專利名稱：草莓潛隱環(huán)斑病毒的rt-lamp檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及草莓潛隱環(huán)斑病毒的檢測技術(shù)，具體涉及草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法。
背景技術(shù)：
草莓潛隱環(huán)斑病毒virus,SLRSV)隸屬于紅豆花葉病毒科線蟲傳多面體病毒屬[1]，是薔薇科果實(shí)類作物上的重要病害之一，也是國家質(zhì)檢總局發(fā)布的重要檢疫性有害生物。SLRSV能侵染種子、種球、塊莖和苗木等，病毒侵染植株后，主要表現(xiàn)為葉片褪綠、畸形、植株矮化、產(chǎn)量下降以及品質(zhì)下降等現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可引起毀滅性災(zāi)害。目前SLRSV的檢測方法主要有指示植物小葉嫁接法、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測等。SLRSV的癥狀表現(xiàn)比較復(fù)雜，同種病毒在不同的指示植物上，癥狀變化比較大，而上述方法對于病毒種類的鑒定檢測耗時(shí)長，靈敏度較低。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)作為一種新穎的核酸擴(kuò)增方法，同樣具有檢測速度快、操作簡單和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)；該技術(shù)依賴于能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴(kuò)增的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速和特異地?cái)U(kuò)增靶序列。由于LAMP呈瀑布式擴(kuò)增，因此其擴(kuò)增效率非常高；同時(shí)，LAMP識(shí)別靶序列上的6 8個(gè)特異性位點(diǎn)，其特異性也很強(qiáng)；LAMP只在60°C 65°C進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，只要水浴鍋即可，無需特殊的儀器，操作非常簡單；而且LAMP的整個(gè)檢測反應(yīng)只需I h 2.5 h，檢測周期非常短。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測速度快、操作簡單、檢測結(jié)果判斷容易和靈敏度高的草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，其步驟如下:
a、總RNA提取:檢測樣品經(jīng)液氮處理后研碎成粉末狀，用Trizol核酸提取試劑提取總RNA，得到樣品總RNA ;具體提取方法依Trizol核酸提取試劑的說明書進(jìn)行；
b、RT-LAMP擴(kuò)增:20μ L的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為2 X反應(yīng)緩沖液10 μ L，濃度5 U/μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，濃度5 U/μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，樣品總RNAl μ L，引物F3、Β3、LoopU Loop2、FIP和BIP，余量為ddH20，該擴(kuò)增反應(yīng)體系中，引物F3和B3的終濃度各為0.2μΜ，引物L(fēng)oopl和Loop2的終濃度各為0.8 μ M，引物FIP和BIP的終濃度各為1.6 μ Μ,其中引物F3的核苷酸序列為gagaatcacc gttactggaa agg,引物B3的核苷酸序列為acagcaaaca gagaaccact acc,引物L(fēng)oopl的核苷酸序列為gcaaagcccatttccacagt,引物L(fēng)oop2的核苷酸序列為ggttgctacg tgccaaggtt,引物FIP的核苷酸序列為 cgataggcat cgctctccct ttttagaggt gatctttaac ctccc,引物 BIP 的核苷酸序列為tactttggtt cgacagtggt ggattttccc attagataac caccataacc a,反應(yīng)條件為 60 65°C 的恒溫水浴鍋中擴(kuò)增I 1.5 h，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
C、在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入0.1 μ L的熒光染料SYBR green I，若呈綠色則樣品中感染有草莓潛隱環(huán)斑病毒，若呈橙紅色則樣品中無草莓潛隱環(huán)斑病毒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，通過樣品RNA提取，RT-LAMP擴(kuò)增，就可以得到檢測結(jié)果，整個(gè)檢測反應(yīng)不超過2.5 h，又由于LAMP呈瀑布式擴(kuò)增，因此其擴(kuò)增效率非常高，靈敏度是RT-PCR檢測的100倍，且無需復(fù)雜的檢測儀器和檢測過程，操作簡單，可現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測，因此本發(fā)明是一種檢測速度快、操作簡單、檢測結(jié)果判斷容易和靈敏度高的草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例1
1、根據(jù)GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中已登錄的草莓潛隱環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因序列(AY860979)，采用Blast程序進(jìn)行同源性比較，在序列的保守區(qū)，使用Primer Express 3.0 軟件,設(shè)計(jì)得到 F3、B3、FIP、BIP、Loopl 和 Loop2 共 6 條引物，分別識(shí)別外殼蛋白編碼基因的8個(gè)位點(diǎn)；引物F3、B3、FIP、BIP、Loopl和Loop2由上海英駿生物技術(shù)公司合成，引物F3的核苷酸序列為gagaatcacc gttactggaa agg,引物B3的核苷酸序列Sacagcaaaca gagaaccact acc,引物 Loopl 的核昔酸序列為 gcaaagccca tttccacagt,引物L(fēng)oop2的核苷酸序列為ggttgctacg tgccaaggtt,引物FIP的核苷酸序列為cgataggcatcgctctccct ttttagaggt gatctttaac ctccc,引物 BIP 的核苷酸序列為 tactttggttcgacagtggt ggattttccc attagataac caccataacc a ；
2、RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系建立:2X反應(yīng)緩沖液10 μ L，濃度5 U/ μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，濃度5 U/ μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，樣品總RNAl μ L，引物F3和Β3終濃度各為0.2 μ Μ，引物L(fēng)oopl和Loop2終濃度各為0.8 μ M，引物FIP和BIP終濃度各為1.6 μ Μ，ddH20補(bǔ)充至20 μ L ; Bst DNA聚合酶和AMV RNA聚合酶均購于北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司；
3、反應(yīng)條件優(yōu)化:用上述RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系對草莓潛隱環(huán)斑病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品(購于美國Agdia公司)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)定為:30min、60min和90min,結(jié)果30 min未看到沉淀，60min和90min都可以看到沉淀,擴(kuò)增產(chǎn)物加0.1 μ L的突光染料SYBR greenI (購自上海生物工程公司)，都呈綠色，因此選取60 90 min的反應(yīng)時(shí)間；擴(kuò)增反應(yīng)水浴溫度分別設(shè)定為60°C、63°C和65°C，結(jié)果都可以看到沉淀，擴(kuò)增反應(yīng)溫度優(yōu)選較低的60°C ；
4、RT-LAMP特異性試驗(yàn):用上述RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系分別對草莓潛隱環(huán)斑病毒二個(gè)樣品、煙草環(huán)斑病毒一個(gè)樣品(TbAacco ringspotTRSV)、香石竹環(huán)斑病毒一個(gè)樣品(.Carnation ringspot virus, CRSV)、黃瓜綠斑駁病毒一個(gè)樣品green mottlemosaic virus，CGMMV)、南芥菜花葉病毒一個(gè)樣品 ClraAi1S mosaic Firw1S, ArMV)和馬鈴薯V病毒一個(gè)樣品OdWo virus K, PVV)進(jìn)行擴(kuò)增,上述樣品均購于美國Agdia公司，反應(yīng)時(shí)間60 min,水浴溫度為60°C，結(jié)果草莓潛隱環(huán)斑病毒二個(gè)樣品都可以看到沉淀，擴(kuò)增產(chǎn)物加0.1 μ L的熒光染料SYBR green I，都呈綠色，其它樣品無沉淀，SYBR green I染色后為橙紅色，說明RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系對草莓潛隱環(huán)斑病毒特異。
實(shí)施例2
1、2克草莓潛隱環(huán)斑病毒陽性百合葉樣品(樣品由上海檢驗(yàn)檢疫局提供)經(jīng)約50毫升液氮處理后研碎成粉末狀，用Trizol核酸提取試劑(購自上海生物工程公司)提取總RNA，得到樣品總RNA ;具體提取方法依Trizol核酸提取試劑的說明書進(jìn)行；
2,RT-LAMP靈敏性試驗(yàn):用RT-PCR反應(yīng)體系和上述RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系分別對樣品總RNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，RT-PCR反應(yīng)體系引物為F3和B3，試劑盒為One-st印RNA PCR kit(購自大連TaKaRa公司)，PCR反應(yīng)條件如下:50°C cDNA合成30 min，94°C預(yù)變性2 min ；94°C變性30 s，58°C復(fù)性30 s，72°C延伸I min，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5 min。樣品總RNA濃度分別為原液，原液的10 — \ 10 —2、10 —3、10 —4和10 —5稀釋液，RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間60 min,水浴溫度為60°C，結(jié)果原液及原液的10 —1和10 —3稀釋液看到沉淀，擴(kuò)增產(chǎn)物加0.1 μ L的熒光染料SYBR green I，原液及原液的10 一 1UO +2、10 —3、10 —4稀釋液都呈綠色；RT-PCR只有原液和10 — 1稀釋液有熒光反應(yīng)，因此RT-LAMP擴(kuò)增靈敏度是RT-PCR的100倍以上，也說明百合葉中感染有草莓潛隱環(huán)斑病毒。實(shí)施例3
上述RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系分別對薔薇、玫瑰、和水仙葉樣品進(jìn)行檢測。檢測方法同實(shí)施例2，只是水浴溫度為65°C，結(jié)果薔薇葉擴(kuò)增產(chǎn)物有沉淀，0.1 μ L的熒光染料SYBR greenI后呈綠色，玫瑰葉擴(kuò)增產(chǎn)物混濁，0.1 μ L的熒光染料SYBR green I后呈綠色，水仙擴(kuò)增產(chǎn)物無沉淀，0.1 μ L的熒光染料SYBR green I后呈橙紅色，說明薔薇、玫瑰葉中感染有草莓潛隱環(huán)斑病毒，水仙葉中未感染 草莓潛隱環(huán)斑病毒。
權(quán)利要求
1.莓潛隱環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，其特征在于步驟如下: a、總RNA提取:檢測樣品經(jīng)液氮處理后研碎成粉末狀，用Trizol核酸提取試劑提取總RNA，得到樣品總RNA ;具體提取方法依Trizol核酸提取試劑的說明書進(jìn)行； b、RT-LAMP擴(kuò)增:20μ L RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為2 X反應(yīng)緩沖液10 μ L，濃度5 U/ μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，濃度5 U/μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，樣品總RNAl μ L，引物F3、Β3、LoopU Loop2、FIP和BIP，余量為ddH20，該擴(kuò)增反應(yīng)體系中，引物F3和B3的終濃度各為0.2 μ M，引物L(fēng)oopl和Loop2的終濃度各為0.8 μ M，引物FIP和BIP的終濃度各為1.6 μ Μ,其中引物F3的核苷酸序列為gagaatcacc gttactggaa agg,引物B3的核苷酸序列Sacagcaaaca gagaaccact acc,引物 Loopl 的核昔酸序列為 gcaaagccca tttccacagt,引物L(fēng)oop2的核苷酸序列為ggttgctacg tgccaaggtt,引物FIP的核苷酸序列為cgataggcatcgctctccct ttttagaggt gatctttaac ctccc,引物 BIP 的核苷酸序列為 tactttggttcgacagtggt ggattttccc attagataac caccataacc a,反應(yīng)條件為 60 65°C 的恒溫水浴鍋中擴(kuò)增I 1.5 h，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； C、在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入0.1 μ L的熒光染料SYBR green I，若呈綠色則樣品中感染有草莓潛隱環(huán)斑病毒，若呈橙紅色則樣品中無草莓潛隱環(huán)斑病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，通過樣品RNA提取，RT-LAMP擴(kuò)增，就可以得到檢測結(jié)果，整個(gè)檢測反應(yīng)不超過2.5h，又由于LAMP呈瀑布式擴(kuò)增，因此其擴(kuò)增效率非常高，靈敏度是RT-PCR檢測的100倍，且無需復(fù)雜的檢測儀器和檢測過程，操作簡單，可現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測，因此本發(fā)明是一種檢測速度快、操作簡單、檢測結(jié)果判斷容易和靈敏度高的草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103088160SQ201310011970
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者張吉紅, 陳先鋒, 余澍瓊, 聞偉剛 申請人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院