一種無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法
【專利摘要】一種無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法，本發(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基或其與F12培養(yǎng)基的混合；外源添加物包括激素、轉(zhuǎn)金屬蛋白、谷氨酰胺、脂類濃縮劑、抗氧化劑、嘌呤、糖類和細(xì)胞生長(zhǎng)因子。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)為：未添加動(dòng)物源性或重組白蛋白，避免了可能攜帶的安全隱患，降低培養(yǎng)基成本；適用于成纖維細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)，并保持較好的細(xì)胞形態(tài)，與血清組細(xì)胞的狀態(tài)和功能相似；不需采用貼壁因子包被，原代24h貼壁率＞60%，傳代24h貼壁率＞80%，與血清組細(xì)胞無(wú)差異；能滿足多次傳代需要，且傳至15代后生長(zhǎng)狀況仍保持與血清組細(xì)胞狀態(tài)相似；將成纖維細(xì)胞從含血清培養(yǎng)中直接轉(zhuǎn)入本發(fā)明培養(yǎng)，細(xì)胞可順利貼壁伸展，不需逐漸適應(yīng)過(guò)程。
【專利說(shuō)明】一種無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程皮膚是目前組織工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)，近年來(lái)已經(jīng)有許多產(chǎn)品應(yīng)用于臨床。組織工程皮膚研發(fā)中需要解決的一大問(wèn)題是種子細(xì)胞(即表皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞)的大規(guī)模體外培養(yǎng)。
[0003]傳統(tǒng)的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清，但是血清的使用會(huì)帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)隱患:①血清中含有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子和毒性因子，有潛在細(xì)胞毒性血清組分復(fù)雜，批次間質(zhì)量存在差異，增加了產(chǎn)品質(zhì)量控制的難度和不穩(wěn)定性；③目前血清中各組分及其含量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的作用機(jī)制尚不清楚，給研發(fā)和應(yīng)用帶來(lái)不便；④從安全性角度考慮，血清中潛在的病原微生物(如引起牛海綿狀腦炎的朊病毒)，給血清的使用帶來(lái)了不容忽視的安全隱患；⑤由于血清培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)很難通過(guò)普通分離方法徹底去除，，從而造成細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物分離純化難度較高，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的最終質(zhì)量。這些不利因素促使了培養(yǎng)方法的改進(jìn)，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基替代血清培養(yǎng)基。
[0004]目前針對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的研發(fā)主要集中在以下幾種細(xì)胞:疫苗生產(chǎn)細(xì)胞(例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞等)、干細(xì)胞(例如間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞等)和其他細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等)。無(wú)血清培養(yǎng)基針對(duì)性很強(qiáng)，沒(méi)有廣泛的適應(yīng)性，同類型的細(xì)胞、甚至不同細(xì)胞系或細(xì)胞株都可能有各自的無(wú)血清培養(yǎng)基，對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的適應(yīng)往往不同。成纖維細(xì)胞因其增殖具有血清依賴性，在無(wú)血清條件下培養(yǎng)較為困難，所以目前針對(duì)成纖維細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基很少，僅有少數(shù)外國(guó)企業(yè)的無(wú)血清培養(yǎng)基，主要有:ATCC 公司的 Fibroblast Growth Kit Serum-Free, Sciencell 公司的 FibroblastMedium-serum free (FM_sf)和 HyClone 公司的 FetalClone? III 等產(chǎn)品。國(guó)內(nèi)尚無(wú)同類產(chǎn)品，也未見(jiàn)文獻(xiàn)或?qū)＠_(kāi)有用于成纖維細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的詳細(xì)資料。[0005]目前，用于其他細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基存在的共同問(wèn)題:①白蛋白作為血清的主要成分，是無(wú)血清培養(yǎng)基中普遍的添加成分，由于牛血清白蛋白(BSA)為動(dòng)物源性蛋白，可能攜帶致病因子；目前的無(wú)動(dòng)物源性培養(yǎng)基多是采用重組白蛋白(HSA)替代BSA，導(dǎo)致培養(yǎng)基成本較高。②血清中含有多種貼壁因子，依賴血清的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)則不易貼壁，所以在無(wú)血清培養(yǎng)貼壁細(xì)胞時(shí)，需要提前包被貼壁因子，增加了操作的復(fù)雜性，而且常用的貼壁因子(如膠原、多聚賴氨酸、纖連蛋白、層粘連蛋白等)價(jià)格昂貴，提高了培養(yǎng)基成本。③多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)基的使用需給細(xì)胞一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，逐步降低培養(yǎng)基中血清濃度，最終過(guò)渡到無(wú)血清培養(yǎng)；另外，在用于原代培養(yǎng)時(shí)，還需要額外添加2%的血清，使其不成為真正意義上的無(wú)血清培養(yǎng)。④無(wú)血清培養(yǎng)基傳代次數(shù)較少，例如，ATCC公司的Fibroblast GrowthKit Serum-Free培養(yǎng)基在說(shuō)明書中明確指出，培養(yǎng)10代之后細(xì)胞增殖速率減緩。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種針對(duì)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，其中不添加白蛋白和貼壁因子，能夠避免血清中復(fù)雜成分造成的潛在隱患，使成纖維細(xì)胞接近在含血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)增殖狀態(tài)，從而滿足規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的需要。
[0007]本發(fā)明所提出的無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基與外源添加物組成，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM商用培養(yǎng)基，或DMEM商用培養(yǎng)基與F12商用培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基；外源添加物包括激素、轉(zhuǎn)金屬蛋白、谷氨酰胺、脂類濃縮劑、抗氧化劑、嘌呤、糖類和細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
[0008]所述的混合培養(yǎng)基按體積比DMEM培養(yǎng)基為I~3份、F12培養(yǎng)基為1份；所述的外源添加物為:胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)為I~20 mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白為I~20 mg/L,谷氨酰胺為I~10 mM，三碘甲狀腺氨酸(T3)為0.01~5 μ Μ，氫化可的松為0.01~5mg/L，地塞米松為0.01~10 μ g/L,乙醇胺為5~30 μ M，腺嘌呤為5~30 mg/L,葡聚糖為10~30g/L,亞硒酸鈉為I~15 μ g/L, 2_巰基乙醇為50~100 μ Μ,維生素E (Ve)為2~20mg/L，維生素C (Vc)為2~50mg/L，脂類濃縮劑為lmL/L，堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)為I~50 μ g/L，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)為I~10μ g/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β )為I~10μ g/L，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)為I~10 μ g/L。[0009]本發(fā)明的無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，不添加動(dòng)物源性白蛋白和重組白蛋白以及貼壁因子，適用于人成纖維細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)，以及由血清環(huán)境直接轉(zhuǎn)入無(wú)血清環(huán)境的人成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)，所培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)與含血清培養(yǎng)的效果一致。
[0010]細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)必須加有活性因子，以取代血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)，如各種激素、生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，其中起主要作用的有3~4種，普遍認(rèn)為胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、谷氨酰胺和亞硒酸鈉是無(wú)血清培養(yǎng)中的必需成份。
[0011]本發(fā)明組分中激素的作用為:激素是血清的重要成分之一，無(wú)血清培養(yǎng)基中激素缺乏會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法正常增殖。本發(fā)明組分中包含了血清激素的幾種主要組分，能最大限度的模擬血清環(huán)境，滿足細(xì)胞生長(zhǎng)，其中所含激素類化合物的作用如下。
[0012]胰島素和IGF:在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，缺乏血清會(huì)使細(xì)胞的有絲分裂停止在細(xì)胞周期的Gl期，使細(xì)胞失去分裂能力，最終衰老死亡；胰島素及IGF能夠激活包括小分子G蛋白R(shí)as在內(nèi)的幾種信號(hào)通路,最終激活MAPKs (Mitogen-activated protein kinases),啟動(dòng)DNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，使細(xì)胞由Gl期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖；
T3是甲狀腺激素的主要活性成分，在細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、發(fā)育及維持機(jī)體平衡穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠促進(jìn)DNA合成和細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)T3還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵代謝的作用；
地塞米松和氫化可的松:屬于糖皮質(zhì)激素，對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖作用是雙向的，受細(xì)胞來(lái)源、接種密度、細(xì)胞代謝狀態(tài)、激素作用時(shí)間長(zhǎng)短等因素影響，對(duì)細(xì)胞起促進(jìn)或抑制作用；在本發(fā)明的濃度范圍內(nèi)，這兩種糖皮質(zhì)激素能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0013]本發(fā)明組分中的抗氧化劑的作用為:細(xì)胞的生理代謝會(huì)產(chǎn)生自由基，自由基在細(xì)胞內(nèi)聚集會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，這種過(guò)氧化物能破壞細(xì)胞膜及其亞細(xì)胞器膜的結(jié)構(gòu)，使膜腫脹、融合從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)，因缺少血清中的抗氧化體系，細(xì)胞更容易積累自由基，因此需要通過(guò)添加抗氧化劑保護(hù)細(xì)胞不受自由基損傷。本發(fā)明與其他無(wú)血清培養(yǎng)基相比，抗氧化劑種類從常用的一兩種增加至四種，依靠多種抗氧化劑之間的協(xié)同作用，能有效控制細(xì)胞氧化損傷，大大延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)。
[0014]Ve和V。:維生素E能阻止類脂的氧化作用，清除脂質(zhì)自由基，防止不飽和脂肪酸過(guò)氧化物的生成，對(duì)生物膜起保護(hù)作用。Ve與硒共同使用，能降低組織中過(guò)氧化物的水平。維生素C能中和體內(nèi)所產(chǎn)生的自由基，從而減輕自由基所造成的氧化損傷，參與生物氧化和還原及細(xì)胞呼吸過(guò)程，同時(shí)有促進(jìn)酪氨酸和色氨酸代謝以及膠原合成作用。V。與Ve共同使用具有協(xié)同效應(yīng)，Vc能將生育酚氧自由基再生轉(zhuǎn)化為VE，同時(shí)通過(guò)清除氧自由基來(lái)減少Ve的消耗；
亞硒酸鈉:硒是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的必需成分，參與過(guò)氧化物的分解，通過(guò)添加亞硒酸鈉增加GSH-Px的活性，能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生抗氧化保護(hù)作用；
2-巰基乙醇:常用于二硫鍵的還原，在培養(yǎng)基中可以作為抗氧化劑，使谷胱甘肽維持在還原狀態(tài)，有效提高細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽(GSH)的含量，從而通過(guò)GSH抵御過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞的損傷。
[0015]本發(fā)明中所含細(xì)胞生長(zhǎng)因子的作用為:血清中含有多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子能加強(qiáng)蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄，加速細(xì)胞由G0-G1、Gl-S期的轉(zhuǎn)換，縮短細(xì)胞群體倍增時(shí)間，促進(jìn)細(xì)胞分裂與增殖；缺乏細(xì)胞生長(zhǎng)因子，成纖維細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)增殖緩慢，傳代次數(shù)減少的現(xiàn)象。
[0016]本發(fā)明中所含合成前體的作用為:脂類濃縮劑能提供細(xì)胞膜合成及細(xì)胞生長(zhǎng)所需的脂質(zhì)，本發(fā)明使用的商用脂類濃縮劑主要成分包括:花生四烯酸、亞油酸、豆蘧酸、亞麻酸、油酸、膽固醇、棕櫚烯酸、棕櫚酸、硬脂酸。腺嘌呤是核酸的組成成分，在體內(nèi)參與RNA和DNA合成，在促進(jìn)細(xì)胞分裂中起活化作用。乙醇胺是磷脂和細(xì)胞膜合成的前體物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。
[0017]本發(fā)明中所含轉(zhuǎn)金屬蛋白的作用為:成纖維細(xì)胞表面有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物結(jié)合是細(xì)胞獲取必需微量元素鐵的主要來(lái)源，轉(zhuǎn)鐵蛋白還具有生長(zhǎng)因子的性質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并與其他微量元素如釩等結(jié)合，有助于細(xì)胞吸收。缺少轉(zhuǎn)鐵蛋白，細(xì)胞將因無(wú)法吸收微量元素而死亡。
[0018]本發(fā)明中所含谷氨酰胺的作用為:谷氨酰胺是細(xì)胞培養(yǎng)基中的必需成分，可作為細(xì)胞生長(zhǎng)的主要能源和氮源，是細(xì)胞合成嘌呤、嘧啶、蛋白質(zhì)及多肽必需的氨基酸，谷氨酰胺的缺乏會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。
[0019]本發(fā)明中所含葡聚糖的作用為:細(xì)胞滲透壓對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)至關(guān)重要，培養(yǎng)基中滲透壓的改變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞收縮或溶脹，使DNA和蛋白遭到破壞，細(xì)胞周期停滯，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本 申請(qǐng)人:通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葡聚糖具有滲透壓緩沖能力，可用于維持培養(yǎng)基中的正常滲透壓，使細(xì)胞免受損傷；葡聚糖同時(shí)對(duì)激素、生長(zhǎng)因子等也具有非特異的保護(hù)作用。
[0020]本發(fā)明無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法為:采用超純水配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；為使培養(yǎng)效果更好，可在DMEM培養(yǎng)基中混入F12培養(yǎng)基，得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基；在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中先加入葡聚糖攪拌溶解，再分別加入三碘甲狀腺氨酸、氫化可的松、地塞米松、腺嘌呤、亞硒酸鈉、2-巰基乙醇、VE、Vc、脂類濃縮劑、谷氨酰胺、乙醇胺、bFGF、EGF、TGF- β、TOGF、胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白；調(diào)PH至7.2，定容后用濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0021]采用本發(fā)明 無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞按以下操作:1)將消化后獲得的成纖維細(xì)胞用PBS溶液清洗，離心后用無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，按
0.5X IO4~5X IO4個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)；2)培養(yǎng)I天后換液，之后每2~3天換液一次；3)待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至60%時(shí)，可進(jìn)行傳代。
[0022]采用本發(fā)明無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代成纖維細(xì)胞按以下操作:1)將消化獲得的細(xì)胞用PBS溶液清洗，離心后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按IX IO4~5X IO4個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)；2)每2~3天換液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)，進(jìn)行下一次傳代。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:①未添加動(dòng)物源性白蛋白和重組白蛋白，避免了可能攜帶的安全隱患，同時(shí)降低了培養(yǎng)基成本，有利于規(guī)?；囵B(yǎng)；②同時(shí)適用于人成纖維細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)，而且原代培養(yǎng)不添加血清，原代細(xì)胞在本發(fā)明培養(yǎng)基中能夠保持較好的細(xì)胞形態(tài)，呈細(xì)長(zhǎng)梭狀、邊緣清晰、伸展良好，細(xì)胞增殖旺盛，與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞狀態(tài)相似(見(jiàn)附圖2);③在培養(yǎng)成纖維細(xì)胞前不需要用貼壁因子包被，實(shí)驗(yàn)證明，原代和傳代成纖維細(xì)胞均可以貼壁，原代24小時(shí)貼壁率在60%以上，傳代24小時(shí)貼壁率在80%以上，與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞無(wú)差異能滿足多次傳代需要，培養(yǎng)代數(shù)較長(zhǎng)，本發(fā)明培養(yǎng)基能維持成纖維細(xì)胞從原代傳至15~20代，且傳至15代后仍然能保持與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞相似的生長(zhǎng)狀況，細(xì)胞在無(wú)血清組中伸展良好，形態(tài)為長(zhǎng)梭形，懸浮細(xì)胞少，分布均一，呈單層極性排列(見(jiàn)附圖1);實(shí)驗(yàn)證明，將相同數(shù)量的細(xì)胞分別接種至含血清培養(yǎng)基和本發(fā)明無(wú)血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6天后，含血清組與無(wú)血清組中的細(xì)胞密度相差不明顯，說(shuō)明成纖維細(xì)胞在本發(fā)明培養(yǎng)基中增殖速率與含血清培養(yǎng)基接近或相當(dāng)，生長(zhǎng)前期無(wú)血清組細(xì)胞增殖速率甚至稍快于血清對(duì)照組(見(jiàn)附圖3) 將成纖維細(xì)胞從含血清培養(yǎng)基中直接轉(zhuǎn)移至本發(fā)明培養(yǎng)基中，細(xì)胞可順利貼壁伸展，不需逐漸適應(yīng)無(wú)血清的生長(zhǎng)環(huán)境；⑥成纖維細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)能保持與血清組相似的功能，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)不同培養(yǎng)基中成纖維細(xì)胞分泌的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)含量，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞在本發(fā)明培養(yǎng)基中分泌的KGF含量與血清組相差不大，說(shuō)明本發(fā)明培養(yǎng)基中成纖維細(xì)胞功能未受到影響(見(jiàn)附圖4)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]附圖1為采用本發(fā)明無(wú)血清培養(yǎng)基與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的傳代成纖維細(xì)胞效果對(duì)比的顯微照片，其中A為無(wú)血清培養(yǎng)組(無(wú)血清組)，B為含血清培養(yǎng)組(血清組)；通過(guò)觀察兩組細(xì)胞形態(tài)，可知成纖維細(xì)胞在本發(fā)明培養(yǎng)基中傳至15代后依舊保持與血清組相似的生長(zhǎng)狀況，說(shuō)明無(wú)血清培養(yǎng)基足以維持成纖維細(xì)胞的良好生長(zhǎng)。
[0025]附圖2為采用本發(fā)明無(wú)血清培養(yǎng)基與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)比的顯微照片，其中C為無(wú)血清組的細(xì)胞形態(tài)，D為血清組的細(xì)胞形態(tài)，E為無(wú)血清組從原代傳至第20代的細(xì)胞形態(tài)，F(xiàn)為血清組從原代傳至第20代的細(xì)胞形態(tài)；可以看出，本發(fā)明培養(yǎng)基能夠成功培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)與血清組相似，且從原代傳至第20代仍保持穩(wěn)定的細(xì)胞形態(tài)。
[0026]附圖3為采用本發(fā)明無(wú)血清培養(yǎng)基與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)比曲線，圖中SFM曲線(serum-free medium)為無(wú)血清組的，SCF曲線(serum-contentmedium)為血清組的，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中增殖速率與含血清培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)接近。[0027]附圖4為采用本發(fā)明無(wú)血清培養(yǎng)基與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞分泌角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)的ELISA檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表，結(jié)果顯示，兩組之間KGF含量相差不大，無(wú)血清組甚至略高，說(shuō)明本發(fā)明培養(yǎng)基所培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的功能與血清組的相似。
【具體實(shí)施方式】
[0028]以下結(jié)合實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)方案的【具體實(shí)施方式】和使用效果。
[0029]實(shí)例中所使用的DMEM商用培養(yǎng)基和F12商用培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司，各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子購(gòu)自peprotech公司，脂類濃縮劑購(gòu)自Gibco公司，其余試劑均購(gòu)自sigma公司。
[0030]實(shí)施例1、人成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)
配制培養(yǎng)基:將DMEM培養(yǎng)基與F12培養(yǎng)基按3: I的體積比混合；按30g/L加入葡聚糖攪拌溶解后，再分別加入三碘甲狀腺氨酸5 μ Μ、氫化可的松5mg/L、地塞米松5 μ g/L、腺嘌呤20mg/L、亞硒酸鈉15 μ g/L、2_巰基乙醇50 μ M、Ve 5mg/L>Vc 50mg/L、脂類濃縮劑ImL/L、谷氨酰胺 5mM、乙醇胺 5 μ M、bFGF 50 μ g/L、EGF 10 μ g/L、TGF-β 10 μ g/L、PDGF 10 μ g/L、胰島素10mg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白10mg/L ;用HCI溶液調(diào)pH至7.2，定容后用0.2 μ m濾膜過(guò)濾除菌，得到無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基。[0031]使用實(shí)例:將消化后的人成纖維細(xì)胞用PBS溶液清洗；離心后用所配制的無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，按2X IO4個(gè)/cm2接種至培養(yǎng)瓶中，置入培養(yǎng)箱在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)；24h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)，之后每隔2d換液。原代細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中能較快貼壁，24h內(nèi)貼壁率可達(dá)60~70%，10天左右細(xì)胞達(dá)到60%匯合，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0032]原代細(xì)胞在本發(fā)明培養(yǎng)基中能夠保持較好的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)梭狀、邊緣清晰、伸展良好，細(xì)胞增殖旺盛，與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞狀態(tài)相似(參見(jiàn)附圖2)。
[0033]實(shí)施例2、人成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
配制培養(yǎng)基:以DMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按10g/L加入葡聚糖攪拌溶解后，再分別加入三碘甲狀腺氨酸I μ Μ、氫化可的松0.05mg/L、地塞米松0.05 μ g/L、腺嘌呤30mg/L、亞硒酸鈉2 μ g/L、2-巰基乙醇100 μ M、Ve 5mg/L、Vc 10mg/L、脂類濃縮劑lmL/L、谷氨酰胺2mM、乙醇胺 20 μ M、bFGF 10 μ g/L、EGF 5 μ g/L、TGF- β 2 μ g/L、PDGF 2 μ g/L、胰島素樣生長(zhǎng)因子5mg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白5mg/L ;用HCI溶液調(diào)pH至7.2，定容后用0.2 μ m濾膜過(guò)濾除菌，得到無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0034]使用實(shí)例1:將實(shí)施例1原代培養(yǎng)至60%匯合的細(xì)胞消化后，用PBS溶液清洗，離心棄上清后用本實(shí)例所配制無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按I X IO4個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種，置于37°C、5% CO2條件培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；每隔3天換一次液，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)，可進(jìn)行下一次傳代。
[0035]使用實(shí)例2:將含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞用PBS清洗以去除殘余血清；經(jīng)胰蛋白酶消化后，用PBS溶液清洗一次，離心棄上清后用本實(shí)例所配制的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按2 X IO4個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)；每隔2d換一次液，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)，可進(jìn)行下一次傳代。
[0036]傳代細(xì)胞24h內(nèi)貼壁率可達(dá)80%，細(xì)胞生長(zhǎng)3~4d后可傳代，無(wú)論是從原代細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，還是從血清培養(yǎng)中直接轉(zhuǎn)移至無(wú)血清培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，均可在無(wú)血清培養(yǎng)基中傳15代左右，且后期依舊能保持與血清組相似的生長(zhǎng)狀況，細(xì)胞伸展良好，形態(tài)為長(zhǎng)梭形，懸浮細(xì)胞少，分布均一，呈單層極性排列(參見(jiàn)附圖1)。
【權(quán)利要求】
1.一種無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基與外源添加物組成，其特征在于，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，或DMEM培養(yǎng)基與F12培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基；外源添加物包括激素、轉(zhuǎn)金屬蛋白、谷氨酰胺、脂類濃縮劑、抗氧化劑、嘌呤、糖類和細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的混合培養(yǎng)基按體積比DMEM培養(yǎng)基為I~3份、F12培養(yǎng)基為1份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的外源添加物為:胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子為1~20 mg/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白為1~20 mg/L,谷氨酰胺為1~10 mM,三碘甲狀腺氨酸為0.01~5 μ M,氫化可的松為0.01~5mg/L,地塞米松為0.01~10 μ g/L,乙醇胺為5~30 μ M,腺嘌呤為5~30 mg/L,葡聚糖為10~30g/L,亞硒酸鈉為1~15 μ g/L, 2_巰基乙醇為50~100 μ M，Ve為2~20mg/L, Vc為2~50mg/L,脂類濃縮劑為lmL/L, bFGF為1 ~50 μ g/L, EGF 為 1 ~10 μ g/L, TGF- β 為 1 ~10 μ g/L, PDGF 為 1 ~10 μ g/L。
4.制備權(quán)利要求1所述的無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其特征在于，采用超純水配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中先加入葡聚糖攪拌溶解，再分別加入三碘甲狀腺氨酸、氫化可的松、地塞米松、腺嘌呤、亞硒酸鈉、2-巰基乙醇、VE、V。、脂類濃縮劑、谷氨酰胺、乙醇胺、bFGF、EGF、TGF-13、H)GF、胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白；調(diào)pH至7.2，定容后用濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103911339SQ201310003115
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2013年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月6日
【發(fā)明者】賀曉靜 申請(qǐng)人:陜西博鴻生物科技有限公司