專利名稱：與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域的分子標記，特別涉及兩個與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記。
背景技術：
黃瓜(Cucumissativus L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬(Cucurnis) —年蔓生的草本植物。黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我國主栽蔬菜作物之一。果實是黃瓜經(jīng)濟性狀最重要的部分，黃瓜果實屬于瓠果，由子房和花托共同發(fā)育而成。在黃瓜果實表皮上有一個重要的性狀是鮮亮程度，可以根據(jù)這一特征將黃瓜果實分為有光澤和無光澤兩類。黃瓜果實表皮光澤性狀不僅受自身基因的控制，同時還受到外在環(huán)境條件，比如蠟粉、嫁接和硅吸收的影響。蠟粉覆蓋在黃瓜表皮會間接影響到果皮的光澤亮度。但我們在試驗中發(fā)現(xiàn)，有些果實表皮覆有蠟粉層，即使將蠟粉層擦掉，果皮仍然表現(xiàn)為有光澤性狀。光澤與蠟粉層沒有必然的聯(lián)系。黃瓜果實光澤基因的研究始于1931年，光澤性狀是由d(glossy fruit skin)基因調控,無光澤(dull fruit skin) (D)為顯性,有光澤(d)為隱性。2011年苗晗等利用148個重組自交系(RIL)群體將光澤基因初步定位于第五染色體SSR標記SSR15818和SSR06003之間，遺傳距離分別為7.7cM和6.0cM，詳細結果可以參看=Miao H等在《Euphytica》(荷蘭植物育種雜志)2011年第182卷167-176頁發(fā)表的題為《A linkage map of cultivated cucumber (Cucumis sativus L.) with248microsatellite marker loci and seven genes for horticulturalIy importanttraits》(使用248個多態(tài)標記位點和7個重要的農藝性狀基因構建黃瓜遺傳圖譜)一文，但上述研究還存在分析群體相對較小，與光澤基因d遺傳距離相對較遠等問題。黃瓜育種中發(fā)現(xiàn)黃瓜有光澤的果實很多都是無瘤類型，但也有少數(shù)具有果瘤性狀的果實也有的具有光澤性狀，所以果實光澤和無瘤性狀是兩個獨立的性狀，但兩性狀間存在緊密的連鎖關系。還有研究指出光澤性狀與果實果皮顏色一致基因(U)和小刺基因
(SS)存在緊密連鎖關系,詳細結果可以參看:Yuan XJ等在《Euphytica》(荷蘭植物育種雜志)2008年第 164卷473-491 頁發(fā)表的題為《Genetic mapping and QTL analysis of fruitand flower related traits in cucumber(Cucumis sativus L.)using recombinantinbred lines))(使用重組自交系對黃瓜果實和花相關性狀進行QTL分析和遺傳作圖)一文，因此，光澤基因d的研究將有助于促進第五染色體其它重要農藝性狀的基因的研究，為黃瓜遺傳和育種工作奠定基礎。隨著生物技術水平的不斷發(fā)展，克隆目的基因的方法也層出不窮，圖位克隆方法利用分離群體的遺傳連鎖分析或染色體異常將基因定位到染色體的一個具體位置的基礎上，通過構建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標記，不斷縮小候選區(qū)域進而克隆該基因。SSR(Simple Sequence Repeats)標記具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高和廣泛適用的優(yōu)點，找到與光澤基因d緊密連鎖的分子標記，可為進一步克隆光澤基因d打下堅實的基礎。
隨著人們生活水平的提高，品質育種已提到重要位置。黃瓜果實光澤性狀屬于感觀品質范疇。歐洲類型的具有光澤性狀的黃瓜由于具有鮮艷和光亮的外表，同時能長時間保存和運輸?shù)葍?yōu)點，一直深受廣大消費者的喜愛，其市場價格為普通黃瓜的2-3倍。黃瓜光澤基因d控制光澤性狀的形成，它的研究將會推動品質育種進程。用與目的性狀緊密連鎖的分子標記進行標記輔助選擇在黃瓜遺傳育種中是十分有效的方法，分子標記是在DNA水平上對目標性狀進行選擇，具有高效、快速、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點，可在苗期進行選擇，加快黃瓜育種的進程。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的，在于克 服現(xiàn)有技術的不足，提供兩個與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:一個與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記，命名為Y L37，由SEQ ID N0.1所示的DNA片段和SEQ ID N0.2所示的DNA片段組成；其中SEQ ID N0.1所示的DNA片段與光澤基因d連鎖，SEQ ID N0.2所示的DNA片段與無光澤基因D連鎖。上述與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記，由SEQ ID N0.5所示的上游引物和SEQ IDN0.6所示的下游引物擴增得到。該引物由上海生工合成。一個與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記，命名為YL112，由SEQ ID N0.3所示的DNA片段和SEQ ID N0.4所示的DNA片段組成；其中SEQ ID N0.3所示的DNA片段與光澤基因d連鎖，SEQ ID N0.4所示的DNA片段與無光澤基因D連鎖。上述與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記，由SEQ ID N0.7所示的上游引物和SEQ ID N0.8所示的下游引物擴增得到。該引物由上海生工合成。本發(fā)明利用分子標記和染色體步移法，提供兩個與黃瓜果實光澤基因d更緊密連鎖的穩(wěn)定的SSR分子標記，光澤基因d在提供的兩個分子標記之間，遺傳距離在0.9cM之內，物理距離僅244.9Kb ;由于所有分子標記的開發(fā)均與已知的黃瓜基因組序列相關，由此而獲得的兩個分子標記之間的物理圖譜將有利于d基因的最終克隆，便于分子標記輔助育種體系的建立。本發(fā)明的分子標記可簡便、快速、高通量地應用于育種實踐。


:圖1為黃瓜果實光澤基因d的遺傳圖譜:左邊數(shù)值代表遺傳距離(單位:cM)，右邊標示代表已經(jīng)公開發(fā)表的引物，均位于第五染色體，光澤基因d位于2個側翼標記SCZ69和SSR16203 之間。圖2為標記YL37PCR擴增結果:S94為無光澤親本；S06為有光澤親本R代表兩親本雜交后代；F2隨機擴增代表在F2群體中隨機挑選的17有光澤或無光澤植株PCR擴增結果。下面的條帶代表與果實光澤基因d連鎖，上面的條帶代表與無光澤基因D連鎖。圖3為標記YL112PCR擴增結果:S94為無光澤親本；S06為有光澤親本R代表兩親本雜交后代；F2隨機擴增代表在F2群體中隨機挑選的17有光澤或無光澤植株PCR擴增結果。下面的條帶代表與果實無光澤基因D連鎖，上面的條帶代表與光澤基因d連鎖。圖4為黃瓜果實光澤基因d的染色體步移示意圖:YL37與YL112代表與d基因緊密連鎖的分子標記，這兩個標記之間的物理距離為244.9kb。SCZ69與SSR16203代表已經(jīng)公布的標記。拼接所用的是已經(jīng)公布的2個黃瓜品種基因組序列(http://cucumber,vcru.wise, edu/wenglab/gyl4-9930/index, html):分別使用的黃瓜品種 GY 14 的Scaffold000789、Scaffold02633 和黃瓜品種 9930 的 Scaffold000083 中的序列。X 代表F2群體剩余的交換株。
具體實施例方式一、遺傳分離群體的構建與交換單株的鑒定UF2群體的構建歐洲溫室類型自交系S06 (母本)，果實表皮有光澤且表面光滑、無果瘤。華南類型自交系S94(父本)，果實表皮無光澤且具有果瘤性狀，S06自交系和S52自交系已在YuanXJ等在《Euphytica》(荷蘭植物育種雜志)2008年第164卷473-491頁發(fā)表的題為《Geneticmapping and QTL analysis of fruit and flower related traits in cucumber(Cucumissativus L.)using recombinant inbred lines》(使用重組自交系對黃瓜果實和花相關性狀進行QTL分析和遺傳作圖)一文中公開。本實施例利用這兩個親本配制了雜交組合，F(xiàn)1果實為無光澤、有果瘤，F(xiàn)1代自交產(chǎn)生F2代群體。在842株F2個體中，鑒定有/無光澤表型，卡方分析法進行驗證，最后確定黃瓜果實光澤性狀是單基因控制的隱性性狀。二、光澤基因d的初步定位1、黃瓜基因組DNA的提取按常規(guī)方法一CTAB法提取親本及全部F2分離群體的葉片總DNA。2、有光澤(dd)和無 光澤(D_)基因池建立利用群體分離法(BSA)從F2分離群體中分別隨機選取有光澤株和無光澤株個體各10株，建立有光澤(dd)和無光澤(D_)黃瓜的基因池。3、遺傳圖譜的構建利用66對已經(jīng)公布的SSR04812和SSR04644之間的高密度飽和圖譜第五染色體上的分子標記，這些均是位于光澤基因d兩側的分子標記，然后對兩親本和兩個基因池進行多態(tài)性引物篩選，利用得到的11對多態(tài)性引物掃描214株隨機群體，統(tǒng)計單株得到的帶型使用MAPMAKER/EXP3.0軟件進行分析，利用Mapchart2.0軟件構建遺傳圖譜。最后獲得了光澤基因d兩翼最近的分子標記SCZ69和SSR16203，兩個標記之間的遺傳距離分別為0.3cM 和 0.6cM(參見圖1)。三、黃瓜基因組序列的兼并拼接與標記開發(fā)1、黃瓜基因組序列的兼并拼接利用已經(jīng)公布的黃瓜品種9930和GY14黃瓜基因組序列(http://cucumber,vcru.wise, edu/wenglab/gyl4_9930/index, html),將 SSR 分子標記 16203 序列掃描黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫中得到黃瓜品種9930的Scaffold000083，黃瓜品種gyl4的Scaffold02633，將Scaffold000083的末端序列掃描黃瓜基因組GY14數(shù)據(jù)庫得到Scaffold000083。Scaffold000083序列中含有SCAR標記SCZ69序列，用DNAMAN軟件對這3個Scaffold序列比對，兼并拼接得到SCAR標記SCZ69和SSR標記16203之間總長度422.8kb的序列。2、遺傳分子標記的開發(fā)
通過SSR分析軟件對獲得的422.8kb序列進行掃面分析，對獲得的155個SSR位點用引物設計軟件Primer Premier5.0對設計引物,在兩親本間進行PCR擴增并使用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最后鑒定出8個具有多態(tài)性的標記。四、光澤基因d的精細定位利用新開發(fā)的8個多態(tài)性SSR位點再次掃描F2群體的842株個體。尋找標記基因型(通過分析顯隱親本獲得)與性狀表現(xiàn)型(有光澤/無光澤)的差別單株，獲得標記與光澤基因d基因的交換單株。位于基因兩側的多態(tài)性標記向交換株逐漸減少的方向步移，最后距離光澤基因d兩側最近的2個SSR位點在兩親本間產(chǎn)生差異(參見圖2和圖3)，隨后對其進行測序并獲得SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4中的序列信息，這兩個標記分別命名為YL37和YLl 12，標記YL37和YLl 12在842株大群體中剩余的交換株分別剩余3株和4株(本研究中的其他新開發(fā)的6個標記未公開)。所有SSR標記 PCR 反應體系均為:黃瓜 DNA20ng，雙向引物各 0.2ymol/L，200ymol/L dNTPs, 2mmol/LMgCl2,1 X Taq緩沖液，0.5U TaqDNA聚合酶，總反應體系為10 μ 1，其中TaqDNA聚合酶購于Promega 公司。擴增程序為:94°C 3min ；35cycles, 94°C 20s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C 5min。上述標記YL37和YL112的PCR產(chǎn)物檢測方法均使用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液為1XTBE，50W恒功率，電泳lh。電泳后進行銀染。銀染方法為:將帶膠的玻璃板放入固定液中，在搖床上輕輕搖動至指示劑顏色褪去，其中固定液的組成為:冰醋酸、無水乙醇和蒸餾水，其體積比為1: 10: 100;用超純水洗Imin 3min ;將沖洗后的膠板放入染色液中搖動半小時，其中染色液的組分為2g/L硝酸銀；將染色后的膠板放入超純水中漂洗5s后放入裝有顯影液的塑料盒中，輕輕搖動至條帶清晰，放入自來水中沖洗3min ;室溫下干燥，干燥后拍照，其中顯影液是在IL蒸餾水中加入15gNa0H和3ml甲醛混勻得到的。五、多態(tài)性片段的回收、克隆和測序

將多態(tài)性片段從聚丙烯酰胺凝膠上切下，置于離心管中，用槍頭搗碎，加入超純水沖洗三遍，然后加入IOul超純水95°C水浴15min，快速離心取上清液，用相對應的SSR引物進行PCR擴增，PCR反應體系為:目標條帶DNA 5ul，引物0.5umol/L, 200umol/L dNTPs,IXTaq Buffer, 1.5mmol/L MgCl2, 2U Taq DNA 聚合酶，總反應體系為 50ul，其中 TaqDNA聚合酶購于Promega公司。目標條帶PCR擴增程序為:94°C 5min ；35cycles,94°C 30s ；50°C 30s ；72°C Imin ；72°C 5min。將 PCR 產(chǎn)物中加入 goldview 熒光染料 3ul，4°C 下放置IOmin讓染料同DNA結合，然后加入上樣緩沖液2ul，混勻后通過I %瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切下目標片段放入1.5ml的離心管中，用DNA回收試劑盒回收，其中DNA回收試劑盒為上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，產(chǎn)品號為Cat.N0.SK1132。將回收產(chǎn)物與載體連接采用上海申能博彩公司的PUCm-T vector系統(tǒng)。用電擊法將連有目標片段的T-vector轉化進入E.coli DH5 α感受態(tài)細胞，將菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基的平板上，涂好的平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑菌、搖菌及PCR菌液檢測，進行相關序列的測定。以上兩個新開發(fā)的分子標記經(jīng)過分離群體驗證，均與光澤基因d基因位點緊密連鎖(參見圖4，圖中X表示剩余的交換株)。由于都是特異性PCR擴增，故這些標記具有高穩(wěn)定。利用這些標記構建的高密度遺傳和物理圖譜，將有助于黃瓜光澤基因d的最終克隆。
本發(fā)明利用有光澤親本S06和無光澤親本S94雜交獲得F1, F1再自交獲得842株F2分離群體。使用已經(jīng)公布的第五染色體的66對引物對兩親本和2個基因池進行篩選，利用獲得的11個多態(tài)性標記對214株隨機F2個體帶型分析，然后使用MAPMAKER/EXP3.0分析軟件和Mapchart2.0軟件構建了遺傳圖譜，獲得了與光澤基因d兩翼最近的分子標記SCZ69和SSR16203。利用已經(jīng)公布的黃瓜品種9930和gyl4黃瓜基因組序列(http://cucumber,vcru.wise, edu/wenglab/gyl4-9930/index, html),能夠將 SCAR 標記 SCZ69 和 SSR 標記SSR16203之間的序列兼并拼接。拼接所用的gyl4黃瓜基因組序列有:Scaffold0789、Scaffold02633，拼接所用的9930黃瓜基因組序列有:Scaffold000083，拼接后的序列總長度為422.8kb。然后再用SSR分析軟件找出SSR位點，設計引物軟件，對422.8kb序列分析設計了 155個引物對，鑒定出8個親本間有多態(tài)性的引物，然后分別篩選出F2群體842個單株的交換株。位于基因兩側的多態(tài)性標記向交換株逐漸減少的方向步移，最后確定最近的兩側標記在光澤基因d位點間分別還有3和4個交換單株。上述黃瓜染色體步移的詳細情況如圖4所示。本發(fā)明中圖1涉及的分子標記已全部公開。詳細參看Zhang Wff等在《Theoreticaland Applied Genetics))(理論應用遺傳學)2012年第124卷第2期249-259頁發(fā)表的題為〈〈Construction of a high density integrated genetic map forcucumber (Cucumissativus L.》(黃瓜高密度遺傳整合圖譜的構建)一文。本發(fā)明中PCR產(chǎn)物克隆測序中所使用的E.coli DH5a菌株已在文獻《李欣，等。電轉化法制備高轉化效率的E.coli感受態(tài)細胞研究。食品與生物技術學報，2007，26 (6) 48 51》中公開；本發(fā)明中涉及的E.coli DH5a菌株可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，購于寶生物工程(大連)有限公司，公司地址:大連經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)東北二街19號。序列表〈110〉上海交通大學〈120〉與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記<160>8〈210〉I<211>170<212>DNA〈213〉黃瓜(Cucumis sativus L.)〈400〉Itcctcatcat tgccactctt gcttggtctt ctctcttcgt cttgcaggta tatatatata60tatatatata tatatgttta tgcatgtgtg gtaaaatcaa tagttttgtt tgaagtgatt120ctaactgctt caaaatcact tccaaaccct tgcagaatca ggcgttgaag170<210>2<211>172<2 12>DNA〈213〉黃瓜(Cucumis sativus L.)<400>2tcctcatcat tgccactctt gcttggtctt ctctcttcgt cttgcaggta tatatatata60
權利要求
1.一個與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記，命名為YL37，由SEQ IDN0.1所示的DNA片段和SEQ ID N0.2所示的DNA片段組成；其中SEQ ID N0.1所示的DNA片段與光澤基因d連鎖，SEQ ID N0.2所示的DNA片段與無光澤基因D連鎖。
2.根據(jù)權利要求1所述的與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記，其特征在于:由SEQ ID N0.5所示的上游引物和SEQ ID N0.6所示的下游引物擴增得到，其PCR擴增程序為:94°C 5min ；35cycles,94°C 20s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
3.一個與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記，命名為YLl 12，由SEQ ID N0.3所示的DNA片段和SEQ ID N0.4所示的DNA片段組成；其中SEQ ID N0.3所示的DNA片段與光澤基因d連鎖，SEQ ID N0.4所示的DNA片段與無光澤基因D連鎖。
4.根據(jù)權利要求3所述的與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記，其特征在于:由SEQ ID N0.7所示的上游引物和SEQ ID N0.8所示的下游引物擴增得到，PCR擴增程序為:94°C 5min ；35cyc les,94°C 20s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
全文摘要
本發(fā)明提供了兩個與黃瓜果實光澤基因d緊密連鎖的分子標記，第一個命名為ＹL-37，由SEQ ID NO.1所示的DNA片段和SEQ ID NO.2所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO.1所示的DNA片段與光澤基因d連鎖，SEQ ID NO.2所示的DNA片段與無光澤基因D連鎖。第二個命名為ＹL112，由SEQ ID NO.3所示的DNA片段和SEQ ID NO.4所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO.3所示的DNA片段與光澤基因d連鎖，SEQ ID NO.4所示的DNA片段與無光澤基因D連鎖。本發(fā)明的兩個分子標記與已經(jīng)公開的SCAR標記SCZ69和SSR標記SSR16203標記相比，與光澤基因d位點的連鎖更加緊密；本發(fā)明已經(jīng)將光澤基因d定位在244.9Kb區(qū)間，對關于有光澤/無光澤果實的黃瓜分子標記輔助育種體系的建立更有幫助。
文檔編號C12N15/11GK103184219SQ20131000256
公開日2013年7月3日 申請日期2013年1月5日 優(yōu)先權日2013年1月5日
發(fā)明者潘俊松, 楊緒勤, 李月, 蔡潤, 何歡樂 申請人:上海交通大學