專利名稱：大豆凝集素基因lec-s 的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及大豆凝集素基因Iec-S的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是一種植物正鏈RNA病毒,可侵染38科268種植物，引起多種重要的植物病毒病(Scholthof，2004)。由于TMV抗逆性極強(qiáng)，對(duì)寄主專性寄生，加上植物缺乏完整的免疫代謝系統(tǒng)，使得該病很難防治。甜菜夜蛾最初產(chǎn)生于東南亞，但在世界范圍內(nèi)也是一種重要的蟲害，可以危害多種園藝作物及蔬菜(Smaggheet al，2003)?；瘜W(xué)藥劑的使用是目前防治植物病蟲害的一種重要措施，但化學(xué)藥劑的濫用對(duì)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品安全造成了嚴(yán)重的影響。而近年來(lái)植物抗病蟲基因工程的發(fā)展則為防治植物病蟲害提供了一條新途徑，主要思路是將抗性相關(guān)基因通過(guò)基因工程手段轉(zhuǎn)入受體植物中，從而獲得植物抗病蟲新品種，而且較傳統(tǒng)育種具有基因資源多、育種周期短等特點(diǎn)(Kang et al,2005)。凝集素是一種能凝集紅細(xì)胞、多糖或糖復(fù)合物的非免疫來(lái)源的糖蛋白。目前為止，人們已經(jīng)從多種植物、動(dòng)物、細(xì)菌、病毒和真菌中分離出凝集素(Tateno et al，1998 ；ffanget al, 1996 ；Inamori and Saito, 1999 ；Leteux and Chai, 2000) 迄今為止已發(fā)現(xiàn)的許多凝集素中，植物凝集素是最大的一個(gè)家族。在這些植物中，尤以豆科植物的種子中凝集素含量最為豐富。植物凝集素在植物中具有重要的防御功能。以往的許多研究報(bào)道表明，植物凝集素可以提高植物對(duì)真菌、細(xì)菌、線蟲等多種病原物和有害昆蟲的抗性(Ye et al,2001 ；Ooi et al, 2000 ；Machuka and Oladapo, 2000)。但關(guān)于大豆凝集素抗植物病毒的研究還未見報(bào)道。在發(fā)明人的前期工作中，利用RACE和反向PCR技術(shù)從大豆品種合豐29號(hào)中分離得到一個(gè)新的大豆凝集素基因，命名為lec-s (DQ235094)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種新的大豆凝集素基因lec-s的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):大豆凝集素基因lec-s在培育抗病和/或抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物品種中的應(yīng)用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登錄號(hào)為DQ235094。其中，所述的抗病為抗煙草花葉病毒，所述的抗蟲指抗甜菜夜蛾。含有大豆凝集素基因lec-s的重組質(zhì)粒在培育抗病和/或抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物品種中的應(yīng)用其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登錄號(hào)為DQ235094。其中，所述的抗病為抗煙草花葉病毒，所述的抗蟲指抗甜菜夜蛾。

有益效果:轉(zhuǎn)基因煙草由于其基因轉(zhuǎn)化技術(shù)成熟，從侵染到獲得再生苗的周期較短，已被作為一個(gè)模式工作系統(tǒng)，常被用來(lái)進(jìn)行植物抗病蟲性研究。本發(fā)明對(duì)大豆凝集素基因Iec-S進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因煙草及其抗病抗蟲性的研究，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV表現(xiàn)出顯著的抗性，對(duì)甜菜夜蛾也表現(xiàn)良好抗性。qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)果也表明，與轉(zhuǎn)空載體煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草接種TMV后12h和24h，煙草中防衛(wèi)基因PR-la, Pal和GSTl和HR標(biāo)志基因hsr515均顯著上調(diào)表達(dá)，并且最終表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV的抗性增強(qiáng)。所以，我們推斷，lec-s基因在煙草體內(nèi)表達(dá)，可能同時(shí)激活了煙草中的抗病性SA信號(hào)通路和過(guò)敏性細(xì)胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)信號(hào)通路,賦予了煙草對(duì)TMV的抗性?？梢妼⒋蠖鼓鼗騦ec-s通過(guò)基因工程手段轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，能夠獲得具有抗病性以及抗蟲性的轉(zhuǎn)基因植物新品種。


圖llec-s 基因 RT-PCR 擴(kuò)增圖(A)和 pMD18-T Simple:: lec-s (B)的酶切驗(yàn)證圖A:M.分子量標(biāo)記(DNA Marker DL2000);1 2.從大豆品種29中擴(kuò)增lec_s; 3.清水對(duì)照B:M.分子量標(biāo)記(DNA Marker DL2000) ; 1.Sma I 和 Xba I 酶切 pMD18_T Simple:: lec-s圖2大豆凝集素lec-s基因編碼的氨基酸同其它大豆凝集素的同源比較有*的位點(diǎn)是相似性高的位置圖3植物重組表達(dá)質(zhì)粒pBI121::lec-s構(gòu)建圖譜LB.T-DNA左邊界；RB.T-DNA右邊界；npt I1.新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；Pr0.啟動(dòng)子；Ter.終止子；gus.β -半乳糖醒酸酶基因圖4植物表達(dá)載體ρΒΙ 121:: lec-s構(gòu)建酶切圖Ml.分子量標(biāo)記(DNA Marker DL2000) ；M2.分子量標(biāo)記(DNA Marker DL15000)；Γ2.質(zhì)粒 pBI121:: lec-s 用 Sma I 和 Xba I 雙酶切；3.質(zhì)粒 pBI121 用 Sma I 和 Xba I 雙酶切。圖5重組載體pBI121:: lec-s轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR驗(yàn)證M.分子量標(biāo)記(DNA Marker DL2000) ;ff.陰性對(duì)照，清水；P.陽(yáng)性對(duì)照，質(zhì)粒pBI121:: lec-s ;1 3.不同的轉(zhuǎn)化子。圖6轉(zhuǎn)基因煙草Ttl代的PCR檢測(cè)A、B:Μ.分子量標(biāo)記(DNA Marker DL2000) ；P.陽(yáng)性對(duì)照，質(zhì)粒 pBI121:: lec_s ;W.陰性對(duì)照，清水；CK.陰性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化植株；f 45.轉(zhuǎn)基因植株；C:M.分子量標(biāo)記(DNA Marker DL2000) ；P.陽(yáng)性對(duì)照，質(zhì)粒pBI121 ；ff.陰性對(duì)照，清水；CK.陰性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化植株；f 24.轉(zhuǎn)空載體植株。圖7轉(zhuǎn)基因植株Ttl代的Southern雜交分析M.分子量標(biāo)記(DNA Marker DL2000, λ -Hind III digest)； 1.陽(yáng)性對(duì)照，lec_s PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.未轉(zhuǎn)化植株；3.轉(zhuǎn)空載體植株；4 8.轉(zhuǎn)基因植株圖8 \代轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV的抗性WT.未轉(zhuǎn)化煙草；VEC.轉(zhuǎn)空載體煙草；T1-11，Τ1-20.轉(zhuǎn)基因煙草圖OT1代轉(zhuǎn)基因煙草接種TMV后病 斑數(shù)差異比較WT.未轉(zhuǎn)化煙草；VEC.轉(zhuǎn)空載體煙草；T1-11，Τ1-20.轉(zhuǎn)基因煙草；數(shù)據(jù)表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示與轉(zhuǎn)空載體煙草相比在0.05水平上差異顯著
圖1OqRT-PCR測(cè)定防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)A:接種TMV后12h ;B.接種TMV后24h ；WT.未轉(zhuǎn)化煙草；VEC.轉(zhuǎn)空載體煙草； B:T1-11，T1-20.轉(zhuǎn)基因煙草數(shù)據(jù)表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差；*表示與轉(zhuǎn)空載體煙草相比在0.05水平上差異顯
著圖1lT1代轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體重的影響WT.未轉(zhuǎn)化煙草；VEC.轉(zhuǎn)空載體煙草；T1-11，Τ1-20.轉(zhuǎn)基因煙草圖12 \代轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)甜菜夜蛾幼蟲化蛹率的影響WT.未轉(zhuǎn)化煙草；VEC.轉(zhuǎn)空載體煙草；T1-11，Τ1-20.轉(zhuǎn)基因煙草
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所涉及的材料及試劑:煙草品種為三生煙(Nicotiana tabacum cv.Samsun NN),取煙草葉片作為轉(zhuǎn)化材料。根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105、植物表達(dá)載體pBI121購(gòu)自Invitrogen0煙草組織培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，pH5.8，121°C滅菌15min。預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS+6BA0.5mg/L ;共培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS+6_BAlmg/L ;篩選培養(yǎng)基:MS+6-BAlmg/L+Kml00mg/L+Cb500mg/L ;生根培養(yǎng)基:1/2MS+Kml00mg/L+Cb200mg/L+IAA0.2mg/L ;農(nóng)桿菌培養(yǎng)用 YEB
培養(yǎng)基。Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、dNTPs、核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、DNase 1、PrimeScript Reverse Transcriptase 和 SYBR Premix ExTaq Kit 均購(gòu)自 TaKaRa 公司。質(zhì)粒抽提和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。植物RNA提取試劑盒Plant RNAKit購(gòu)自O(shè)mega公司?？敲顾?Kanamycin)、羧節(jié)青霉素(Carbenicillin)購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司。實(shí)施例1ρΒΙ121:: lec-s質(zhì)粒的構(gòu)建1.llec-s的克隆取大豆品種合豐29號(hào)葉片，使用Omega公司的Plant RNAKit植物RNA提取試劑盒提取大豆總RNA,用無(wú)RNase的DNase I處理純化。使用PrimeScript ReverseTranscriptase (Takara)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以I μ g總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶獲得cDNA第一鏈為模板，lec-s-F/lec-s-R為引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增的到兩端含有Xba I/Sma I酶切位點(diǎn)的lec-s基因片段。采用Axygen公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對(duì)PCR電泳條帶進(jìn)行回收。將回收的lec-s片段連接至測(cè)序載體pMD18-T Simple Vector,獲得質(zhì)粒pMD_18T Simple vector:: lec_s。質(zhì)粒 pMD_18T Simple vector:: lec_s 轉(zhuǎn)化 DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，使用Axygen公司的AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取初篩陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒,經(jīng)PCR篩選陽(yáng)性克隆，從經(jīng)PCR篩選的陽(yáng)性克隆中提取的質(zhì)粒，使用TaKaRa公司限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送測(cè)序。PCR反應(yīng)體系為:
權(quán)利要求
1.豆凝集素基因Iec-S在培育抗病和/或抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物品種中的應(yīng)用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登錄號(hào)為DQ235094。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抗病為抗煙草花葉病毒，所述的抗蟲指抗甜菜夜蛾。
3.有大豆凝集素基因lec-s的重組質(zhì)粒在培育抗病和/或抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物品種中的應(yīng)用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登錄號(hào)為DQ235094。
4.據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抗病為抗煙草花葉病毒，所述的抗蟲指抗甜菜夜蛾。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及大豆凝集素基因lec-s的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)大豆凝集素基因lec-s(GenBank登錄號(hào)為DQ235094)進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因煙草及其抗病抗蟲性的研究，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV表現(xiàn)出顯著的抗性，對(duì)甜菜夜蛾也表現(xiàn)良好抗性?？梢?，大豆凝集素基因lec-s可在培育抗病和/或抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物品種中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/29GK103088035SQ201310008139
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者高學(xué)文, 郭佩佩, 伍輝軍, 張巖 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)