產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌及其構建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌，其是一種抑制或敲除了產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌野生菌株中糖基轉(zhuǎn)移酶基因的基因工程菌。本發(fā)明也公開所述基因工程菌的制備方法和所用的重組穿梭載體和轉(zhuǎn)化體，以及這種產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌在生產(chǎn)無糖雷莫拉寧或雷莫拉寧衍生物上的應用。
【專利說明】產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體地說涉及一種生產(chǎn)無糖雷莫拉寧的游動放線菌的基因工程菌及其制備方法和所用的重組穿梭載體和轉(zhuǎn)化體，以及這種產(chǎn)無糖雷莫拉寧工程菌在生產(chǎn)無糖雷莫拉寧和雷莫拉寧衍生物上的應用。
【背景技術】
[0002]隨著抗生素在抗感染治療上的大量應用，臨床耐藥問題日益突出，雷莫拉寧(RAM0PLANIN)作為一類新型廣譜抗革蘭氏陽性菌抗生素，目前主要是作為外用和治療胃腸道粘膜表面感染性疾病藥物進行研究開發(fā)。
[0003]雷莫拉寧由一種游動放線菌屬菌種(美國標準菌庫保存，保藏號ATCC33076)發(fā)酵制得，其發(fā)酵液中主要含有三種結構類似物，雷莫拉寧A1、A2和A3，其制備工藝及用途由US4427656公開，結構上，雷莫拉寧在Hpg11上連接有D-甘露糖基二糖，如圖1所示，其中主要產(chǎn)物為雷莫拉寧A2。
[0004]無糖雷莫拉寧A1、A2、A3(以下稱為Ala、A2a和A3a)是一組在結構上缺失了 D-甘露糖基二糖的雷莫拉寧衍生物。US5491128公開了無糖雷莫拉寧Ala、A2a和A3a的制備方法，并顯示其針對特定耐藥病原菌的抗菌活性類似或稍強于雷莫拉寧Al、A2和A3 ;同時，無糖雷莫拉寧Ala、A2a和A3a也可作為雷莫拉寧結構改造的先導化合物；Jiang等報道了一種全合成 A2a 的方法，Total synthesis of the ramoplanin A2 andramoplanoseaglycon." Journal of the American Chemical Society 124.19(2002):5288-5290.；Shin 等人報道了全合成 Ala 和 A3a 的方法，Totalsynthesis and structure ofthe ramoplanin Al and A3 aglycons:Two minorcomponents of the ramoplanincomplex." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 101.33(2004):11977-11979.;Palo 等人提到了一種酶法制備 Ala、A2a 和 A3a的方法 Anew bacterial mannosidase for the selective modification of ramoplaninandits derivatives.Enzyme and Microbial Technology 41.6 (2007):806-811。如果能夠抑制或者敲除雷莫拉寧生物合成途徑中的糖基轉(zhuǎn)移酶，則所獲的突變株可以通過常規(guī)的發(fā)酵分離手段直接制備無糖雷莫拉寧，從而避免了水解法和酶法制備工藝中需先制得雷莫拉寧后再對其進行相應化學處理或酶法處理以及隨后的目標產(chǎn)物的分離純化的重復工藝，也可以避免化學合成法的繁瑣工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明通過阻斷產(chǎn)雷莫拉寧菌株中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，達到在其發(fā)酵過程中產(chǎn)生無糖雷莫拉寧的目的。
[0006]因此，本發(fā)明要解決的技術問題就是針對現(xiàn)有的水解法、酶法和化學全合成制備雷莫拉寧Ala、A2a和A3a的較為繁瑣的工藝提供一種敲除糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌，該菌能夠經(jīng)由常規(guī)的發(fā)酵、分離工藝制備雷莫拉寧Ala、A2a和A3a，且傳代非常穩(wěn)定。本發(fā)明還提供了該生產(chǎn)雷莫拉寧Ala、A2a和A3a的基因工程菌的制備方法和所用的重組穿梭載體和轉(zhuǎn)化體。
[0007]本發(fā)明人經(jīng)過仔細的研究和反復的對比發(fā)現(xiàn)，雷莫拉寧生物合成基因簇中的ramo-orf29所編碼的0FR29的氨基酸序列與替考拉寧、A40926生物合成途徑中的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶TCP15、DBV20類似，均含有甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的保守區(qū)域arnT，且RAM0-0RF29與TCP15和DBV20的一致性分別達到63%和50%，是雷莫拉寧生物合成途徑中負責加載D-甘露糖基二糖的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶。因此，本發(fā)明人利用同源重組雙交換將雷莫拉寧生物合成基因簇中的ram0-0rf29進行同框敲除操作，經(jīng)由抗性篩選，所獲得的突變株不再產(chǎn)生雷莫拉寧Al、A2和A3,轉(zhuǎn)而產(chǎn)生雷莫拉寧Ala、A2a和A3a,從而完成了本發(fā)明。
[0008]因此，本發(fā)明的第一個目的是提供一種產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌，其是一種抑制或敲除了產(chǎn)雷莫拉寧野生菌株中糖基轉(zhuǎn)移酶基因的基因工程菌。
[0009]根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，所述的糖基轉(zhuǎn)移酶基因為產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌野生菌株的ramo-orf29基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1的2727-4586位所示。
[0010]其中，產(chǎn)雷莫拉寧野生菌株是指游動放線菌屬菌種(美國標準菌庫保存，保藏號ATCC33076)，或其突變菌株等。
[0011]根據(jù)本發(fā)明，所述抑制或敲除產(chǎn)雷莫拉寧野生菌株中糖基轉(zhuǎn)移酶基因ram0-0rf29是指將外來DNA片段插入ramo-orf29基因中，或與ramo_orf29基因中的DNA片段置換，從而使ramo-orf29被阻斷而不能表達。所述的產(chǎn)雷莫拉寧野生型菌株的ramo_orf29基因序列被敲除的部分最大長度可以是整個ramo-orf29基因,較佳的是敲除ramo_orf29基因的第322位-723位之間的核苷酸片段；或敲除ramo-orf29基因的第457-1365位之間的核苷酸片段；或敲除ramo-orf29基因的第937-1788位之間的核苷酸片段。因此，ramo-orf29基因被阻斷而不能表達，從而使該被改造了的產(chǎn)雷莫拉寧野生型菌株失去產(chǎn)雷莫拉寧的能力轉(zhuǎn)而產(chǎn)生無糖雷莫拉寧。
[0012]根據(jù)本發(fā)明，所述的游動放線菌屬菌種較佳的選用國內(nèi)工業(yè)用菌株——Actinoplanes sp.ATCC 33076。
[0013]本發(fā)明的第二個目的是提供一種重組穿梭載體，其含有在產(chǎn)雷莫拉寧野生型菌株中與ramo_orf29基因連鎖的上游基因或其片段、ramo_orf29基因5’端片段、ramo-orf29基因3’端片段以及ram0-0rf29基因連鎖的下游基因或其片段依次連鎖組成的DNA片段。
[0014]雷莫拉寧生物合成基因簇的核苷酸序列已經(jīng)由US 7635765公開。在野生型產(chǎn)雷莫拉寧菌株中，基因 ramo-orf29 上游的 ramo_orf28、ramo_orf27、ramo_orf26 依次連鎖表達，ramo-orf29> ramo-orf30> ramo-orf31依次連鎖表達。核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。其中第1-1764位核苷酸序列是所述的ramo-orf26基因片段；第1822-2049位核苷酸序列是所述的ramo-orf27基因片段；第2202-2486位核苷酸序列是所述的ramo-orf28基因，第2727-4586位核苷酸序列是所述的ramo-orf29基因，第4621-5688位核苷酸序 列是所述的ramo-orf30基因，第5695-6984位核苷酸為所述的ramo-orf31基因。ramo_orf29基因中被敲除部分的長度最大可以是整個ramo_orf29,較佳的是ramo-orf29基因中間的核苷酸序列，更佳的是ramo_orf29中編碼甘露糖基轉(zhuǎn)移酶保守區(qū)域arnT的核苷酸序列。也就是說，本發(fā)明的重組穿梭載體含有的DNA序列較佳的是由ramo_orf29上游DNA片段、ramo_orf29基因5’端片段、ramo_orf29基因3’端片段和ramo-orf29下游DNA片段依次連鎖組成的DNA片段。
[0015]該重組穿梭載體可用于與ATCC 33076基因組發(fā)生同源雙交換，從而得到產(chǎn)無糖雷莫拉寧的ATCC 33076糖基轉(zhuǎn)移酶基因阻斷突變的工程菌。其中，在該重組穿梭載體中，所述的ram0-0rf29上游DNA片段與連鎖的ram0-0rf29基因5’端片段部分是發(fā)生同源重組雙交換的左臂；與ram0-0rf29基因的3’端片段和與其連鎖的下游DNA片段是發(fā)生同源重組雙交換的右臂。所述的ramo-orf29基因中被敲除部分為與重組DNA片段中ramo-orf29基因5’端片段與重組DNA片段中ramo-orf29基因3’端片段之間對應于ramo-orf29基因核苷酸序列所缺失的部分；或為整段ram0-0rf29基因。所述的左臂的長度可以是0.5-2.0kb,較佳的約為1.5kb，即序列表中SEQ ID N0.1第1549~3047位所示的序列。所述的右臂的長度可以是0.5-2.0kb，較佳的是1.5kb，即序列表中SEQ ID N0.1第3450~4851位所示的序列。
[0016]根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，所述的重組穿梭載體的骨架較佳的是質(zhì)粒PKC1139。
[0017]本發(fā)明的第三個目的是提供一種轉(zhuǎn)化子，其含有所述的重組穿梭載體。 [0018]根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，所述的轉(zhuǎn)化子的宿主細胞較佳的是大腸桿菌ET12567。
[0019]本發(fā)明的第四個目的是提供一種制備產(chǎn)無糖雷莫拉寧的糖基轉(zhuǎn)移酶基因阻斷的基因工程菌的方法，其中，包括將如上所述的轉(zhuǎn)化子與產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌接合，挑選同源雙交換接合子。
[0020]本發(fā)明所述的游動放線菌屬的基因工程菌可用于生產(chǎn)無糖雷莫拉寧。因此，本發(fā)明的第五個目的是提供一種制備無糖雷莫拉寧或其衍生物的方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明上述產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌，從培養(yǎng)物中獲得無糖雷莫拉寧或其衍生物。
[0021]本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
[0022]相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果如下:
[0023]1.本發(fā)明將產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌屬菌種進行改造，主要是通過同源重組雙交換敲除了其中的部分ram0-0rf29基因，得到了生產(chǎn)無糖雷莫拉寧的工程菌；
[0024]2.本發(fā)明所構建的工程菌，不含有任何抗性標記，便于進一步的基因工程改造；
[0025]3.本發(fā)明所構建的工程菌不再產(chǎn)生雷莫拉寧，轉(zhuǎn)而產(chǎn)生無糖雷莫拉寧，通過連續(xù)傳代，無糖雷莫拉寧產(chǎn)量非常穩(wěn)定重復性好；
[0026]4.本發(fā)明采用PCR來篩選突變株，解決了插入抗性基因作為篩選標記(例如阿伯拉霉素抗性基因)，插入外來基因片段過大所帶來的影響上下游基因的轉(zhuǎn)錄的問題，從而保持剩下的ram0-0rf29基因的兩端的堿基和編碼氨基酸不變，最大限度的減少中斷ramo-orf29對上下游的基因的影響,大大增加了菌株的穩(wěn)定性；
[0027]相對于須先通過微生物發(fā)酵制備雷莫拉寧之后再用化學水解法或酶法制備無糖雷莫拉寧的方法，以及相對于化學全合成制備無糖雷莫拉寧的方法，本發(fā)明所構建的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌能夠利用現(xiàn)有的產(chǎn)雷莫拉寧野生型菌株的生產(chǎn)雷莫拉寧的工藝直接制備無糖雷莫拉寧，具有很好的工業(yè)化前景?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0028]圖1是雷莫拉寧A2以及無糖雷莫拉寧的結構示意圖。
[0029]圖2是同框敲除ramo_orf29質(zhì)粒的構建示意圖。
[0030]圖3是敲除糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌的構建策略示意圖。
[0031]圖4是PCR驗證產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌基因型的電泳圖。M，marker ;1，雙交換基因型；2，野生型基因型。
[0032]圖5是產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測圖。
[0033]圖6是產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的LC-MS檢測圖。
【具體實施方式】
[0034]下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0035]所使用的工具酶和DNA分子量標記均購自寶生物公司(Takara),具體的反應條件和使用的方法均參考商品說明書
[0036]所使用的膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，使用方法參考商品說明書。
[0037]大腸桿菌E.coli DH5a、ET12567，購自上海鼎國生物技術有限責任公司。
[0038]游動放線菌Actinoplanes sp.ATCC 33076可從美國菌種保藏中心(ATCC)取得。
[0039]實施例1:雙交換左右臂的克隆
[0040]在游動放線菌Actinoplanes sp.ATCC 33076 中，ramo_orf26、ramo_orf27 和ramo-orf28 依次在 ramo-orf29 的上游，ramo-orf30 和 ramo-orf31 依次在 ramo-orf29 的下游，我們?nèi)amo_orf9上游至ramo_orf26部分片段、ramo_orf29的5’端片段作為雙交換的左臂，ramo-orf29基因3’端片段至ramo_orf30部分片段作為雙交換的右臂來構建雙交換質(zhì)粒。首先根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的游動放線菌Actinoplanes sp.ATCC33076相應序列(US7635765)設計引物:
[0041]左臂上游為5’ -AAAAAGCTTCAGGGCGATGAGGATGC-3，；
[0042]左臂下游為5 ’ -AAATCTAGAGAAGCCGAAGACGCG-3，；
[0043]右臂上游為5’ -AAATCTAGAGCGGTCTCGCTGCTCT-3，；
[0044]右臂下游為5 ’ -AAAGATATCGCTGCTCGACGTAGGC-3，。
[0045]上述引物由上海英駿生物技術有限公司合成。以游動放線菌ATCC33076的基因組總DNA為模 板。使用寶生物公司的Primer star高保真DNA聚合酶來進行片段的克隆。PCR條件為:98°C，10s、66°C，15s、72°C，1.5min擴增30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物上樣電泳后，回收目的條帶?；厥盏钠闻c質(zhì)粒進行連接，左臂PCR產(chǎn)物聯(lián)入質(zhì)粒pSP72(購自上海生物工程技術服務有限公司)，接入位點HindIII和Xbal，命名為pCJSlOOl并測序；右臂PCR產(chǎn)物聯(lián)入質(zhì)粒pSP72，接入位點XbaI和EcoRV，命名為pCJS1002，并測序。左臂序列與US 7635765中的相應序列比對為100%的同源性，右臂序列與編號US 7635765中的相應序列比對為100%的同源性。
[0046]實施例2:雙交換定點同框敲除ramo-orf29質(zhì)粒pCJS1004的構建
[0047]將實施例1中的右臂連入質(zhì)粒pKC1139(購自上海生物工程技術服務有限公司)，接入位點XbaI和EcoRV，得到質(zhì)粒，命名為pCJS1003。將實施例1中左臂正向聯(lián)入質(zhì)粒PCJS1003，接入位點HindIII和XbaI，得到質(zhì)粒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，采用氨芐青霉素抗性LB平板挑取陽性克隆，在LB培養(yǎng)基中37°C過夜培養(yǎng)后提取小量質(zhì)粒進行酶切和PCR驗證，最終構建完成雙交換同框敲除質(zhì)粒，命名為pCJS1004。構建策略圖見圖2。
[0048]實施例3:敲除糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌Actinoplanes sp.ATCC33076.D29的構建
[0049]從游動放線菌ATCC 33076斜面挑取適量菌體于50ml TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)56小時左右達到對數(shù)生長期，I % (v/v)接種量轉(zhuǎn)接于50ml TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時左右使菌體達到對數(shù)生長后期，離心倒去上清得到菌絲體，菌絲體用20ml的LB液體培養(yǎng)基洗滌2次(4000rpm，10min，4°C )，最后重懸于20ml LB培養(yǎng)基中，待用。用pCJS1004轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ET12567，挑轉(zhuǎn)化子至裝有4ml LB培養(yǎng)基[含阿伯拉霉素(Am) 100 μ g/ml、卡那霉素(Kn) 25 μ g/ml、氯霉素(Cm) 100 μ g/ml]的小試管中，37°C振蕩培養(yǎng)12小時。大腸桿菌ET12567接種于裝有50ml LB培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37°C振蕩培養(yǎng)4小時左右，使菌液OD值在0.4~0.6之間，將菌液移入50ml的無菌塑料離心管，離心(4000rpm，IOmin,4°C )，倒去上清，菌體用20ml LB培養(yǎng)基洗滌2次(4000rpm，10min,4°C )，最后重懸于I~2ml LB培養(yǎng)基中。將該大腸菌液與之前重懸于20ml的游動放線菌ATCC 33076菌絲體以1:1 (重懸液體積比)于EP管中混勻。將混合菌液涂MS平板，用涂棒充分混勻菌液，30 V恒溫箱培養(yǎng)。培養(yǎng)20小時后，取出平板，涂抗生素，用量為每10個平板涂IOml雙蒸水、100 μ I Am和400 μ I萘啶酸(NC)的混合液，再于30°C恒溫箱培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后出現(xiàn)接合子。敲除ram0-0rf29的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌的構建過程見圖3。
[0050]挑取所得的接合子于裝有4ml TSB培養(yǎng)基的小試管中(含Am50 μ g/ml、試管中加入2~3粒直徑2~5毫米的玻璃珠)，30°C振蕩培養(yǎng)。菌液搖濃后，取I μ I菌液稀釋于Iml無菌水中，混勻后取100 μ I涂含Am50 μ g/ml的游動放線菌ATCC33076平板，37°C培養(yǎng)以促進PCJS004整合至ATCC33076的基因組DNA上。4至5天后，37°C培養(yǎng)平板上的整合子單菌落于無抗生素的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)傳代，促使其發(fā)生雙交換。取第3代菌液
Iμ 1，稀釋于IOml的無菌水中，混勻后取100μ I涂ATCC33076平板(無抗性)，30°C培養(yǎng)。4至5天后，出現(xiàn)單菌落，挑取同一個單菌落分別在含Am50 μ g/ml的平板與無抗性的平板上培養(yǎng)，篩選得到20個在無抗性平板生長，而抗性平板不生長的菌落。在無抗性平板生長而在抗性平板不生長的克隆可能是發(fā)生雙交換或者回復的單菌落。挑取菌落在無抗液體TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后抽提其總DNA，以其為模板，設計相應的引物進行基因型篩選，上游引物為 5’ -AAAGGATCCATGGATGTCCCGAGGGTG-3，,下游引物為 5’ -AAATCTAGATCAGGGCTTGTCGCATCG-3 ’，PCR條件為98°C，IOs、66°C，15s、72°C，2min擴增30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物的電泳圖見圖4。擴增出1.8kb的片段的是回復型的野生菌株基因組，擴增出1.4kb的片段的是雙交換突變株基因組，我們從20個菌落中篩選到8個雙交換同框敲除突變株，并將相應擴增到的片段進行測序，測序結果表明突變株缺失了所設計敲除的目的片段，表明目標堿基序列已被正確敲除。最后將其中一株產(chǎn)無糖雷莫拉寧單位較高的突變株命名為Actinoplanessp.ATCC33076.D29，并于2012年12月7日提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(地址:中國.武漢.武漢大學)，保藏號為CCTCC M2012520。
[0051]實施例4:產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌的發(fā)酵以及產(chǎn)物驗證[0052]接種Actinoplanes sp.ATCC33076.D29于斜面28°C培養(yǎng)，培養(yǎng)7天后，接種于種子培養(yǎng)基(牛肉浸膏0.3 %，進口蛋白胨0.5 %，進口酵母粉0.5 %，燕麥粉3.0 %，碳酸鈣
0.4%，消前pH7.0)中于28°C，250rpm培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖6.0%，花生油1.0%，冷榨黃豆粉3.0%，碳酸鈣1.0%，亮氨酸0.7%，消前？!17.0)中，于28°C，250rpm培養(yǎng)6天后放瓶，所得發(fā)酵液用草酸調(diào)節(jié)pH至4左右，加2倍體積丙酮混勻浸泡5小時，離心后取上清進行HPLC和LC-MS分析。HPLC條件為:水(0.4%甲酸銨):乙腈=65: 35，流速0.8ml/min,柱溫35°C，檢測波長231nm，色譜柱為Agilent C18，進樣量15 μ 1，HPLC檢測結果如圖5所示，目標產(chǎn)物紫外吸收特征如圖6所示；LC-MS檢測條件，HPLC條件如上述，MS條件為:電噴霧離子源，正離子掃描方式?？梢婋p交換同框敲除ramo-orf29的基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物中已不存在雷莫拉寧組分，轉(zhuǎn)而產(chǎn)生無糖雷莫拉寧。
[0053]實施例5:從產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌發(fā)酵液中分離無糖雷莫拉寧
[0054]依照實施例4對Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29進行發(fā)酵培養(yǎng)，所得發(fā)酵液用18% HCl調(diào)節(jié)pH至3.5后過濾，濾餅經(jīng)水洗后用等體積甲醇抽提半小時以上，抽提兩次，通過減壓濃縮蒸干甲醇，制得無糖雷莫拉寧的粗提物濃縮液。將粗提物濃縮液PH調(diào)節(jié)至8后置于以匪100為填料的的柱子上端(柱高X直徑:經(jīng)乙醇與水v/v= I: 4混合物平衡)，分別用不同比例的乙醇與水混合物(v/v = 1: 4、1: 1、3: 2)作為流動相,流速lml/min洗脫雜質(zhì)。再以pH為4的乙醇與水混合物(v/v = 7:3)作為流動相,流速lml/min,分部收集流出液，采用實施例4所述方法進行跟蹤檢測，收集目的物含量達到85%以上的流出液，濃縮至干得到純化的無糖雷莫拉寧，收率為90%，純度達到85%。
[0055]實施例6:將ramo-orf29全序列完全敲除的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌的構建
[0056]在游動放線菌ATCC 33076的基因組DNA中將編碼參與雷莫拉寧生物合成的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的ramo-orf29基因核苷酸序列全部同框敲除,從而阻斷其表達來構建產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌。
[0057]首先設計同框敲除中斷引物:
[0058]左臂上游為5’ -AAAAAGCTT CCAGCACGGCCCGGTG-3’ ；
[0059]左臂下游為5’ -AAATCTAGA GGCGGCCAAGGCATCC-3’ ；
[0060]右臂上游為5’ -AAATCTAGA CAACCGACGTAGCACGACG-3 ’ ；
[0061]右臂下游為5 ’ -AAAGATATC GACCTTCCCGCCCCCG-3，。
[0062]依照實施例1中所述的方法分別克隆得到雙交換中斷質(zhì)粒的左臂和右臂，經(jīng)過測序，其序列與US 7635765中所公開的序列具有100% —致性。
[0063]將所得的左臂和右臂片段依照實施例2中所述的方法構建雙交換同框敲除質(zhì)粒PCJS2004。
[0064]將所得的pCJS2004依照實施例3中所述的方法構建敲除糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌 Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29-1。
[0065]依照實施例4所述方法對上述所得到的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29-1進行發(fā)酵，并對產(chǎn)物進行驗證，所得雙交換同框敲除ramo-orf29全部堿基的 基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物中已不存在雷莫拉寧組分，轉(zhuǎn)而產(chǎn)生無糖雷
莫拉寧。
[0066]實施例7:同框敲除ramo_orf29基因中457-1365位堿基的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌的構建
[0067]在游動放線菌A.ATCC 33076的基因組DNA中將編碼參與雷莫拉寧生物合成的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的ramo-orf29基因序列中457-1365位堿基同框敲除，從而阻斷其表達來構建產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌。
[0068]首先設計同框敲除中斷引物:
[0069]左臂上游為5’ -AAAAAGCTT ACGAGGGCGGGCTCGC-3’ ；
[0070]左臂下游為5’ -AAATCTAGA GATCGGCGTCGTGGCGA-3’ ；
[0071]右臂上游為5’ -AAATCTAGA GGCCTGCTGGCGGTGC-3’ ；
[0072]右臂下游為5’ -AAAGATATC TGTTGCCGCTGCCGAA-3’。
[0073]依照實施例1中所述的方法分別克隆得到雙交換中斷質(zhì)粒的1.5kb的左臂和1.5kb的右臂，經(jīng)過測序，其序列與US 7635765中所公開的序列具有100% —致性。
[0074]將所得的左臂和右臂片段依照實施例2中所述的方法構建雙交換同框敲除質(zhì)粒PCJS3004。
[0075]將所得的pCJS2004依照實施例3中所述的方法構建敲除糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌 Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29-2。
[0076]依照實施例4所述方法對上述所得到的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌Actioplanessp.ATCC 33076.D29-2進行發(fā)酵，并對產(chǎn)物進行驗證，所得雙交換同框敲除ramo_orf29基因457-1365位堿基的基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物中已不存在雷莫拉寧組分，轉(zhuǎn)而產(chǎn)生無糖雷
莫拉寧。
[0077]實施例8:同框敲除ramo-orf29基因中937-1788位堿基的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌的構建
[0078]在游動放線菌A.ATCC 33076的基因組DNA中將編碼參與雷莫拉寧生物合成的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的ramo-orf29基因序列中937-1788位堿基同框敲除，從而阻斷其表達來構建產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌。
[0079]首先設計同框敲除中斷引物:
[0080]左臂上游為5’ -AAAAAGCTT GCCGACAAGCGTGCACG-3 ’ ；
[0081]左臂下游為5’ -AAATCTAGA ATCCGCGGCAAGCGCC-3’ ；
[0082]右臂上游為5’ -AAATCTAGA TGCGCCACCGTGCCG-3’ ；
[0083]右臂下游為5 ’ -AAAGATATC CCGCGATGGAGCCGAT-3，。
[0084]依照實施例1中所述的方法分別克隆得到雙交換中斷質(zhì)粒的1.5kb的左臂和
1.5kb的右臂，經(jīng)過測序，其序列與US 7635765中所公開的序列具有100% —致性。
[0085]將所得的左臂和右臂片段依照實施例2中所述的方法構建雙交換同框敲除質(zhì)粒PCJS3004。
[0086]將所得的pCJS2004依照實施例3中所述的方法構建敲除糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌 Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29-3。
[0087] 依照實施例4所述方法對上述所得到的產(chǎn)無糖雷莫拉寧基因工程菌Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29-3進行發(fā)酵，并對產(chǎn)物進行驗證，所得雙交換同框敲除ramo-orf29基因937-1788位堿基的基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物中已不存在雷莫拉寧組分，轉(zhuǎn)而產(chǎn)生無糖雷莫拉寧。
【權利要求】
1.一種產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌，其是一種抑制或敲除了產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌野生菌株中糖基轉(zhuǎn)移酶基因的基因工程菌。
2.如權利要求1所述的基因工程菌，所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因為產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌野生菌株的ramo-orf29基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1的2727-4586位所示。
3.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌野生菌株是游動放線菌 Actinoplanes sp.ATCC 33076。
4.如權利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌野生菌株的ramo-orf29基因被全部抑制或敲除。
5.如權利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌野生菌株的ram0-0rf29基因的第322-723位的核苷酸片段被抑制或敲除。
6.如權利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌野生菌株的ramo-orf29基因的第457-1365位的核苷酸片段被抑制或敲除。
7.如權利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌野生菌株的ram0-0rf29基因的第 937-1788位的核苷酸片段被抑制或敲除。
8.—種重組穿梭載體，其特征在于，其包含由在產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌野生菌株基因組中與ramo-orf29基因連鎖的上游基因或其片段、ramo_orf29基因5’端片段、ram0-0rf29基因3’端片段、以及在產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌野生菌株基因組中與ramo-orf29基因連鎖的下游基因或其片段依次連鎖組成的DNA片段。
9.如權利要求8所述的重組穿梭載體，其特征在于，所述的依次連鎖組成的DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。
10.如權利要求8所述的重組穿梭載體，其特征在于，所述重組穿梭載體的骨架是質(zhì)粒PKC1139。
11.一種轉(zhuǎn)化子，其特征在于，其包含權利要求8-10任一項所述的重組穿梭載體。
12.如權利要求11所述的轉(zhuǎn)化子，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化子的宿主細胞是大腸桿菌ET12567。
13.一種制備如權利要求1所述的產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌的方法，其特征在于，包括將權利要求11或12任一項所述的轉(zhuǎn)化子與產(chǎn)雷莫拉寧的游動放線菌接合，挑選同源雙交換接合子。
14.一種制備無糖雷莫拉寧或其衍生物的方法，包括培養(yǎng)如權利要求1-7任一項所述的產(chǎn)無糖雷莫拉寧的基因工程菌，從培養(yǎng)物中獲得無糖雷莫拉寧或其衍生物。
【文檔編號】C12P21/02GK103911336SQ201310002563
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月4日 優(yōu)先權日:2013年1月4日
【發(fā)明者】陳代杰, 李繼安, 陳俊升, 王元希, 邵雷, 林惠敏, 藍鴻 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院