專利名稱：一種花藥培養(yǎng)分子標(biāo)記檢測(cè)鑒別煙草Va基因型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體為煙草質(zhì)量性狀抗病性轉(zhuǎn)育的目的基因型篩選技術(shù)。
背景技術(shù)：
煙草馬鈴薯Y病毒病，又稱為脈斑病，是由馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)引起的蚜傳病毒病，在中國北方煙區(qū)危害嚴(yán)重，在南方煙區(qū)的危害呈上升趨勢(shì)。為選育抗病品種，國內(nèi)外鑒定出多個(gè)抗PVY的種質(zhì)資源，如VAM、V. SCR等，并育成抗病白肋煙品種TN86、TN90和烤煙品種NC55、NC102等。大部分抗源的抗性表現(xiàn)為隱性基因(va)控制，是由于對(duì)PVY感病的基因缺失造成的。并開發(fā)出與Va位點(diǎn)相關(guān)的分子標(biāo)記 (RAPD、SCAR) (Noguchi S. ,Mol Gen Genet, 1999, 262:822-829;Julio et al. , TheorApplGenet. 2006，112(2) :335-346.)?？緹煼N質(zhì)RY5對(duì)PVY壞死株系(PVYn)的抗性符合孟德爾一對(duì)隱性基因控制的質(zhì)量性狀的遺傳模型，已報(bào)道與抗病基因?qū)?yīng)的顯性等位基因位點(diǎn)(Va)緊密連鎖的RAPD標(biāo)記012V3695與SCAR標(biāo)記PVYMEl (王貴等，分子植物育種,2012, 10 (I) : 97-103)。但缺乏共分離的可區(qū)分VaVa與Vava的分子標(biāo)記，回交轉(zhuǎn)育va位點(diǎn)時(shí)，不能直接利用分子標(biāo)記輔助選擇。通常采用測(cè)交方法篩選Vava單株，每回交一代需要測(cè)交并接種篩選一次，比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。煙草花藥培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)便，能在2個(gè)月左右培養(yǎng)出單倍體苗。理論上Vava植株的花培單倍體后代，Va單株與va單株的比例為1:1。因此，采用分子標(biāo)記檢測(cè)花培單倍體后代，能快速鑒定出Va單株與va單株的比例，從而間接鑒定出基因型為Vava的單株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有測(cè)交鑒定VaVa與Vava單株的方法存在之不足，提供一種花藥培養(yǎng)分子標(biāo)記檢測(cè)鑒別煙草Va基因型的方法，這是一種新的花藥培養(yǎng)標(biāo)記檢測(cè)的方法，能有效提高轉(zhuǎn)育煙草va位點(diǎn)的效率和煙草品種選育效率。本發(fā)明的技術(shù)原理為煙草為二倍體植物，基因型為VaVa的植株，產(chǎn)生Va的一種雄配子?；蛐蜑閂ava的植株，產(chǎn)生Va和va兩種雄配子。采用花藥培養(yǎng)方法，可獲得單個(gè)雄配子發(fā)育而成的單倍體苗。通過檢測(cè)來源于某個(gè)單株的一定數(shù)量的單倍體苗中Va和va基因型苗的比例，即可鑒定該單株的Va基因型是否純合與雜合。本發(fā)明根據(jù)煙草花藥培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)便成熟、煙草抗PVY的va位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的Va位點(diǎn)已有分子標(biāo)記文獻(xiàn)報(bào)道，通過組合花藥培養(yǎng)和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，鑒定煙草Va基因型?；ㄋ幣囵B(yǎng)標(biāo)記檢測(cè)與測(cè)交接種方法比較，具有節(jié)省時(shí)間、減少收種工作量、所需光照培養(yǎng)室的空間很小，日常管理人工少等優(yōu)點(diǎn)。而采用測(cè)交接種方法，需要對(duì)2倍數(shù)量的單株收種，并進(jìn)行育苗、盆栽、接種病原菌、調(diào)查抗性分離情況等一系列工作。由于冬春季氣溫低，在南方日光型溫室中耗時(shí)較長(5個(gè)月左右)、育苗、盆栽和接種需要的溫室面積較大，日
常管理人工多。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)—種花藥培養(yǎng)分子標(biāo)記檢測(cè)鑒別煙草Va基因型的方法，其特征在于采集待鑒定煙草單株的花藥，利用花藥培養(yǎng)出單倍體苗，檢測(cè)單倍體苗的標(biāo)記分離情況，根據(jù)標(biāo)記分離情況鑒定單株的基因型是否為純合體和雜合體。所述的每個(gè)待鑒定煙草單株的花藥培養(yǎng)出至少4株單倍體苗，取每株單倍體苗的葉片，提取DNA，檢測(cè)與煙草PVY抗性基因Va位點(diǎn)緊密相關(guān)的RAPD標(biāo)記012V3695與SCAR標(biāo)記PVYME1，根據(jù)標(biāo)記的實(shí)際分離比與理論分離比的吻合情況，分析單株的Va基因型是否為純合體和雜合體。單株花藥培養(yǎng)單倍體苗獲得對(duì)需要鑒定基因型的單株，采集花冠與花萼等長的花蕾，每株采集10個(gè)左右。參照文獻(xiàn)(陳學(xué)軍等，植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2011，20 (I) :65-68)花藥培養(yǎng)。隨機(jī)選擇10株左右花藥培養(yǎng)單倍體苗，轉(zhuǎn)移至新的生根培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)至 約4-5片葉。采集每株單倍體苗的葉片用于Va分子標(biāo)記檢測(cè)?；ㄋ幣囵B(yǎng)單倍體苗分子標(biāo)記檢測(cè)采用市售試劑盒或者CTAB方法提取葉片總基因組DNA。采用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA質(zhì)量，質(zhì)量合格的DNA樣品，用O. 5XTE溶液稀釋至3(T50ng/l·! L，_20°C保存?zhèn)溆?。與PVY抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測(cè)采用下列引物擴(kuò)增獲得，包括但不限于SCAR標(biāo)記引物PVYMEl (Julio et al.，TheorAppl Genet. 2006，112(2) :335-346.)，目標(biāo)條帶 HZbpt5RAPD標(biāo)記012V3695 (Noguchi S. ,MolGen Genet, 1999,262:822-829)，目標(biāo)條帶695bp。引物和PCR試劑購自市售公司。PCR反應(yīng)在基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系體積為20 μ L，其中3(T50ng/ μ L DNA樣品2. 5 μ L、10 X PCRbuf fer2. O μ L, 2. 5mM dNTPs2. 5 μ L, 10 μ M 弓 I 物 1.5yL，5U/yL rTaq DNA 酶
0.5μ L, ddH201L O μ L。PVYMEl 擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30sec，62°C退火45sec，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min，4°C保存。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)標(biāo)記的目的條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。單株基因型結(jié)果分析花藥培養(yǎng)單倍體苗擴(kuò)增出Va的目標(biāo)條帶，判斷為Va標(biāo)記陽性，花藥培養(yǎng)單倍體苗未擴(kuò)增出Va的目標(biāo)條帶，判斷為Va標(biāo)記陰性。若某個(gè)單株的花藥培養(yǎng)單倍體苗的Va標(biāo)記陽性株數(shù)與陰性株數(shù)的比例符合1:0的理論分離比，則該單株的基因型為VaVa。若某個(gè)單株的花藥培養(yǎng)單倍體苗的Va標(biāo)記陽性株數(shù)與陰性株數(shù)的比例符合1:1的理論分離比，則該單株的基因型為Vava。常用的煙草馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)抗源的抗性表現(xiàn)為隱性基因(va)控制，烤煙抗PVY育種，需要鑒定單株Va基因是否為雜合體和純合體；目前已有Va基因型的RAPD標(biāo)記012V3695與SCAR標(biāo)記PVYME1，由于缺少Va共顯性的DNA標(biāo)記或相斥相標(biāo)記，不能直接采用分子標(biāo)記篩選雜合體和純合體；本發(fā)明采集待鑒定煙草單株的花藥，利用花藥培養(yǎng)出單倍體苗，檢測(cè)單倍體苗的標(biāo)記分離情況，根據(jù)標(biāo)記分離情況鑒定單株的Va基因型是否為純合體和雜合體。本發(fā)明與常規(guī)測(cè)交方法相比，具有相對(duì)省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為花藥培養(yǎng)單倍體苗的PVYMEl標(biāo)記檢測(cè)成像記錄。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例11.1植物材料轉(zhuǎn)育va位點(diǎn)的回交I代單株由烤煙種質(zhì)RY5(PVY抗病親本)和烤煙種質(zhì)Coker176(PVY感病親本)常規(guī)雜交回交獲得。1. 2花藥培養(yǎng) 對(duì)田間株型較好的單株，采集花冠與花萼等長的花蕾，每株采集10個(gè)左右。參照文獻(xiàn)(陳學(xué)軍等，植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2011，20(1) :65-68)花藥培養(yǎng)。每個(gè)單株隨機(jī)選擇10株左右花藥培養(yǎng)單倍體苗(簡(jiǎn)稱花培苗)，轉(zhuǎn)移至新的生根培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)至約4-5片葉。采集O.1g葉片組織，用于DNA提取。1. 3分子標(biāo)記檢測(cè)采用試劑盒(DNeasyPlant Mini Kit, Qiagen, GmbH Germany)提取煙草總基因組DNA。采用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA質(zhì)量，將質(zhì)量合格的DNA樣品，用
O.5 X TE溶液稀釋至3(T50ng/ μ L，_20°C保存?zhèn)溆谩ＥcPVY抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測(cè)采用 SCAR 標(biāo)記引物 PVYMEl (Julio et al. , Theor Appl Genet. 2006, 112(2) :335-346.)，目標(biāo)條帶172bp。PCR試劑購自寶生物公司。PCR反應(yīng)在BIO-RAD基因擴(kuò)增儀上(BI0-RAD，ClOOOThermal Cycler)上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系體積為20 μ L，其中30 50ng/ μ L DNA樣品2. 5 μ LUOXPCR buffer2. 0μ L,2. 5mM dNTPs2. 5 μ L，10 μ M引物1. 5 μ L，5U/μ L rTaq DNA酶 0· 5 μ L，ddH201L O μ L。PVYMEl 擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30sec，62°C退火45sec，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min，4°C保存。采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，Marker為IOObp分子量標(biāo)準(zhǔn)(大連寶生物公司)。1. 4回交I代的Vava雜合體篩選在將抗PVY的隱性基因位點(diǎn)(va)回交轉(zhuǎn)育至栽培品種(基因型VaVa)時(shí)，F(xiàn)1的基因型為Vava，BC1F1的后代出現(xiàn)兩種基因型(VaVa和Vava)。繼續(xù)回交時(shí)，需要預(yù)先挑選出Vava單株。對(duì)BC1單株取花藥培養(yǎng)出單倍體苗，利用分子標(biāo)記檢測(cè)單倍體群體的標(biāo)記分離情況，鑒定出BC1F1的Vava單株。對(duì)6個(gè)回交I代(BC1)單株分別花藥培養(yǎng)，獲得單倍體群體(6株/群體)，SCAR標(biāo)記PVYMEl標(biāo)記檢測(cè)，其中I號(hào)至6號(hào)單株的單倍體群體的陰性苗數(shù)與陽性苗數(shù)比例表現(xiàn)為2:4或3:3分離，表明這6個(gè)單株的Vava基因雜合。其中7號(hào)單株的單倍體群體的陰性苗數(shù)與陽性苗數(shù)比例表現(xiàn)為0:6分離，表明該單株的Vava基因純合。表I利用花藥培養(yǎng)單倍體苗的Va標(biāo)記檢測(cè)篩選Vava雜合體
權(quán)利要求
1.一種花藥培養(yǎng)分子標(biāo)記檢測(cè)鑒別煙草Va基因型的方法，其特征在于采集待鑒定煙草單株的花藥，利用花藥培養(yǎng)出單倍體苗，檢測(cè)單倍體苗的標(biāo)記分離情況，根據(jù)標(biāo)記分離情況鑒定單株的基因型是否為純合體和雜合體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于每個(gè)待鑒定煙草單株的花藥培養(yǎng)出至少4 株單倍體苗，取每株單倍體苗的葉片，提取DNA，檢測(cè)與煙草PVY抗性基因Va位點(diǎn)緊密相關(guān)的RAPD標(biāo)記012V3695與SCAR標(biāo)記PVYMEl，根據(jù)標(biāo)記的實(shí)際分離比與理論分離比的吻合情況，分析單株的Va基因型是否為純合體和雜合體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的煙草單株花藥培養(yǎng)單倍體苗時(shí)，對(duì)需要鑒定基因型的單株，采集花冠與花萼等長的花蕾，每株采集10個(gè)左右，隨機(jī)選擇10株左右花藥培養(yǎng)單倍體苗，轉(zhuǎn)移至新的生根培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)至4-5片葉，采集每株花藥培養(yǎng)單倍體苗的葉片用于Va分子標(biāo)記檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述花藥培養(yǎng)單倍體苗擴(kuò)增出Va的目標(biāo)條帶，判斷為Va標(biāo)記陽性，花藥培養(yǎng)單倍體苗未擴(kuò)增出Va的目標(biāo)條帶，判斷為Va標(biāo)記陰性；單株的花藥培養(yǎng)單倍體苗的Va標(biāo)記陽性株數(shù)與陰性株數(shù)的比例符合1:0的理論分離 t匕，則該單株的基因型為VaVa;若單株的花藥培養(yǎng)單倍體苗的Va標(biāo)記陽性株數(shù)與陰性株數(shù)的比例符合1:1的理論分離比，則該單株的基因型為Vava。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種花藥培養(yǎng)分子標(biāo)記檢測(cè)鑒別煙草Va基因型的方法，常用的煙草馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)抗源的抗性表現(xiàn)為隱性基因(va)控制，烤煙抗PVY育種，需要鑒定單株Va基因是否為雜合體和純合體；目前已有Va基因型的RAPD標(biāo)記O12V3695與SCAR標(biāo)記PVYME1，由于缺少Va共顯性的DNA標(biāo)記或相斥相標(biāo)記，不能直接采用分子標(biāo)記篩選雜合體和純合體；本發(fā)明采集待鑒定煙草單株的花藥，利用花藥培養(yǎng)出單倍體苗，檢測(cè)單倍體苗的標(biāo)記分離情況，根據(jù)標(biāo)記分離情況鑒定單株的Va基因型是否為純合體和雜合體。本發(fā)明與常規(guī)測(cè)交方法相比，具有相對(duì)省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103014170SQ201310003218
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2013年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月6日
發(fā)明者劉勇, 陳學(xué)軍, 肖炳光, 盧秀萍, 王貴, 楊彥明 申請(qǐng)人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院