專利名稱：一種豬流行性腹瀉病毒s基因抗原表位的擴增方法
技術領域：
本發(fā)明涉及豬流行性腹瀉病毒技術領域，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法。
背景技術：
豬流行性腹灣(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹灣病毒引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，各種年齡的豬均易感。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的S基因全長4150bp，由其編碼的S蛋白位于病毒粒子表面。PEDV的S基因存在中和抗原表位，在S基因的1495bp-1914bp(420bp)之間。劉鄧等人在《豬流行性腹瀉病毒CH/ZJ分離株S基因的克隆、原核表達和疫苗原性分析》(黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，.2:9-12)中從豬流行性腹瀉病毒CH/ZJ分離株中擴增出長966bp (61bp-1026bp)的S部分基因，但是該序列不包含位于S基因1495bp_1914bp之間的中和抗原表位。姜艷平等人在《豬流行性腹瀉病毒S基因片段的原核表達及其表達產(chǎn)物的反應原性》(中國獸醫(yī)科學，2009, 39(07):602-607)從豬流行性腹瀉病毒地方流行株LJB/03中擴增出了長420bp的PEDV中和抗原表位。但是這兩種擴增方法均未說明是否能擴增出不同培養(yǎng)代次包括高代次的PEDV的S基因。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的S部分基因，擴增片段長782bp (位于S基因的1316bp-2097bp)，并且包含位于S基因1495bp_1914bp之間的中和抗原表位，實現(xiàn)能擴增在veix)細胞上培養(yǎng)的不同代次的PEDV種毒的S基因，以捕捉到豬流行性腹瀉病毒在細胞培養(yǎng)傳代過程中S基因，特別是中和抗原表位的序列變化，從而了解其與PEDV免疫效力變化的相關性。為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下:
一種豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，其包括以下步驟:
1)提取病毒RNA:原病料經(jīng)12000rpm離心5分鐘后取上清液或者細胞培養(yǎng)液_20°C反復凍融 2-3 次,然后米用 TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0 提取病毒RNA ；
2)RT-PCR擴增:設計引物SEQ ID NO:1 和引物 SEQ ID NO: 2，采用 TaKaRa PrimeScriptone step RT-PCR Kit Ver.2 進行擴增；
3)套式PCR擴增:設計引物SEQID N0:3和引物SEQ ID NO:4，對步驟2中的RT-PCR擴增產(chǎn)物米用 TaKaRa Premix Taq Version 2.0 擴增；
4) PCR產(chǎn)物的克隆及測序分析:采用B10MIGA Ge I/PCR Extraction Kit進行PCR產(chǎn)物的純化；將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD20-T Vector載體上；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞；篩選陽性克隆并進行測序。步驟I)米用 TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0 提取病毒RNA順次按以下步驟進行:
①取200μ1病料處理液或凍融的細胞培養(yǎng)液放入1.5ml離心管中，加入200μ1的Solution A,劇烈振蕩混勻后,室溫放置5分鐘；
②加入75μ1的SolutionB,混合均勻后,12000rpm離心5分鐘；
③將上清液轉(zhuǎn)移到新的CollectionTube中，加250μ1異丙醇,上下顛倒混勻；
④將試劑盒中的Spincolumn安置于另一新的Collection Tube上,將③中的上清液轉(zhuǎn)移至Spin column中，12000rpm離心I分鐘,棄濾液；
⑤將500μ1的RinseA加入至Spin column中，室溫靜置I分鐘，12000rpm離心I分鐘，棄濾液；
⑥將800M-1的RinseB加入至Spin column中，12000rpm離心I分鐘，棄濾液；
⑦再次進行12000rpm離心I分鐘；
⑧將Spincolum n安置于新的1.5ml離心管上,在Spin column膜的中央處加入50μ1的滅菌蒸餾水或者Elution Buffer,室溫靜置I分鐘；
⑨12000rpm離心I分鐘洗脫病毒RNA，提取的病毒RNA立即用于后續(xù)試驗或_20°C保存。步驟2)中RT-PCR反應體系為
PrimeScript one step enzyme MixIM-1
2X1 step buffer12.5M-1
SEQ ID NO:1 (10μΜ)2μ1
SEQ ID NO:2 (10μΜ)2μ1
RNA樣品3μ1
RNase Free dH204.5M-1 ；
反應程序為94°C預變性2min ;94°C變性30s，53_54°C退火30s，72°C延伸lmin，設置30個循環(huán)；72°C延伸7min ;16°C保存。步驟3)中套式PCR擴增反應體系為 Premix Taq12.5M-1 RT-PCR 產(chǎn)物 1.5μ1 SEQ ID NO:3 (10μΜ) 2μ1 SEQ ID NO:4 (10μΜ) 2μ1 滅菌蒸餾水 7μ1 ；
反應程序為94°C預變性2min ;98°C變性10s，52_55°C退火30s，72°C延伸50s，設置30個循環(huán)；72°C延伸7min ;16°C保存。步驟4)中，所述PCR產(chǎn)物的純化具體步驟如下:
①取100-200μ1的PCR產(chǎn)物，加入2倍體積的Buffer GC,混合均勻，瞬時離心，將溶液收集到底部；
②將以上混合液加入帶有收集管的吸附柱中，室溫下，13000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回到收集管中；重復步驟②，直至剩余的混合液全部通過吸附柱；
③加入650PLDNA Wash Buffer至吸附柱下，室溫下，13000rpm離心30秒，棄去流出液；重復步驟③；
④室溫下，13000rpm，將吸附柱開蓋離心2分鐘，去除殘留的乙醇；
⑤轉(zhuǎn)移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30_50μ1 60°C預熱的Elution Buffer或滅菌蒸餾水到吸附柱膜中央，室溫放置I分鐘，13000rpm離心I分鐘，洗脫DNA，將洗脫液加回到吸附柱中重新洗脫一次，洗脫的DNA立即用于后續(xù)試驗或_20°C保存。步驟4)中，將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD20-T Vector載體上具體步驟如下:
①在1.5ml離心管中配制下列溶液，全量為5μ1 ；
pMD20_T Vector μ
PCR純化產(chǎn)物2μ1
蒸餾水2μ1
②加入5μ1 的 Solution I ；
③16°C反應30分鐘；
④洗脫的DNA與pMD20-TVector的連接產(chǎn)物_20°C保存。步驟4)中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞順次按以下步驟進行:
①取3μ1連接產(chǎn)物放入100μ1DH5 α感受態(tài)細胞懸液中，輕輕混勻；
②冰上放置20-30分鐘，然后42°C水浴熱激90秒，迅速冰上冷卻2分鐘；
③立即加入0.8mlLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37°C 150_180rpm振蕩培養(yǎng)45-60分鐘；
④取培養(yǎng)液200μ1接種于含有100μ8//πι1氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上，用玻璃涂棒涂勻；
⑤倒置培養(yǎng)皿，于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14-16小時。步驟4)中，篩選陽性克隆并進行測序順次按以下步驟進行:
①挑取培養(yǎng)皿上的單個菌落，每個單菌落接種于2ml含lOOPg/Vml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C 180-200rpm振蕩培養(yǎng)14-16小時；
②采用引物SEQ ID N0:3 和引物 SEQ ID NO:4,用 TaKaRa Premix Taq Version 2.0PCR鑒定陽性克隆，
反應體系為:
Premix Taq12.5μ1
菌液4μ1 SEQ ID NO:3 (10μΜ)2μ1
SEQ ID NO:4 (10μΜ)2μ1
滅菌蒸餾水4.5μ1 ；
反應程序為:94°C預變性5min ;98°C變性10s，52_55°C退火30s、72°C延伸50s，設置30個循環(huán)；72°C延伸7min ;16°C保存；
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)782bp大小的條帶的為陽性克隆菌液，對陽性菌進行序列測定。
相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于:
1.本發(fā)明能擴增PEDV不同培養(yǎng)代次，包括原病料、在VeiO細胞上培養(yǎng)的F15代、F30代、F60代甚至更多代次的S基因；
2.本發(fā)明所擴增的片段長782bp，包含位于PEDVS基因1495bp_1914bp之間的抗原表
位；
3.通過該方法可以捕捉到豬流行性腹瀉病毒在細胞培養(yǎng)傳代過程中S基因，特別是中和抗原表位的序列變化，從而達到了了解其與PEDV免疫效力變化的相關性的目的。下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明。


圖1為本發(fā)明的原病料病毒RNA和病毒RNA在vero細胞上培養(yǎng)的第15代、第30代、第60代毒的RNA分別用外圍引物擴增后的產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 M:DL2000 ；1:原病料RNA RT-PCR產(chǎn)物，目的片段為920bp ；2~4:分別為病毒在vero細胞上培養(yǎng)第15代、第30代、第60代毒的RNA RT- PCR結果；5:原病料套式PCR產(chǎn)物，目的片段為782bp ；6-8:分別為病毒在vero細胞上培養(yǎng)第15代、第30代、第60代毒的套式PCR產(chǎn)物，片段為782bp。
具體實施方式
實施例1
一種豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，其包括以下步驟:
O提取病毒RNA:豬的水樣糞便經(jīng)12000rpm離心5分鐘后取上清液或者細胞培養(yǎng)液-2CTC 反復凍融 2-3 次,然后米用 Ta Ka Ra mini BEST viral RNA/DNA extraction kitVer.4.0 (DV819A)提取病毒 RNA ；
米用 TaKaRa mini BEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0 (DV819A)提取病毒RNA順次按以下步驟進行:
①取200μ1病料處理液或凍融的細胞培養(yǎng)液放入1.5ml離心管中，加入200μ1的Solution A,劇烈振蕩混勻后,室溫放置5分鐘；
②加入75μ1的SolutionB,混合均勻后,12000rpm離心5分鐘；
③將上清液轉(zhuǎn)移到新的CollectionTube (2ml，試劑盒中提供)中，加250μ1異丙醇(含有1%冰乙酸)，上下顛倒混勻；
④將試劑盒中的Spincolumn安置于另一新的Collection Tube (2ml,試劑盒中提供)上，將③中的上清液轉(zhuǎn)移至Spin column中，12000rpm離心I分鐘,棄濾液；
⑤將500μ1的RinseA加入至Spin column中，室溫靜置I分鐘，12000rpm離心I分鐘，棄濾液；
⑥將800M-1的RinseB加入至Spin column中,12000rpm離心I分鐘,棄濾液；
⑦再次進行12000rpm離心I分鐘；
⑧將Spincolumn安置于新的1.5ml離心管上,在Spin column膜的中央處加入50μ1的滅菌蒸餾水或者Elution Buffer,室溫靜置I分鐘；
⑨12000rpm離心I分鐘洗脫病毒RNA。提取的病毒RNA立即用于后續(xù)試驗或_20°C保存。2) RT-PCR 擴增:設計引物 SEQ ID NO:1 (Pl:5-ATGGCACTGACGATGACG-3)和引物SEQ ID NO: 2(P2:5-AAGAAACCAGGCAACTCC-3)，采用 TaKaRa PrimeScript one step RT-PCRKit Ver.2 (DRR055A)進行擴增；
RT-PCR反應體系為
PrimeScript one step enzyme MixIM-1
2X1 step buffer12.5M-1
SEQ ID NO:1 (ΙΟμΜ)2μ1
SEQ ID NO:2 (ΙΟμΜ)2μ1
RNA樣品3μ1
RNase Free dH204.5M-1 ；
反應程序為94°C預變性2min ;94°C變性30s，53_54°C退火30s，72°C延伸lmin，設置30個循環(huán)；72°C延伸7min ;16°C保存。3)套式 PCR 擴增:設計引物 SEQ ID NO: 3 (P3:5_GGACCGTAGCA TCGACTA-3)和引物 SEQ ID NO:4 (P4:5-TGGCGTAACAGAATAAACAG-3),對步驟 2 中的 RT-PCR 擴增產(chǎn)物采用TaKaRa Premix Taq Version 2.0 (D334S)擴增；
PCR擴增反應體系為
Premix Taq12.5M-1
RT-PCR 產(chǎn)物1.5μ1
SEQ ID NO:3 (ΙΟμΜ)2μ1
SEQ ID NO:4 (ΙΟμΜ)2μ1
滅菌蒸餾水7μ1 ；
反應程序為94°C預變性2min ;98°C變性10s，52_55°C退火30s，72°C延伸50s，設置30個循環(huán)；72°C延伸7min ;16°C保存。4) PCR產(chǎn)物的克隆及測序分析
采用B10MIGA Ge I/PCR Extraction Kit進行PCR產(chǎn)物的純化，具體步驟如下:
①取100-200μ1的PCR產(chǎn)物，加入2倍體積的BufferGC,混合均勻，瞬時離心，將溶液收集到底部；
②將以上混合液(每次不超過700μ1)加入帶有收集管的吸附柱中，室溫下，13000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回到收集管中；重復步驟②，直至剩余的混合液全部通過吸附柱；
③加入650PLDNA Wash Buffer至吸附柱下，室溫下，13000rpm離心30秒，棄去流出液；重復步驟③；
④室溫下，13000rpm，將吸附柱開蓋離心2分鐘，去除殘留的乙醇；
⑤轉(zhuǎn)移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30_50μ1 60°C預熱的Elution Buffer或滅菌蒸餾水到吸附柱膜中央，室溫放置I分鐘，13000rpm離心1分鐘，洗脫DNA，將洗脫液加回到吸附柱中重新洗脫一次，洗脫的DNA立即用于后續(xù)試驗或_20°C保存；將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD20-T Vector載體上，具體步驟如下:
①在1.5ml離心管中配制下列溶液，全量為5μ1 ；
pMD20_T VectorIM-1
PCR純化產(chǎn)物2μ1
蒸餾水2μ1
②加入5μ1 的 Solution I ；
③16°C反應30分鐘；
④洗脫的DNA與pMD20-TVector的連接產(chǎn)物_20°C保存；
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細胞；篩選陽性克隆并進行測序，具體步驟如下:
①取3μ1連接產(chǎn)物放入ΙΟΟμΙDH5 α感受態(tài)細胞懸液中，輕輕混勻；
②冰上放置20-30分鐘，然后42°C水浴熱激90秒，迅速冰上冷卻2分鐘；
③立即加入0.8mlLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37°C 150_180rpm振蕩培養(yǎng)45-60分鐘；
④取培養(yǎng)液200μ1接種于含有100μ8//πι1氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上，用玻璃涂棒涂勻；
⑤倒置培養(yǎng)皿，于37°C恒 溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14-16小時。篩選陽性克隆并進行測序順次按以下步驟進行:
①挑取培養(yǎng)皿上的單個菌落(4-6個)，每個單菌落接種于2ml含10(^g//ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C 180-200rpm振蕩培養(yǎng)14-16小時；
②采用引物SEQ ID NO:3 (P3:5-GGACCGTAGCATCGACTA-3)和引物 SEQ ID NO:4 (P4:5-TGGCGTAACAGAATAAACAG-3)，用 TaKaRa Premix Taq Version 2.0 (D334S) PCR 鑒定陽性克隆，
反應體系為:
Premix Taq12.5μ1
菌液4μ1
SEQ ID NO:3 (ΙΟμΜ)2μ1
SEQ ID NO:4 (ΙΟμΜ)2μ1
滅菌蒸餾水4.5μ1 ；
反應程序為:94°C預變性5min ;98°C變性10s，52_55°C退火30s、72°C延伸50s，設置30個循環(huán)；72°C延伸7min ;16°C保存；
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)782bp大小的條帶的為陽性克隆菌液，對陽性菌進行序列測定，測定序列為SEQ ID N0:5。實施例2
將實施例1中提取病毒RNA在veix)細胞上培養(yǎng)的第15代，按照與實施例1相同的步驟擴增出782bp的目的片段(包含S基因1495bp-1914bp之間的中和抗原表位序列)，測定序列為 SEQ ID NO:6。 實施例3
將實施例1中提取病毒RNA在veix)細胞上培養(yǎng)的第30代，按照與實施例1相同的步驟擴增出782bp的目的片段(包含S基因1495bp-1914bp之間的中和抗原表位序列)，測定序列為 SEQ ID NO:7。
實施例4
將實施例1中提取病毒RNA在veix)細胞上培養(yǎng)的第60代，按照與實施例1相同的步驟擴增出782bp的目的片段(包含S基因1495bp-1914bp之間的中和抗原表位序列)，測定序列為 SEQ ID NO:8。圖1的電泳結果說明本發(fā)明的豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法能擴增出豬流行性腹瀉病毒在VeiO細胞上培養(yǎng)的F15、F30、F60代毒的S部分基因。上述實施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護的范圍，本領域的技術人員在本發(fā)明的基礎上所做的任何非實質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求 保護的范圍。
權利要求
1.一種豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，其特征在于其包括以下步驟: 1)提取病毒RNA:原病料經(jīng)12000rpm離心5分鐘后取上清液或者細胞培養(yǎng)液-20°C 反復凍融 2-3 次，然后米用 TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kitVer.4.0 (DV819A)提取病毒 RNA ； 2)RT-PCR擴增:設計引物SEQ ID NO:1 和引物 SEQ ID NO: 2，采用 TaKaRa PrimeScriptone step RT-PCR Kit Ver.2 進行擴增； 3)套式PCR擴增:設計引物SEQID N0:3和引物SEQ ID NO:4，對步驟2中的RT-PCR擴增產(chǎn)物采用 TaKaRa Premix Taq Version 2.0 (D334S)擴增； 4)PCR產(chǎn)物的克隆及測序分析:采用B10MIGA Ge I/PCR Extraction Kit進行PCR產(chǎn)物的純化；將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD20-T Vector載體上；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞；篩選陽性克隆并進行測序。
2.根據(jù)權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，其特征在于步驟 I)米用 TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0 提取病毒 RNA 順次按以下步驟進行: ①取200μ1病料處理液或凍融的細胞培養(yǎng)液放入1.5ml離心管中，加入200μ1的Solution A,劇烈振蕩混勻后,室溫放置5分鐘； ②加入75μ1的SolutionB,混合均勻后,12000rpm離心5分鐘； ③將上清液轉(zhuǎn)移到新的CollectionTube中，加250μ1異丙醇,上下顛倒混勻； ④將試劑盒中的Spincolumn安置于另一新的Collection Tube上,將③中的上清液轉(zhuǎn)移至Spin column中,12000rpm離心I分鐘，棄濾液； ⑤將500μ1的RinseA加入至Spin column中，室溫靜置I分鐘，12000rpm離心I分鐘，棄濾液； ⑥將800M-1的RinseB加入至Spin column中,12000rpm離心I分鐘,棄濾液； ⑦再次進行12000rpm離心I分鐘； ⑧將Spincolumn安置于新的1.5ml離心管上,在Spin column膜的中央處加入50μ1的滅菌蒸餾水或者Elution Buffer,室溫靜置I分鐘； ⑨12000rpm離心I分鐘洗脫病毒RNA，提取的病毒RNA立即用于后續(xù)試驗或_20°C保存。
3.根據(jù)權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，其特征在于:步驟2)中RT-PCR反應體系為 PrimeScript one step enzyme MixIM-1 2X1 step buffer12.5M-1 SEQ ID NO:1 (ΙΟμΜ)2μ1 SEQ ID NO:2 (ΙΟμΜ)2μ1RNA樣品3μ1 RNase Free dH204.5M-1 ； 反應程序為94°C預變性2min ;94°C變性30s，53_54°C退火30s，72°C延伸lmin，設置30個循環(huán)；72°C延伸7min ;16°C保存。
4.根據(jù)權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，其特征在于:步驟3)中套式PCR擴增反應體系為 Premix Taq12.5M-1 RT-PCR 產(chǎn)物1.5μ1 SEQ ID NO:3 (ΙΟμΜ)2μ1 SEQ ID NO:4 (ΙΟμΜ)2μ1 滅菌蒸餾水7μ1 ； 反應程序為94°C預變性2min ;98°C變性10s，52_55°C退火30s，72°C延伸50s，設置30個循環(huán)；72°C延伸7min ;16°C保存。
5.根據(jù)權利要求1-4任一項所述的豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，其特征在于步驟4)中，所述PCR產(chǎn) 物的純化具體步驟如下: ①取100-200μ1的PCR產(chǎn)物，加入2倍體積的BufferGC,混合均勻，瞬時離心，將溶液收集到底部； ②將以上混合液加入帶有收集管的吸附柱中，室溫下，13000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回到收集管中；重復步驟②，直至剩余的混合液全部通過吸附柱； ③加入650PLDNA Wash Buffer至吸附柱下，室溫下，13000rpm離心30秒，棄去流出液；重復步驟③； ④室溫下，13000rpm，將吸附柱開蓋離心2分鐘，去除殘留的乙醇； ⑤轉(zhuǎn)移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30_50μ1 60°C預熱的Elution Buffer或滅菌蒸餾水到吸附柱膜中央，室溫放置I分鐘，13000rpm離心I分鐘，洗脫DNA，將洗脫液加回到吸附柱中重新洗脫一次，洗脫的DNA立即用于后續(xù)試驗或_20°C保存。
6.根據(jù)權利要求5所述的豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，其特征在于步驟4)中，將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD20-T Vector載體上具體步驟如下: ①在1.5ml離心管中配制下列溶液，全量為5μ1 ； pMD20_T Vector μ PCR純化產(chǎn)物2μ1 蒸餾水2μ1 ②加入5μ1 的 Solution I ； ③16°C反應30分鐘； ④洗脫的DNA與pMD20-TVector的連接產(chǎn)物_20°C保存。
7.根據(jù)權利要求6所述的豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，其特征在于步驟4)中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞順次按以下步驟進行: ①取3μ1連接產(chǎn)物放入100μ1DH5 α感受態(tài)細胞懸液中，輕輕混勻； ②冰上放置20-30分鐘，然后42°C水浴熱激90秒，迅速冰上冷卻2分鐘； ③立即加入0.8mlLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37°C 150-180rpm振蕩培養(yǎng)45-60分鐘； ④取培養(yǎng)液200μ1接種于含有l(wèi)OOPg/Ail氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上，用玻璃涂棒涂勻； ⑤倒置培養(yǎng)皿，于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14-16小時。
8.根據(jù)權利要求7所述的豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，其特征在于步驟4)中，篩選陽性克隆并進行測序順次按以下步驟進行:①挑取培養(yǎng)皿上的單個菌落，每個單菌落接種于2ml含lOOPg/Vml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C 180-200rpm振蕩培養(yǎng)14-16小時； ②采用引物SEQ ID N0:3 和引物 SEQ ID N0:4，用 TaKaRa Premix Taq Version 2.0PCR鑒定陽性克隆， 反應體系為: Premix Taq12.5M-1菌液4μ1 SEQ ID NO:3 (ΙΟμΜ)2μ1 SEQ ID NO:4 (ΙΟμΜ)2μ1 滅菌蒸餾水4.5μ1 ； 反應程序為:94°C預變性5min ;98°C變性10s，52_55°C退火30s、72°C延伸50s，設置30個循環(huán)；72°C延伸7min ;16°C保存； PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝 膠電泳后，出現(xiàn)782bp大小的條帶的為陽性克隆菌液，對陽性菌進行序列測定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬流行性腹瀉病毒S基因抗原表位的擴增方法，包括1)提取病毒RNA；2)RT-PCR擴增；3)套式PCR擴增；4)PCR產(chǎn)物的克隆及測序分析等步驟。擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的S部分基因，擴增片段長782bp(位于S基因的1316bp-2097bp)，并且包含位于S基因1495bp-1914bp之間的中和抗原表位，實現(xiàn)能擴增在vero細胞上培養(yǎng)的不同代次的PEDV種毒的S基因，捕捉到了豬流行性腹瀉病毒在細胞培養(yǎng)傳代過程中S基因，特別是中和抗原表位的序列變化，從而能了解其與PEDV免疫效力變化的相關性。
文檔編號C12N15/70GK103088039SQ20131001357
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權日2013年1月14日
發(fā)明者何玲, 陳瑞愛, 唐滿華, 梁桂益 申請人:廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司