOOml。測(cè)定時(shí)，吸取Iml酶解液，加入4ml雙縮脲試劑，搖勻，37°C水浴20min后用分光光度計(jì)于540nm波長(zhǎng)處比色，以空白管調(diào)零點(diǎn)，牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。測(cè)得的魚肉酶解液中蛋白多肽含量為109.8mg/g，可溶性肽含量占到了 91.3%。實(shí)施例2
稱取兩份鮐魚魚肉各10g，分別將鮐魚魚肉用去離子水洗凈，用高速攪碎機(jī)搗碎，所得魚糜與水混合，按照質(zhì)量比魚糜:水=1:20的比例加入去離子水，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，在35°C的恒溫水浴中不斷攪拌，保溫一段時(shí)間后，其中一份用Imol的NaOH或HCL調(diào)節(jié)PH為7.0,并不斷攪拌，以每克魚糜加入1746.4U/g酶活力單位加入中性蛋白酶反應(yīng)5.5h。反應(yīng)結(jié)束后，分別停止攪拌，并將溫度迅速升溫到95-100°C加熱IOmin鈍化滅酶，再用酸或堿調(diào)節(jié)衆(zhòng)液pH至中性，4°C低溫離心(7000r/min, 20min),上清液冷凍干燥,備用。將凍干品IOmg上凝膠柱Superdex75(2.6X60cm)，分別以含有濃度為0.5M的NaCl的pH7.820mM Tris-HCl依次洗脫，流速0.SmLmirT1，紫外檢測(cè)器同步檢測(cè)并收集各洗脫峰，與水提液相比較，魚肉蛋白水解液的分子量大多數(shù)降到了 3000Da以下。實(shí)施例3與上述實(shí)施例記載，在不同的酶解條件下，可以得到不同多肽含量的酶解液，上述內(nèi)容同樣適用于實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種鮐魚活性肽的制備方法，其特征在于:以鮐魚作為原材料經(jīng)絞碎，加入去離子水置于恒溫水浴中經(jīng)攪拌保溫^lOmin，再調(diào)節(jié)pH值；調(diào)節(jié)pH值后加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)5tT8h，反應(yīng)完畢后，酶滅活，離心，收集上清液，冷凍干燥，即得鮐魚活性肽；其中每克經(jīng)絞碎的原材料鮐魚中加入1000擴(kuò)2000U酶活力單位的蛋白酶。
2.按權(quán)利要求1所述的鮐魚活性肽的制備方法，其特征在于:取以經(jīng)絞碎的鮐魚魚糜按照物料重量比為l:l(Tl:20的比例加入去離子水，在恒溫水浴中不斷攪拌至酶解溫度后，保溫5 lOmin，再加NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值，調(diào)節(jié)pH值后在攪拌條件下加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)4tT8h，反應(yīng)完畢后，并將溫度迅速升溫到95Π00 加熱l(Tl5min鈍化滅酶，再用酸或堿調(diào)節(jié)衆(zhòng)液pH至中性,4 低溫下以10000r/min,離心15 30min,收集上清液_2(TC保減備用。
3.按權(quán)利要求1或2所述的鮐魚活性肽的制備方法，其特征在于:所述蛋白酶為風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或酸性蛋白酶。
4.按權(quán)利要求1或2所述的鮐魚活性肽的制備方法，其特征在于:取以經(jīng)絞碎的鮐魚肉魚糜按照物料重量比為l:l(Tl:25的比例加入去離子水，在恒溫水浴中不斷攪拌至酶解溫度為3(T50°C后，保溫5 lOmin，再用NaOH或HCL調(diào)節(jié)pH值至6 8，調(diào)節(jié)pH值后在攪拌條件下加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)4tT7h，反應(yīng)完畢后，并將溫度迅速升溫到95°C ^lOO0C加熱10-15min鈍化滅酶,再用酸或堿調(diào)節(jié)衆(zhòng)液pH至中性，4°C低溫下以10000r/min,離心15 30min，收集上清液_20°C保藏備用；其中每克經(jīng)絞碎的原材料鮐魚中加入1400曠1800U酶活力單位的蛋白酶。
5.按權(quán)利要求1或2所述的鮐魚活性肽的制備方法，其特征在于:取以經(jīng)絞碎的鮐魚內(nèi)臟魚糜按照物料重量比為l:l(Tl:25的比例加入去離子水，在恒溫水浴中不斷攪拌至酶解溫度為3(T50°C后，保溫5 lOmin，再用NaOH或HCL調(diào)節(jié)pH值至6 8，調(diào)節(jié)pH值后在攪拌條件下加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)4tT7h，反應(yīng)完畢后，并將溫度迅速升溫到95°C ^lOO0C加熱l(Tl5min鈍化滅酶，再用酸或堿調(diào)節(jié)漿液pH至中性，4°C低溫下以10000r/min，離心15 30min，收集上清液_20°C保藏備用；其中每克經(jīng)絞碎的原材料鮐魚中加入1400曠1800U酶活力單位的蛋白酶。
6.按權(quán)利要求1或2所述的鮐魚活性肽的制備方法，其特征在于:取以經(jīng)絞碎的鮐魚頭尾的魚糜按照物料重量比為l:l(Tl:20的比例加入去離子水，在恒溫水浴中不斷攪拌至酶解溫度為3(T50°C后，保溫5 lOmin，再用NaOH或HCL調(diào)節(jié)pH值至7 9，調(diào)節(jié)pH值后在攪拌條件下加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)5lh，反應(yīng)完畢后，并將溫度迅速升溫到95°C ^lOO0C加熱l(Tl5min鈍化滅酶，再用酸或堿調(diào)節(jié)漿液pH至中性，4°C低溫下以10000r/min，離心15 30min，收集上清液-20°C保藏備用；其中每克經(jīng)絞碎的原材料鮐魚中加入100(Tl400U酶活力單位的蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明屬于海洋化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種鮐魚活性肽的制備方法。以鮐魚作為原材料經(jīng)絞碎，加入去離子水置于恒溫水浴中經(jīng)攪拌保溫5~10min，再調(diào)節(jié)pH值；調(diào)節(jié)pH值后加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)5h~8h，反應(yīng)完畢后，酶滅活，離心，收集上清液，冷凍干燥，即得鮐魚活性肽；其中每克經(jīng)絞碎的原材料鮐魚中加入1000U~2000U酶活力單位的蛋白酶。本發(fā)明的制備方法反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少、不破壞氨基酸、且設(shè)備簡(jiǎn)單安全。制得的多肽粉外觀呈淡黃色粉末，易溶于水，氨基酸組成全面，含量豐富，是一種無(wú)色素、無(wú)添加劑的營(yíng)養(yǎng)食品。
文檔編號(hào)C12P21/06GK103088097SQ201310002099
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月4日
發(fā)明者李鵬程, 王雪芹, 邢榮娥, 劉松, 于華華, 李克成, 李冰, 秦玉坤, 李榮鋒 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所