一種專用藥材pcr反應(yīng)增強(qiáng)劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法領(lǐng)域，具體涉及中藥材領(lǐng)域，特別涉及一種中藥材PCR擴(kuò)增反應(yīng)液。其特征在于包含PCR擴(kuò)增反應(yīng)增強(qiáng)劑，具體為1-10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和5-100mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。使用以上混合試劑可以明顯增強(qiáng)中藥材DNA條形碼通用引物PCR擴(kuò)增的成功率，進(jìn)而提高PCR擴(kuò)增效率。
【專利說明】—種專用藥材PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法領(lǐng)域，具體涉及中藥材領(lǐng)域，涉及一種中藥材PCR擴(kuò)增反應(yīng)液。特別用于藥材通用引物PCR的擴(kuò)增。
【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),簡(jiǎn)稱PCR,是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。
[0003]近年來，分子鑒定技術(shù)已被應(yīng)用于藥材鑒別，其中以PCR技術(shù)為核心的藥材鑒定方法已較為成熟。如RAH)和AP-PCR等方法，Cheung等人采用AP-PCR法建立能夠區(qū)別人參和西洋參的 DNA 指紋圖譜(Cheung K S, Kwan H S, But P P H et al.Pharmacognosticalidentificationof American and oriental ginseng roots by genomic fingerprintingusing arbitrarily primedpolymerase chain reaction (AP-PCR).Journal ofEthnopharmacology, 1994,42 (I):67-69)。曹輝等人用該方法成功的鑒定了中藥材地膽草與白花地膽草混淆品(曹輝，畢培曦，邵鵬柱.中藥材苦地膽的DNA指紋鑒定.中藥材，1996,19(12) =608-612)及蒲公英與6種土公英混淆品(曹輝，畢培曦，邵鵬柱.香港市蒲公英及其混淆品土公英的DNA指紋鑒別研究.1997，22 (4) =197-200)。
[0004]但由于藥材來源復(fù)雜，其DNA純度和濃度往往不能滿足PCR的需求，嚴(yán)重制約了藥材分子鑒定的效率。研制藥材專用PCR增強(qiáng)劑，提高藥材DNA的PCR成功率，對(duì)于節(jié)約研究成本、縮短實(shí)驗(yàn)周期、促進(jìn)藥材分子鑒定技術(shù)的推廣具有重要的意義。
[0005]PCR增強(qiáng)劑包括二甲基亞砜(DMSO)，牛血清白蛋白(BSA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，甜菜堿等。
[0006]本研究篩選獲得一種含有BSA和PVP等成分的PCR增強(qiáng)劑，并分別采用堿裂解法和CTAB法提取180種中藥材DNA，利用DNA條形碼通用引物ITS2、rbcL、psbA_trnH、trnL-trnF和matK進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)本發(fā)明的PCR增強(qiáng)劑進(jìn)行了適用性分析，建立了一種藥材專用PCR反應(yīng)液。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種中藥材PCR擴(kuò)增反應(yīng)液。使用本發(fā)明混合試劑可以明顯增強(qiáng)中藥材PCR擴(kuò)增的成功率，進(jìn)而提高擴(kuò)增效率。
[0008]所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，其特征在于包含PCR擴(kuò)增反應(yīng)增強(qiáng)劑，具體為牛血清白蛋白(BSA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
[0009]其中，牛血清白蛋白和聚乙烯吡咯烷酮都能夠提高PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率，同時(shí)減少體系中PCR抑制物對(duì)反應(yīng)的影響。
[0010]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，牛血清白蛋白的濃度為1-10μ g/μ 1，聚乙烯吡咯烷酮的濃度為 2-50 μ g/μ I。
[0011]本發(fā)明篩選獲得一種PCR增強(qiáng)劑，并分別采用堿裂解法和CTAB法提取180種中藥材 DNA,利用 DNA 條形碼通用引物 ITS2、rbcL、psbA-trnH、trnL-trnF 和 matK 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)±曾，對(duì)PCR增強(qiáng)劑的適用性進(jìn)行了分析，建立了一種藥材專用PCR反應(yīng)液。本PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑可以應(yīng)用于中藥材ITS2、rbcL、psbA-trnH等DNA barcoding通用條形碼的擴(kuò)增。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1: 10種藥材PCR擴(kuò)增對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果
[0013]1.玉竹；2.天葵子；3.黃芪；4.地骨皮；5.天葵子；6.紫菀；7.貓爪草；8.蓮須；
9.黑豆； 10.荔枝核；11.玉竹；12.天葵子；13.黃芪；14.地骨皮；15.天葵子；16.紫菀；17.貓爪草；18.蓮須；19.黑豆；20.荔枝核；M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn):從上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp
【具體實(shí)施方式】
[0014]1 材料
[0015]2012年自安徽亳州藥材市場(chǎng)，隨機(jī)收集市售藥材178份，其中包括50個(gè)果實(shí)種子類、22個(gè)葉及全草類、20個(gè)花類、6個(gè)莖木類、57個(gè)根及根莖類、3個(gè)動(dòng)物類藥材以及20個(gè)其它類藥材。
[0016]2藥材DNA提取將藥材研磨成粉末，取0.03g粉末，利用改良CTAB法提取藥材總DNA，提取緩沖液為 2 X CTAB 提取緩沖液(pH8.0)，包括 IOOmM Tris、25mM EDTAU.4M NaCl、2% CTAB。
[0017]3藥材DNA快速提取將藥材研磨成粉末，取0.0Olg粉末，利用堿裂解法提取藥材總DNA，提取緩沖液為 0.1M Tris-Hcl，0.5M NaOH, I % PVP, I % Triton-100 幾種混合溶液。
[0018]4PCR 反應(yīng)
[0019]以藥材DNA為模版，分別利用DNA條形碼通用引物ITS2、rbcL、psbA-trnH、trnL-trnF和matK進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見表1。PCR反應(yīng)體系包括:模板DNAI μ L(IOOmmol *L_1), 2XTaq PCR MasterMix 13 μ L(10mmol.L-1)，引物(IOpmol *L_1) I μ L,牛血清白蛋白(1-10 μ g/μ 1)0.5 μ L，聚乙烯吡咯烷酮(2-50 μ g/μ I) I μ L，0.5U Taq酶，加入ddH20補(bǔ)足到25 μ L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s, 47°C _56°C退火lmin，72°C延伸lmin40s，循環(huán)40次；72°C后延伸7min。反應(yīng)結(jié)果后，取PCR反應(yīng)液各5 μ L經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳lh，溴化乙錠染色，SYNGENE型凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)照相。
[0020]表1引物序列
[0021]
【權(quán)利要求】
1.一種專用藥材PCR反應(yīng)液，其特征在于所述反應(yīng)液中包含牛血清白蛋白(BSA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一種或兩種。
2.權(quán)利要求1的反應(yīng)液，其特征在于所述反應(yīng)液中包含牛血清白蛋白(BSA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
3.權(quán)利要求1的反應(yīng)液，其還包含DNA聚合酶，所用DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶。
4.一種專用藥材PCR反應(yīng)液，其特征在于反應(yīng)液的成分包含10-50mM Tris-Hcl(pH8.0)、20-60Mm KCU2.0-5.0mM Mg2+、0.2-0.4mM dNTP、0.1 % -1 % BSA、0.5% -5% PVP、0.04U-0.4UTaq DNA 聚合酶。
5.一種專用藥材PCR方法，其特征在于所述方法包含使用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的反應(yīng)液的步驟。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103911364SQ201310004034
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2013年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月7日
【發(fā)明者】黃璐琦, 袁媛, 李旻輝, 蔣超, 崔占虎 申請(qǐng)人:中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所