專利名稱：番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因沉默表達(dá)載體，還涉及該基因沉默表達(dá)載體的構(gòu)建方法，以及該基因沉默表達(dá)載體在植物育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
番爺Hycopersicon esculentum Mill.)為爺科的一種重要農(nóng)作物,是全世界栽培最為普遍的果菜之一。必需脂肪酸是機體生命活動必不可少，但機體自身不能合成或合成速度慢無法滿足機體需要，必須由食物供給的多不飽和脂肪酸，主要包括α -亞麻酸和 亞油酸兩種。基因工程育種目前已成為植物育種領(lǐng)域的一個重要分支，在定向改良植物特性方面顯示出極大的潛力。近年來，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增加番茄的抗病蟲、抗除草劑和抗鹽堿性能的報道相對較多，但利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高番茄果實中不飽和脂肪酸含量尚未見報道。植物脂肪氧化酶(LOX)是一類含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，專一催化具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸(包括α-亞麻酸、亞油酸、花生四烯酸等)的加氧反應(yīng)，氧化生成具有共軛雙鍵的過氧化氫物。因此，沉默番茄脂肪氧化酶家族的表達(dá)，有望提高番茄中具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸特別是必需脂肪酸的含量。番爺中存在五個 LOX 同工酶基因TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD 和 TomloxE。其中，TomloxA、TomloxB和TomloxE相互之間的氛基酸序列一致性為72%_77%，TomloxC和TomloxD與TomloxA的氛基酸序列一致性分別為42%和47%, TomloxC與TomloxD的氛基酸序列一致性為46% ；TomloxA> TomloxB和TomloxE在果實中表達(dá)，TomloxC在成熟果實的轉(zhuǎn)色期和紅熟期可以檢測到，在葉片和花器中也有表達(dá)，而TomloxD主要在番茄葉中表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體，目的之二在于提供所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的構(gòu)建方法，目的之三在于提供含有所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的微生物轉(zhuǎn)化體，目的之四在于提供所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體在番茄植株育種中的應(yīng)用，目的之五在于提供利用所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體進(jìn)行番茄植株育種的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案1.番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體，含有一個雙鏈RNA表達(dá)單元，所述雙鏈RNA表達(dá)單元包括啟動子、TomloxA⑶拼接基因正向片段、TomloxA⑶拼接基因反向片段和終止子，所述TomloxACD拼接基因由TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段拼接而成，所述TomloxA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述TomloxC基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述TomloxD基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所
/Jn ο進(jìn)一步，所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體是以pBIN19載體為骨架，雙鏈RNA表達(dá)單元插入pBIN19載體的多克隆位點中，所述雙鏈RNA表達(dá)單元包括CaMV 35S啟動子、TomloxA⑶拼接基因正向片段、GFP基因開放讀碼框、TomloxA⑶拼接基因反向片段和CaMV 35S終止子。2.所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟
a.TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基 因片段的克隆以野生型番茄幼葉總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，再以所得cDNA第一鏈為模板，分別以TomA-f和TomA~r> TomC-f 和 TomC-r、TomD-f 和 TomD-r 為引物，PCR 擴增 TomloxA 基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段，所述TomA-f和TomA_r的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示，所述TomC-f和TomC-r的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 6和SEQ IDNo. 7所示，所述TomD-f和TomD-r的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示；然后，將所得TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段分別與pMD18_T載體連接，獲得重組質(zhì)粒TomloxA-T、TomloxC-T和TomloxD-T ；
b.TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段的拼接將重組質(zhì)粒TomloxA-T用BglII和SalI雙酶切，回收純化重組質(zhì)粒TomloxA-T線性片段，另將重組質(zhì)粒TomloxC-T用BamHI和SalI雙酶切，回收純化TomloxC基因片段，再將純化的重組質(zhì)粒TomloxA-T線性片段與TomloxC基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒TomloxAC-T ;然后，將重組質(zhì)粒TomloxAC-T用SalI單酶切，回收純化重組質(zhì)粒TomloxAC-T線性片段,另將重組質(zhì)粒TomloxD-T用XhoI和SalI雙酶切，回收純化TomloxD基因片段，再將純化的重組質(zhì)粒TomloxAC-T線性片段與TomloxD基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒TomloxACD-T ；
c.番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的構(gòu)建將重組質(zhì)粒TomloxA⑶-T用XbaI和SphI雙酶切，回收純化TomloxA⑶拼接基因片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的pDHG5. 2載體連接，獲得重組質(zhì)粒PDHG5. 2-GFP-rTomloxACD-T35S ;然后，將重組質(zhì)粒TomloxACD-T用KpnI和BamHI雙酶切，回收純化TomloxA⑶拼接基因片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒 pDHG5. 2-GFP-rTomloxACD-T35S 連接，獲得重組質(zhì)粒 pDHG5. 2-P35S-fTomloxACD-GFP-rTomloxACD-T35S ;再后，將重組質(zhì)粒 pDHG5. 2-P35S- fTomloxACD-GFP-rTomloxACD_T35S用EcoRI單酶切，回收純化P35S-fTomloxACD-GFP- rTomloxACD_T35S表達(dá)單元，再與經(jīng)同樣單酶切的植物表達(dá)載體PBIN19連接，即得番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體TomloxACD1-pBIN19。3.含有所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的微生物轉(zhuǎn)化體。
進(jìn)一步，所述微生物為農(nóng)桿菌，例如根瘤農(nóng)桿菌LBA4404。4.所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體在高不飽和脂肪酸果實番茄植株育種中的應(yīng)用，所述不飽和脂肪酸為具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸。進(jìn)一步，所述不飽和脂肪酸為α-亞麻酸和亞油酸。5.利用所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體獲得高不飽和脂肪酸果實番茄植株的方法，包括以下步驟
a.番茄外植體的制備將番茄種子用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液消毒，無菌水沖洗，再用飽和磷酸鈉溶液浸泡，無菌水沖洗，最后用體積分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉滅菌，無菌水沖洗，蒸餾水浸泡，播種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 6%的瓊脂、pH為5. 8的MS培養(yǎng)基上，在每天25 ± 2 °C光照16小時、18 ± 2 °C黑暗8小時、光照強度為100(T20001X的條件下培養(yǎng)；取培養(yǎng)兩周的無菌幼苗，剪除子葉的兩端部分，并將下胚軸剪成長O. 8^1. 2cm的小段，再將子葉和下胚軸小段置含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、O. 2mg/L 2，4-D和O. lmg/L激動素、pH為5. 8的MS液體培養(yǎng)基中浸泡5(Γ70分鐘，再接入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、1. 75mg/L玉米素和lmg/L吲哚乙酸、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，在每天25±2°C光照16小時、18±2°C黑暗8小時、光照強度為100(Γ20001χ的條件下預(yù)培養(yǎng)I天，制得番茄外植體；
b.農(nóng)桿菌工程菌液的制備將含有番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的農(nóng)桿菌工程菌株接種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5%的瓊脂、50mg/L卡拉霉素、500mg/L鏈霉素和50mg/L利福平、pH為7.0的YEB固體培養(yǎng)基上，在28±2°C、黑暗條件下培養(yǎng)2天，挑取單菌落，用含有50mg/L卡拉霉素、500mg/L鏈霉素和50mg/L利福平、pH為7. O的YEB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，再按照體積比為1:100將所得菌液加入上述YEB液體培養(yǎng)基中，過夜擴大培養(yǎng)至OD_為1. 8-2. 0，6000rpm離心，棄上清，菌體用上述YEB液體培養(yǎng)基洗滌后，用等體積、pH為5. 8的MS鹽溶液重懸，制得農(nóng)桿菌工程菌液； c.農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化將步驟a制得的番茄外植體置步驟b制得的農(nóng)桿菌工程菌液中浸染1(Γ23分鐘后，接入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、1. 75mg/L玉米素和lmg/L吲哚乙酸、pH為5.8的MS固體培養(yǎng)基中，在每天25±2°C光照16小時、18±2°C黑暗8小時、光照強度為100(Γ20001χ的條件下共培養(yǎng)2 3天，再轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、1. 75mg/L玉米素、lmg/L吲哚乙酸、500mg/L羧芐青霉素和75mg/L卡拉霉素、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，在每天25±2°C光照16小時、18±2°C黑暗8小時、光照強度為100(Γ20001χ的條件下培養(yǎng)至長出抗性小苗；當(dāng)抗性小苗長至f 2cm時，將抗性小苗切下，轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、500mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡拉霉素、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，在每天25 ±2 °C光照16小時、18±2°C黑暗8小時、光照強度為100(Γ20001χ的條件下培養(yǎng)至生根，獲得轉(zhuǎn)基因番爺植株；
d.轉(zhuǎn)基因陽性植株的獲得從步驟c獲得的轉(zhuǎn)基因番茄植株中篩選出轉(zhuǎn)基因陽性植株，即獲得高不飽和脂肪酸果實番茄植株。進(jìn)一步，所述步驟a中番爺品系為野生型番爺{Lycopersicon esculentum Mill,cv Ailsa Craig)。進(jìn)一步，所述番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體中含有NPTII報告基因，所述步驟d通過PCR檢測番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體中含有的NPTII報告基因在轉(zhuǎn)基因番茄植株中的表達(dá)來篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株，所述PCR檢測方法是分別取步驟c獲得的轉(zhuǎn)基因番茄植株和非轉(zhuǎn)基因番茄植株，提取基因組DNA，再以所得基因組DNA為模板、NPTI1-f和NPTI1-r為引物進(jìn)行PCR擴增，所述NPTI1-f和NPTII_r的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 10 和 SEQ ID No. 11 所示。本發(fā)明中所述MS鹽溶液為不含有機物成分的MS液體培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果在于
(I)本發(fā)明根據(jù)植物脂肪氧化酶催化具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸分解代謝的特點以及番茄中五個LOX同工酶基因序列的特點，選取TomloxA基因中與TomloxB和TomloxE基因高度保守的序列以及TomloxC和TomloxD基因的部分序列，構(gòu)建了番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將該沉默表達(dá)載體轉(zhuǎn)入野生型番爺{Lycopersicon escuIenturn Mill, cv Ailsa Craig)中，獲得了轉(zhuǎn)基因番爺陽性植株，檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因番爺陽性植株中脂肪氧化酶家族基因TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD和TomloxE的表達(dá)以及脂肪氧化酶的活性都較非轉(zhuǎn)基因番茄植株顯著降低，轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株所結(jié)果實中α-亞麻酸和亞油酸的含量都較非轉(zhuǎn)基因番茄植株明顯增加，說明該沉默表達(dá)載體可用于高不飽和脂肪酸果實番茄植株的育種，在改良番茄果實品質(zhì)、提高番爺果實營養(yǎng)價值方面具有良好的應(yīng)用前景。同時，由于TomloxA、TomloxC和TomloxD基因均為番茄自身基因，將其部分序列轉(zhuǎn)入番茄植株中獲得的轉(zhuǎn)基因植株也不存在影響環(huán)境安全和食用安全的問題。(2)本發(fā)明所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的構(gòu)建方法簡便易行。(3)本發(fā)明建立的番茄轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化效率高，具有以下特點①農(nóng)桿菌工程菌液的濃度影響菌體在植物細(xì)胞上的附著，在一定范圍內(nèi)，菌液濃度越大，附著率越高，轉(zhuǎn)化率越大，但超過該范圍，由于菌的毒害作用或生長過快等，會使外植體受到農(nóng)桿菌過度傷害而導(dǎo)致外植體切口褐化腐爛嚴(yán)重，且不利于共培養(yǎng)后去除農(nóng)桿菌，而低于該范圍，較低的菌 液濃度會使T-DNA不能有效地整合進(jìn)植物細(xì)胞基因組中，大大降低轉(zhuǎn)化效果，本發(fā)明方法對農(nóng)桿菌工程菌液的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，能夠有效保證番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化率；②外植體的浸染時間過短，會導(dǎo)致農(nóng)桿菌不能充分吸附到細(xì)胞上而影響轉(zhuǎn)化，而浸染時間過長，外植體的傷口會褐化，且農(nóng)桿菌污染嚴(yán)重并在后續(xù)實驗中難以控制，本發(fā)明方法對番茄外植體的浸染時間進(jìn)行了優(yōu)化，可以充分保障浸染效果外植體和農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)是影響轉(zhuǎn)化的重要因素，共培養(yǎng)時間過長會使外植體因農(nóng)桿菌污染而死亡，時間過短則會使農(nóng)桿菌感染和DNA轉(zhuǎn)化不充分，從而降低轉(zhuǎn)化率，同時也會增加假轉(zhuǎn)化體的出現(xiàn)，本發(fā)明方法對番茄外植體與農(nóng)桿菌工程菌的共培養(yǎng)時間進(jìn)行了優(yōu)化；④本發(fā)明方法中番茄外植體在轉(zhuǎn)接入抗性選擇培養(yǎng)基前經(jīng)黑暗處理，可在短時間內(nèi)誘導(dǎo)出較高頻率的轉(zhuǎn)化再生芽；⑤激素是影響再生頻率的主要因素之一，不同的激素組合及激素水平對誘導(dǎo)不同外植體愈傷和出芽的影響不同，由于番茄苗對卡那霉素(Kan)很敏感，Kan濃度過低，選擇壓不足，易產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因植株，而Kan濃度過高不利于芽分化，本發(fā)明方法中抗性選擇培養(yǎng)基中Kan的濃度優(yōu)選為75mg/L ;⑥本發(fā)明方法還對誘導(dǎo)生芽、延長不定芽、選擇性生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，25±2°C光照16小時(光照強度為100(T20001x)、18±2°C黑暗8小時為適宜的培養(yǎng)條件，假陽性植株一般會出現(xiàn)不生長或者生長緩慢現(xiàn)象，僅陽性植株正常生長；⑦采用本發(fā)明所述選擇生根培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性生根培養(yǎng)，生根率能夠達(dá)到60%以上。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。圖1為TomloxA、TomloxC和TomloxD基因片段的拼接不意圖。圖2為番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體TomloxA⑶i_pBIN19的構(gòu)建示意圖。圖3為PCR檢測NPTII報告基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，L1、L2和L3分別為轉(zhuǎn)基因陽性植株，NT為非轉(zhuǎn)基因植株。圖4為實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株中番茄脂肪氧化酶家族基因的表達(dá)，其中NT為非轉(zhuǎn)基因植株，L1、L2和L3分別為轉(zhuǎn)基因陽性植株。
具體實施例方式以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實施例中使用的番爺品系為野生型番爺(lycopersicon escu lentum Mill,cv Ailsa Craig)。質(zhì)粒pDHG5. 2 (攜帶CaMV35S啟動子、GFP基因開放讀碼框和CaMV35S終止子)的構(gòu)建方法見文獻(xiàn)(Kim SH, Grierson D. Subcellular localisation and silencingof ripening-associated membrane protein (TRAMP) in tomato Lycopersiconescu lentum Mill. Plant Science, 2005, 169: 1022-1029)，系將 GFP 基因開放讀碼框(SEQ ID No. 24)插入pDH51載體的多克隆位點中而得到。pMD18_T載體為Promega公司產(chǎn)品。載體PBIN19和大腸桿菌DH5a由本實驗室保存。TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O 試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA合成酶等為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)為TIANGEN公司產(chǎn)品。其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。一、番爺TomloxA、TomloxC和TomloxD基因片段的克隆
根據(jù)番爺TomloxA mRNA序列(GenBank登錄號為U09026,設(shè)計如下特異引物,用于PCR擴增TomloxA基因開放讀碼框中第1350位至第1720位核苷酸(SEQ ID No.1)
TomA-f :5’ -GGTACCGCATGCATATG(XT<a^gAACTTTGC-3’ (SEQ ID No. 4)，其中下劃線部分為KpnI酶切位點，黑體部分為SphI酶切位點，斜體部分為XhoI酶切位點；
TomA-r :5’ -CTCGAGGATATG^^TTrCTCCACCAGCATTGATTAGGI’ (SEQ ID No. 5)，下劃線部分為XhoI酶切位點，黑體部分為EcoRV酶切位點，斜體部分為BglII酶切位點。根據(jù)番爺TomloxC mRNA序列(GenBank登錄號為U37839),設(shè)計如下特異引物,用于PCR擴增TomloxC基因開放讀碼框中第455位至第746位核苷酸(SEQ ID No. 2)
TomC-f :5’ -CACCAGATCTGGATCCTAGAAAATGAGCACCACAAG-3’ (SEQ ID No. 6)，下劃線部分為BglII酶切位點，黑體部分為BamHI酶切位點；
TomC-r :5’ -GTCGCTCGAGGTCGACCTAACGACTTCTCCGAGATC-3’ (SEQ ID No. 7)，下劃線部分為XhoI酶切位點，黑體部分為SalI酶切位點。根據(jù)番爺TomloxD mRNA序列(GenBank登錄號為U37840),設(shè)計如下特異引物,用于PCR擴增TomloxD基因開放讀碼框中第1250位至第1543位核苷酸(SEQ ID No. 3)
TomD-f :5’ -AGATCTGATAT(XT<a^gGACAAGCAATAGCAGGAGTG-3’ (SEQ ID No. 8)，下劃線部分為BglII酶切位點，黑體部分為EcoRV酶切位點，斜體部分為XhoI酶切位點；
TomD-r :5’ -GATCCTCTAGATAAGTGTGCCAACATCAGAC-3’ (SEQ ID No. 9)，下劃線部分為BamHI酶切位點，黑體部分為XbaI酶切位點。以野生型番爺escuIenturnMill, cv Ailsa Craig)幼葉總RNA為模板，根據(jù)TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，再以所得 cDNA 第一鏈為模板，分別以 TomA-f 和 TomA-r、TomC-f 和 TomC-r、TomD-f 和 TomD-r為引物,PCR擴增番茄TomloxA、TomloxC和TomloxD基因片段。PCR體系為ddH20 16. 5 μ L、IOXPCR Buffer 2· 5 μ UMgCl2 2· 5 μ L、dNTP (20 μ Μ)1. O μ L、上下游引物各 O. 5 μ L、模板l.OyL.Taq DNA合成酶O. 5 μ L，共25 μ L。PCR循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性2分鐘；然后94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，共35個循環(huán)；最后72°C終延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，采用超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將純化的PCR產(chǎn)物即TomloxA、TomloxC和TomloxD基因片段分別與T載體pMD18_T連接，獲得重組質(zhì)粒 TomloxA-T、TomloxC-T 和 TomloxD-T。二、番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體的構(gòu)建
按照圖1所示將TomloxA、TomloxC和TomloxD基因片段進(jìn)行拼接將重組質(zhì)粒TomloxA-T用BglII和SalI雙酶切，回收純化重組質(zhì)粒TomloxA-T線性片段，另將重組質(zhì)粒TomloxC-T用BamHI和SalI雙酶切，回收純化TomloxC基因片段，再將純化的重組質(zhì)粒TomloxA-T線性片段與TomloxC基因片段在T4 DNA連接酶作用下連接，獲得重組質(zhì)粒TomloxAC-T ;然后，將重組質(zhì)粒TomloxAC-T用SalI單酶切，回收純化重組質(zhì)粒TomloxAC-T 線性片段，另將重組質(zhì)粒TomloxD-T用XhoI和SalI雙酶切，回收純化TomloxD基因片段，再將純化的重組質(zhì)粒TomloxAC-T線性片段與TomloxD基因片段在T4 DNA連接酶作用下連接，獲得重組質(zhì)粒TomloxACD-T。按照圖2所示構(gòu)建番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)雙元載體TomloxACD1-pBIN19 :將重組質(zhì)粒TomloxACD-T用XbaI和SphI雙酶切，回收純化TomloxA⑶拼接基因片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的PDHG5. 2載體連接，獲得重組質(zhì)粒pDHG5. 2-GFP-rTomloxACD-T35S (TomloxACD 拼接基因片段反向插入 pDHG5. 2 載體中GFP基因開放讀碼框與CaMV35S終止子之間)；然后，將重組質(zhì)粒TomloxA⑶-T用KpnI和BamHI雙酶切，回收純化TomloxA⑶拼接基因片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒pDHG5. 2-GFP-rTomloxACD-T35S 連接，獲得重組質(zhì)粒 pDHG5. 2-P35S-fTomloxACD-GFP-rTomloxACD-T35S(TomloxACD拼接基因片段正向插入pDHG5. 2載體中CaMV35S啟動子與GFP基因開放讀碼框之間);再后，將重組質(zhì)粒PDHG5. 2-P35S-fTomloxACD-GFP-rTomloxACD-T35S 用 EcoRI 單酶切，回收純化 P35S- fTomloxACD-GFP-rTomloxACD-T35S 表達(dá)單元，再與經(jīng)同樣單酶切的植物表達(dá)載體PBIN19連接，即得番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體TomloxACD1-pBIN19。三、番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
將番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體TomloXACD1-pBIN19采用液氮冷激法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，再涂布于含有1. 5%(w/w)瓊脂、50mg/L Kan、500mg/L鏈霉素(Sm)和50mg/L利福平(Rif)的YEB固體培養(yǎng)基(pH7. O)上，在28±2°C、黑暗條件下培養(yǎng)2天，挑取單菌落，用含有50mg/L Kan、500mg/L Sm和50mg/L Rif的YEB液體培養(yǎng)基(pH7. O)培養(yǎng)2天，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，陽性重組子即為TomloxA⑶1-pBIN19農(nóng)桿菌工程菌株，-80°C凍存?zhèn)溆?。四、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體轉(zhuǎn)化番茄
將野生型番爺{Lycopersicon escuIenturn Mill, cv Ailsa Craig)種子用 75%(v/v)乙醇溶液消毒2分鐘，無菌水沖洗3次，再用飽和磷酸鈉溶液浸泡8-10分鐘，無菌水沖洗3次，再用1%(ν/ν)次氯酸鈉溶液滅菌20分鐘,無菌水沖洗10次,最后用蒸餾水浸泡5-8小時，播種于含有3%(w/w)蔗糖和O. 6%(w/w)瓊脂的MS培養(yǎng)基(pH5. 8)上，在每天25±2°C光照16小時(光照強度為100(T20001X)、18±2°C黑暗8小時的條件下培養(yǎng)；取培養(yǎng)兩周的無菌幼苗，剪除子葉的兩端部分，并將下胚軸剪成長約Icm的小段，再將子葉和下胚軸小段置含有3%(w/w)蔗糖、O. 2mg/L 2，4-D和O. lmg/L激動素的MS液體培養(yǎng)基(ρΗ5· 8)中浸泡約I小時后，接入含有3%(w/w)蔗糖、O. 8%(w/w)瓊脂、1. 75mg/L玉米素(ZT)和lmg/L吲哚乙酸(IAA)的MS固體培養(yǎng)基(pH5.8)中，在每天25±2°C光照16小時(光照強度為100(T20001x)、18±2°C黑暗8小時的條件下預(yù)培養(yǎng)I天，制得番茄外植體。將TomloxACD1-pBIN19農(nóng)桿菌工程菌株接種于含有1. 5%(w/w)瓊脂、50mg/L Kan、500mg/L Sm和50mg/L Rif的YEB固體培養(yǎng)基(ρΗ7· O)上，在28±2°C、黑暗條件下培養(yǎng)2天，挑取單菌落，用含有50mg/L Kan、500mg/L Sm和50mg/L Rif的YEB液體培養(yǎng)基(ρΗ7· O)培養(yǎng)2天，再按照體積比為1:100將所得菌液加入上述YEB液體培養(yǎng)基中，過夜擴大培養(yǎng)至0D_為1. 8^2. O，6000rpm離心，棄上清，菌體用上述YEB液體培養(yǎng)基洗滌后，用等體積MS鹽溶液(pH5. 8)重懸，制得TomloxACD1-pBIN19農(nóng)桿菌工程菌液。將前述番茄外植體置TomloxA⑶i_pBIN19農(nóng)桿菌工程菌液中浸染15分鐘，用無菌 吸水紙吸去多余菌液后，接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(含有3%(w/w)蔗糖、O. 8%(w/w)瓊脂、1.75mg/L ZT和lmg/L IAA的MS固體培養(yǎng)基，pH5. 8)中，在每天25±2°C光照16小時(光照強度為100(T2000 lx)、18±2°C黑暗8小時的條件下共培養(yǎng)2 3天，再轉(zhuǎn)入抗性選擇培養(yǎng)基(含有 3%(w/w)鹿糖、0.8%(w/w)瓊脂、1.75mg/L ZT>lmg/L IAA、500mg/L 羧節(jié)青霉素和 75mg/LKan的MS固體培養(yǎng)基，pH5. 8)中，在每天25±2°C光照16小時(光照強度為100(Γ20001χ)、18±2°C黑暗8小時的條件下培養(yǎng)至長出抗性小苗；當(dāng)抗性小苗長至f 2cm時，將抗性小苗切下，轉(zhuǎn)入選擇生根培養(yǎng)基(含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)瓊脂、500mg/L羧芐青霉素和50mg/L Kan的MS固體培養(yǎng)基，pH5. 8)中，在每天25±2°C光照16小時(光照強度為100(T20001x)、18±2°C黑暗8小時的條件下培養(yǎng)至生根，獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株。五、轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選
根據(jù)番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體TomloxA⑶1-pBIN19中的NPTII報告基因序列，設(shè)計如下特異引物NPTI1-f :5’-GTCACTGAAGCGGGAAGGG-3’(SEQ ID No. 10)；NPTI1-r :5’-CGGCGATACCGTAAAGCAC-3’ (SEQ ID No. 11)。分別取前述轉(zhuǎn)基因番茄植株和非轉(zhuǎn)基因番茄植株，提取基因組DNA，再以所得基因組DNA為模板、NPTI1-f和NPTII_r為引物進(jìn)行PCR擴增，檢測NPTII報告基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)，以篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株。PCR體系如前所述；PCR循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性30秒，63°C退火30秒，72°C延伸40秒，共35個循環(huán)；最后72°C終延伸10分鐘。結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)基因番茄植株L1、L2和L3的PCR產(chǎn)物都在500 bp左右有特異性電泳條帶，與NPTII報告基因大小一致，而非轉(zhuǎn)基因番茄植株的PCR產(chǎn)物在相應(yīng)位置沒有出現(xiàn)電泳條帶，證實轉(zhuǎn)基因番茄植株L1、L2和L3均為轉(zhuǎn)基因陽性植株。六、轉(zhuǎn)基因陽性植株中脂肪氧化酶家族基因的表達(dá)檢測及脂肪氧化酶的活性分析1、轉(zhuǎn)基因陽性植株中脂肪氧化酶家族基因的表達(dá)檢測
根據(jù)番爺 TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD 和 TomloxE mRNA 序列，設(shè)計如下特異引物
TomA-df :5’- GAGGCGTGGGATAGGA-3’ (SEQ ID No. 12)；
TomA-dr :5’-GGATACGGGTAGTCAGCA-3’ (SEQ ID No. 13)；
權(quán)利要求
1.番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體，其特征在于，含有一個雙鏈RNA表達(dá)單元，所述雙鏈RNA表達(dá)單元包括啟動子、TomloxA⑶拼接基因正向片段、TomloxA⑶拼接基因反向片段和終止子，所述TomloxA⑶拼接基因由TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段拼接而成，所述TomloxA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述TomloxC基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述TomloxD基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體，其特征在于，以PBIN19載體為骨架，雙鏈RNA表達(dá)單元插入pBIN19載體的多克隆位點中，所述雙鏈RNA表達(dá)單元包括CaMV 35S啟動子、TomloxA⑶拼接基因正向片段、GFP基因開放讀碼框、TomloxA⑶拼接基因反向片段和CaMV 35S終止子。
3.權(quán)利要求1或2所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 a.TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段的克隆以野生型番茄幼葉總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，再以所得cDNA第一鏈為模板，分別以TomA-f和TomA~r> TomC-f 和 TomC-r、TomD-f 和 TomD-r 為引物，PCR 擴增 TomloxA 基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段，所述TomA-f和TomA_r的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示，所述TomC-f和TomC-r的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 6和SEQ IDNo. 7所示，所述TomD-f和TomD-r的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示；然后，將所得TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段分別與pMD18_T載體連接，獲得重組質(zhì)粒TomloxA-T、TomloxC-T和TomloxD-T ； b.TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段的拼接將重組質(zhì)粒TomloxA-T用BglII和SalI雙酶切，回收純化重組質(zhì)粒TomloxA-T線性片段，另將重組質(zhì)粒TomloxC-T用BamHI和SalI雙酶切，回收純化TomloxC基因片段，再將純化的重組質(zhì)粒TomloxA-T線性片段與TomloxC基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒TomloxAC-T ;然后，將重組質(zhì)粒TomloxAC-T用SalI單酶切，回收純化重組質(zhì)粒TomloxAC-T線性片段,另將重組質(zhì)粒TomloxD-T用XhoI和SalI雙酶切，回收純化TomloxD基因片段，再將純化的重組質(zhì)粒TomloxAC-T線性片段與TomloxD基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒TomloxACD-T ； c.番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的構(gòu)建將重組質(zhì)粒TomloxA⑶-T用XbaI和SphI雙酶切，回收純化TomloxA⑶拼接基因片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的pDHG5. 2載體連接，獲得重組質(zhì)粒PDHG5. 2-GFP-rTomloxACD-T35S ;然后，將重組質(zhì)粒TomloxACD-T用KpnI和BamHI雙酶切，回收純化TomloxA⑶拼接基因片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒 pDHG5. 2-GFP-rTomloxACD-T35S 連接，獲得重組質(zhì)粒 pDHG5. 2-P35S-fTomloxACD-GFP-rTomloxACD-T35S ;再后，將重組質(zhì)粒 pDHG5. 2-P35S- fTomloxACD-GFP-rTomloxACD_T35S用EcoRI單酶切，回收純化P35S-fTomloxACD-GFP- rTomloxACD_T35S表達(dá)單元，再與經(jīng)同樣單酶切的植物表達(dá)載體PBIN19連接，即得番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體TomloxACD1-pBIN19。
4.含有權(quán)利要求1或2所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的微生物轉(zhuǎn)化體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述微生物為農(nóng)桿菌。
6.權(quán)利要求1或2所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體在高不飽和脂肪酸果實番茄植株育種中的應(yīng)用，所述不飽和脂肪酸為具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述不飽和脂肪酸為α-亞麻酸和亞油酸。
8.利用權(quán)利要求1或2所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體獲得高不飽和脂肪酸果實番茄植株的方法，其特征在于，包括以下步驟 a.番茄外植體的制備將番茄種子用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液消毒，無菌水沖洗，再用飽和磷酸鈉溶液浸泡，無菌水沖洗，最后用體積分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉滅菌，無菌水沖洗，蒸餾水浸泡，播種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 6%的瓊脂、pH為5. 8的MS培養(yǎng)基上，在每天25 ± 2 °C光照16小時、18 ± 2 °C黑暗8小時、光照強度為100(T20001X的條件下培養(yǎng)；取培養(yǎng)兩周的無菌幼苗，剪除子葉的兩端部分，并將下胚軸剪成長O. 8^1. 2cm的小段，再將子葉和下胚軸小段置含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、O. 2mg/L 2，4-D和O. lmg/L激動素、pH為5. 8的MS液體培養(yǎng)基中浸泡5(Γ70分鐘，再接入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、1. 75mg/L玉米素和lmg/L吲哚乙酸、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，在每天25±2°C光照16小時、18±2°C黑暗8小時、光照強度為100(Γ20001χ的條件下預(yù)培養(yǎng)I天，制得番茄外植體； b.農(nóng)桿菌工程菌液的制備將含有番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體的農(nóng)桿菌工程菌株接種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5%的瓊脂、50mg/L卡拉霉素、500mg/L鏈霉素和50mg/L利福平、pH為7.0的YEB固體培養(yǎng)基上，在28±2°C、黑暗條件下培養(yǎng)2天，挑取單菌落，用含有50mg/L卡拉霉素、500mg/L鏈霉素和50mg/L利福平、pH為7. O的YEB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，再按照體積比為1:100將所得菌液加入上述YEB液體培養(yǎng)基中，過夜擴大培養(yǎng)至OD_為1. 8-2. 0，6000rpm離心，棄上清，菌體用上述YEB液體培養(yǎng)基洗滌后，用等體積、pH為5. 8的MS鹽溶液重懸，制得農(nóng)桿菌工程菌液； c.農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化將步驟a制得的番茄外植體置步驟b制得的農(nóng)桿菌工程菌液中浸染15分鐘后，接入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、1. 75mg/L玉米素和lmg/L吲哚乙酸、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，在每天25 ± 2°C光照16小時、18 ± 2°C黑暗8小時、光照強度為100(Γ20001χ的條件下共培養(yǎng)2 3天，再轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、1. 75mg/L玉米素、lmg/L吲哚乙酸、500mg/L羧芐青霉素和75mg/L卡拉霉素、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，在每天25±2°C光照16小時、18±2°C黑暗8小時、光照強度為100(Γ20001χ的條件下培養(yǎng)至長出抗性小苗；當(dāng)抗性小苗長至f2cm時，將抗性小苗切下，轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、500mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡拉霉素、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，在每天25±2°C光照16小時、18±2°C黑暗8小時、光照強度為100(Γ20001χ的條件下培養(yǎng)至生根，獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株; d.轉(zhuǎn)基因陽性植株的獲得從步驟c獲得的轉(zhuǎn)基因番茄植株中篩選出轉(zhuǎn)基因陽性植株，即獲得高不飽和脂肪酸果實番茄植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟a中番茄品系為野生型番茄{Lycopersi con esculenturn Mill, cv Ailsa Craig)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表達(dá)載體中含有NPTII報告基因，所述步驟d是通過PCR檢測NPTII報告基因在轉(zhuǎn)基因番茄植株中的表達(dá)來篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株，所述PCR檢測方法是分別取步驟c獲得的轉(zhuǎn)基因番 茄植株和非轉(zhuǎn)基因番茄植株，提取基因組DNA，再以所得基因組DNA為模板、NPTI1-f和NPTI1-r為引物進(jìn)行PCR擴增，所述NPTI1-f和NPTI1-r的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 10和 SEQ ID No. 11 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種番茄脂肪氧化酶家族沉默表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，該沉默表達(dá)載體含有一個雙鏈RNA表達(dá)單元，包括啟動子、TomloxACD拼接基因正向片段、TomloxACD拼接基因反向片段和終止子，TomloxACD拼接基因由TomloxA基因片段(SEQIDNo.1)、TomloxC基因片段(SEQIDNo.2)和TomloxD基因片段(SEQIDNo.3)拼接而成；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將該沉默表達(dá)載體轉(zhuǎn)入野生型番茄中獲得的轉(zhuǎn)基因陽性植株所結(jié)果實的α-亞麻酸和亞油酸含量均較非轉(zhuǎn)基因植株明顯增加，說明該沉默表達(dá)載體可用于高不飽和脂肪酸果實番茄植株的育種，在改良番茄果實品質(zhì)、提高番茄果實營養(yǎng)價值方面具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/66GK103014060SQ201310008738
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者陳國平, 胡廷章, 曾華, 胡宗利, 屈霄霄, 涂昀 申請人:重慶大學(xué)