專利名稱：細(xì)粒棘球蚴重組bcg疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)重組BCG疫苗，用于預(yù)防控制動(dòng)物細(xì)粒棘球蝴病，同時(shí)還提供了該疫苗的制備方法，屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
棘球蝴病(cystic echinococcosis, CE)是一種嚴(yán)重危害人們身體健康的人畜共患寄生蟲(chóng)病，已成為農(nóng)牧民因病致貧，因病返貧的主要因素之一。目前對(duì)包蟲(chóng)病患者進(jìn)行包蟲(chóng)囊摘除術(shù)是首選的治療方法。但手術(shù)對(duì)人體帶來(lái)的損傷比較大且有可能復(fù)發(fā)，化療藥物可產(chǎn)生一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，需要研究更有效的解決方法，而疫苗預(yù)防是防治其流行的有效措施。預(yù)防細(xì)粒棘球蝴病的疫苗經(jīng)歷了多肽疫苗，亞單位疫苗，DNA疫苗等多種探索，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，重組活疫苗的制備得到了一種新的方法?；蛑亟M卡介苗(rBCG)是借助基因工程技術(shù)，將外源基因?qū)隑CG中構(gòu)建而成的多價(jià)疫苗(rBCG)，可誘導(dǎo)長(zhǎng)期的體液免疫和細(xì)胞免疫，近幾年的研究結(jié)果已顯示出rBCG具有非常好的應(yīng)用前景，有望發(fā)展成為預(yù)防疾病的一種實(shí)際可用的新型疫苗。本發(fā)明小組曹春寶等從細(xì)粒棘球蝴中克隆了 egGlY162抗原基因。結(jié)果顯示，egGlY162基因不論是在基因序列上，還是在氨基酸序列及蛋白結(jié)構(gòu)上均與國(guó)外研究者已研發(fā)出的用于終末宿主保護(hù)的候選疫苗emY162有高度的相似性，很可能也是終末宿主的保護(hù)性抗原。雖然使用BCG構(gòu)建多價(jià)疫苗在本領(lǐng)域已經(jīng)熟知，但影響疫苗效率的因素有很多，如何研發(fā)出預(yù)防棘球蝴病的 高效疫苗仍然是亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)重組BCG疫苗，為穿梭表達(dá)載體細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)重組BCG疫苗，具有熱穩(wěn)定性好，便于運(yùn)輸和保存，免疫力持久，免疫次數(shù)少，免疫程序簡(jiǎn)化，增強(qiáng)了針對(duì)細(xì)粒棘球蝴病的免疫效果。生產(chǎn)成本少，便于生產(chǎn)等特點(diǎn)。本發(fā)明還公開(kāi)了細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)重組BCG疫苗的制備方法，以利于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明重組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)BCG疫苗的解決方案如下首先獲得細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)保護(hù)性抗原基因，進(jìn)行TA克隆，將測(cè)序正確的目的片段酶切回收，再與經(jīng)同樣酶切的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體PMV361相連，構(gòu)建重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入BCG,經(jīng)抗性篩選和PCR擴(kuò)增篩選得到陽(yáng)性抗細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)重組BCG克隆。本發(fā)明所提供的重組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)BCG疫苗的制備方法，其包括如下步驟(I)合成上游和下游引物上游引物5'-CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3'；下游引物5'-CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3'；(2)目的基因egGlY162的PCR擴(kuò)增
以細(xì)粒棘球蝴cDNA為模板，采用上述的上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為滅菌水 16 μ 1，質(zhì)粒 2μ 1，EcoRI O. 5 μ 1，Hind III 0. 5μ I, mix 20 μ 1，共 40 μ I 擴(kuò)增體系；Touchdown PCR 反應(yīng)條件95°C 4 min ；95°C 30s，65°C 30s 降 1°C，72°C 2min 共 11 個(gè)循環(huán)；95°C 30s, 50°C 30s, 75°C 2min 共 25 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸，7min，末次 4°C，將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到大小為360bp的目的條帶；(3)目的片段egGlY162與載體PMV361的連接egGlY162擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化回收后先與PMD19-T載體連接，利用α互補(bǔ)原則篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定，將經(jīng)上述鑒定正確的陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后提取egGlY162-PMD19質(zhì)粒，將該質(zhì)粒經(jīng)EcoR1、Hind III限制性內(nèi)切酶酶切，凝膠回收目的片段后與同樣用EcoRI和Hind III進(jìn)行雙酶切的pMV361質(zhì)粒膠回收產(chǎn)物，按3 :1的摩爾比(目的片段載體)在T4DNA連接酶的催化下進(jìn)行連接，連接體系為buffer 緩沖液 I μ 1，目的片段 7 yl，PMV361 載體 I μ I，T4DNA 連接酶 I μ1，*10μ1的連接體系，16°C，連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化入E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞后，利用PMV361質(zhì)粒所攜帶的卡那霉素抗性篩選egGlY162-PMV361重組子，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定和EcoRI和Hind III雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為egGlY162-PMV361 ；(4)重組egGlY162_PMV361載體的電轉(zhuǎn)化將_80°C保存的BCG菌株復(fù)蘇后接種于含10% OADC的7H9液體培養(yǎng)基，180r /min，37°C，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即培養(yǎng)液變混濁，沙樣生長(zhǎng)后用于感受態(tài)細(xì)胞的制備。取在7H9液體培養(yǎng)基上 生長(zhǎng)良好的BCG培養(yǎng)物，37°C繼續(xù)震蕩培養(yǎng)10天，4°C，5000r/min離心IOmin收集菌體，以滅菌10%甘油洗滌4次，最后一次用適量的10%甘油重懸菌體，即得到BCG感受態(tài)細(xì)胞。分別將egGlY162-PMV361質(zhì)粒及空質(zhì)粒pMV361經(jīng)電穿孔法分別轉(zhuǎn)化入BCG感受態(tài)細(xì)胞中，具體電轉(zhuǎn)化條件為電容25Uf，電阻1000Ω，場(chǎng)強(qiáng)18X105V/ m，轉(zhuǎn)化時(shí)間為5 ms，轉(zhuǎn)化次數(shù)為3 ;放電結(jié)束后將100 μ L菌液立即轉(zhuǎn)移入I mL 7H9液體培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜(>24h)。取培養(yǎng)過(guò)夜的轉(zhuǎn)化后菌液800r/min室溫離心lOmin，取沉淀100 μ L均勻涂布于含OADC和30 μ g/ml卡那霉素的7H10固體培養(yǎng)基表面，37°C培養(yǎng)3-4周，培養(yǎng)基表面見(jiàn)轉(zhuǎn)化后菌落生長(zhǎng)。從7H10固體培養(yǎng)基平板表面挑取BCG重組子，接種于罕O(jiān)ADC的7H9液體培養(yǎng)基中，37°C，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定證實(shí)為陽(yáng)性克隆后，分別命名為egGlY162-PMV361-rBCG及PMV361- rBCG ；(5)重組 egGlY162-PMV361-rBCG 的誘導(dǎo)表達(dá)將經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定證實(shí)含有egGlY162-PMV361質(zhì)粒的rBCG陽(yáng)性克隆接種在含30 μ g/ml卡那霉素的7H9液體培養(yǎng)基中，37°C，180r/min振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(需3w左右)，進(jìn)行45°C熱誘導(dǎo)45min，離心收集菌體；加入Iml預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重懸菌泥后超聲粉碎，再加入等體積2XSDS-PAGE上樣緩沖液，10(TC煮沸5min，冰浴5min，4°C，12000rpm離心 5min ;取 10 μ I 上清進(jìn)行 SDS-PAGE 分析，最終獲得的 egGlY162_PMV361_rBCG表達(dá)的融合抗原，其分子量約為71KD。 使用穿梭表達(dá)載體細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)重組BCG疫苗egGlY162-PMV361-rBCG免疫小鼠后，不同程度的提高了小鼠的免疫水平。具體表現(xiàn)為在使用重組BCG疫苗egGlY162-PMV361-rBCG免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)的特異性抗體水平、細(xì)胞因子等免疫指標(biāo)均隨著免疫時(shí)間和次數(shù)的增加而升高，與BCG組合空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0. 05);免疫后進(jìn)行攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)重組BCG疫苗egGlY162-PMV361-rBCG免疫小鼠體內(nèi)的囊泡大體變化與空白對(duì)照組相比，囊數(shù)量減少，體積變小，部分囊表面混濁，部分囊壁塌陷，游離于腹腔，或附著于腸系膜或肝表面。囊濕重抑制率為68. 34%，表明本發(fā)明具有很好的抗細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的功效。重組BCG疫苗egGlY162-PMV361-rBCG既能發(fā)揮BCG本身較強(qiáng)的免疫佐劑的功能，又能使細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)保護(hù)性抗原蛋白表達(dá)并發(fā)揮其免疫保護(hù)作用，將免疫佐劑和載體的雙重優(yōu)勢(shì)加以完美組合，從而達(dá)到更好的預(yù)防細(xì)粒棘球蝴病的目的，該疫苗的研制具有非常廣闊的應(yīng)用前景和推廣應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明還在于重組BCG疫苗egGlY162-PMV361_rBCG在進(jìn)行熱誘導(dǎo)時(shí)依然穩(wěn)定表達(dá)蛋白質(zhì)，說(shuō)明該活疫苗具有熱穩(wěn)定性好，便于運(yùn)輸和保存，同時(shí)將該疫苗直接進(jìn)行預(yù)防接種，免去了蛋白質(zhì)的純化處理等后續(xù)復(fù)雜工序，減少了因蛋白質(zhì)后續(xù)處理工序?qū)Φ鞍捉Y(jié)構(gòu)功能的影響，易于生產(chǎn)，從而大大降低了生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化了工序，便于在基層的推廣應(yīng)用。


圖1 :egGlY162_PMV361 質(zhì)粒模式圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1I 材料本發(fā)明所使用的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒PMV361和BCG以及E. coli DH5 α菌株都可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得，PMV361和BCG以及E. coli DH5 α菌株購(gòu)自于BiovectorScience lab有限公司(中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心)。2 方法2.1引物的設(shè)計(jì)及合成參照細(xì)粒棘球蝴egGlY162基因序列(GenBank登錄號(hào)分別為AB458258和AB458259)和PMV361質(zhì)粒圖譜設(shè)計(jì)上下游引物，并引入EcoR1、Hind III限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。上游引物5'-CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3 '，帶下劃線部分為 EcoRI 位占.下游引物5' -CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3'，帶下劃線部分為 Hind III位點(diǎn)。2. 2目的基因egGlY162的PCR擴(kuò)增以細(xì)粒棘球蝴cDNA為模板，采用上述的上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為滅菌水 16 μ 1，質(zhì)粒 2μ 1，EcoRI O. 5 μ 1，Hind III 0. 5μ I, mix 20 μ 1，共 40 μ I 擴(kuò)增體系；Touchdown PCR 反應(yīng)條件95°C 4 min ；95°C 30s，65°C 30s 降 1°C，72°C 2min 共 11 個(gè)循環(huán)；95°C 30s, 50°C 30s, 75°C 2min 共 25 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸，7min，末次 4°C，將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到大小為360bp的目的條帶。2. 3重組egGlY162_PMV361載體質(zhì)粒的構(gòu)建2. 3.1目的片段egGlY162與載體PMV361的連接
egGlY162擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化回收后先與PMD19-T載體連接，利用α互補(bǔ)原則篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定，將經(jīng)上述鑒定正確的陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后提取egGlY162-PMD19質(zhì)粒，將該質(zhì)粒經(jīng)EcoR1、Hind III限制性內(nèi)切酶酶切，凝膠回收目的片段后與同樣用EcoRI和Hind III進(jìn)行雙酶切的pMV361質(zhì)粒膠回收產(chǎn)物，按3 :1的摩爾比(目的片段載體)在T4DNA連接酶的催化下進(jìn)行連接，連接體系為buffer 緩沖液 1 μ 1，目的片段 7 yl，PMV361 載體 1 μ I，T4DNA 連接酶 1 μ1，*10μ1的連接體系，16°C，連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化入E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞后，利用PMV361質(zhì)粒所攜帶的卡那霉素抗性篩選egGlY162-PMV361重組子，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定和EcoRI和Hind III雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為egGlY162-PMV361。2. 3. 2 重組 egGlY162_PMV361 載體的電轉(zhuǎn)化將_80°C保存的BCG菌株復(fù)蘇后接種于含10% OADC的7H9液體培養(yǎng)基，180r /min，37°C，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即培養(yǎng)液變混濁，沙樣生長(zhǎng)后用于感受態(tài)細(xì)胞的制備。取在7H9液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的BCG培養(yǎng)物，37°C繼續(xù)震蕩培養(yǎng)10天，4°C，5000r/min離心IOmin收集菌體，以滅菌10%甘油洗滌4次，最后一次用適量的10%甘油重懸菌體，即得到BCG感受態(tài)細(xì)胞。分別將egGlY162-PMV361質(zhì)粒及空質(zhì)粒pMV361經(jīng)電穿孔法分別轉(zhuǎn)化入BCG感受態(tài)細(xì)胞中，具體電轉(zhuǎn)化條件為電容25Uf，電阻1000Ω，場(chǎng)強(qiáng)18X105V/ m，轉(zhuǎn)化時(shí)間為5 ms，轉(zhuǎn)化次數(shù)為3 ;放電結(jié)束后將100 μ L菌液立即轉(zhuǎn)移入I mL 7H9液體培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜(>24h)。取培養(yǎng)過(guò)夜的轉(zhuǎn)化后菌液800r/min室溫離心lOmin，取沉淀100 μ L均勻涂布于含OADC和30 μ g/ml卡那霉素的7H10固體培養(yǎng)基表面，37°C培養(yǎng)3-4周，培養(yǎng)基表面見(jiàn)轉(zhuǎn)化后菌落生長(zhǎng)。從7H10固體培養(yǎng)基平板表面挑取BCG重組子，接種于罕O(jiān)ADC的7H9液體培養(yǎng)基中，37°C，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定證實(shí)為陽(yáng)性克隆后，分別命名為egGlY162-PMV361-rBCG及PMV361- rBCG。2. 3. 3 重組 egGlY162-PMV361-rBCG 的誘導(dǎo)表達(dá)將經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定證實(shí)含有egGlY162-PMV361質(zhì)粒的rBCG陽(yáng)性克隆接種在含30 μ g/ml卡那霉素的7H9液體培養(yǎng)基中，37°C，180r/min振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(需3w左右)，進(jìn)行45°C熱誘導(dǎo)45min，離心收集菌體；加入Iml預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重懸菌泥后超聲粉碎，再加入等體積2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，100°C煮沸5min，冰浴5min，4°C，12000rpm離心5min ;取10 μ I上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。因egGlY162_PMV361質(zhì)粒中含Hsp60標(biāo)簽(分子量約60KD)和egGlY162(分子量大小約為11KD)，最終獲得的egGlY162-PMV361_rBCG表達(dá)的融合抗原分子量約為71KD。2. 3. 4 重組 egGlY162-PMV361-rBCG 的 Western blotting 分析將熱誘導(dǎo)后的rBCG菌體蛋白作SDS-PAGE后，用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上；轉(zhuǎn)印膜于封閉液中室溫?fù)u床封閉3h ;用PBS-T洗滌3次，每次15min ;用封閉液稀釋的1: 100棘球蝴病人血清室溫?fù)u床孵育2h ;用PBS洗滌3次，每次10min ;用封閉液稀釋的1:1 000人血二抗37°C搖床孵育1h ;用PBS洗滌3次，每次10min ;用DAB顯色劑對(duì)PVDF膜避光反應(yīng)10-15min，蒸餾水終止反應(yīng)。在PVDF膜上可見(jiàn)分子量約為71KD的特異性條帶。試驗(yàn)例1穿梭表達(dá)載體細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)重組BCG疫苗的用途
I 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用健康雌性Balb/c小鼠，隨機(jī)分為3組:A組免疫重組egGlY162-PMV361-rBCG (n=20)組，B 組PMV361_rBCG 對(duì)照組(n=20)和 C 組生理鹽水 NS空白對(duì)照組(n=20)。2 方法A、B、C組分別背部皮下多點(diǎn)注射重組egGlY162-PMV361-rBCG、PMV36ItBCG和NS，劑量為100 μ g/只/次，共3次，每次間隔2周，每次免疫前小鼠內(nèi)眥采血收集血清備用，在第3次免疫后一周每只小鼠接種約1000個(gè)活細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蝴繼發(fā)感染。于感染后70天，采血，處死小鼠，剖檢，進(jìn)行以下各項(xiàng)免疫指標(biāo)檢測(cè)，包括囊泡濕重抑制率、囊泡數(shù)量以及大體改變ELISA檢測(cè)小鼠血清中特異性抗體水平變化和細(xì)胞因子變化等，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析評(píng)價(jià)免疫保護(hù)效果。3 結(jié)果3.1細(xì)粒棘球蝴囊大體觀察NS對(duì)照組20只小鼠腹腔均有細(xì)粒棘球蝴囊生長(zhǎng)，囊壁光滑透明，張力高，數(shù)量多。BCG對(duì)照組與NS對(duì)照組觀察結(jié)果類似。重組egGlY162-PMV361-rBCG預(yù)防組有8只(8/20)小鼠腹腔及肝表面未見(jiàn)包蟲(chóng)囊腫，表明這8只小鼠獲得了完全保護(hù)，另外12只小鼠均有棘球蝴囊生長(zhǎng)，但與NS對(duì)照組相比，囊數(shù)量減少，體積變小，部分囊表面混濁，部分囊壁塌陷，游離于腹腔，或附著于腸系膜或肝表面。3. 2囊濕重抑制率結(jié)果

各組小鼠均取出細(xì)粒棘球蝴囊分別稱重，計(jì)算囊濕重抑制率。與NS對(duì)照組比較，重組egGlY162-PMV361-rBCG預(yù)防組的囊濕重抑制率為67. 4% (見(jiàn)表I)。說(shuō)明本發(fā)明所采取的免疫程序安全有效，簡(jiǎn)便易行。3. 3病理學(xué)觀察光鏡下觀察生理鹽水對(duì)照組細(xì)粒棘球蝴囊角質(zhì)層呈多層文理狀，生發(fā)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰。重組egGlY162-PMV361-rBCG預(yù)防組的棘球蝴囊壁出現(xiàn)不同程度的病理學(xué)改變，有的囊壁角質(zhì)層輕度變性，紋理模糊；有的角質(zhì)層重度變性，紋理消失，生發(fā)層脫落，外膜層有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，觀察結(jié)果見(jiàn)表2。重組egGlY162-PMV361-rBCG預(yù)防組與生理鹽水對(duì)照組的囊病變之間有顯著性差異(P〈0. 01)，提示重組egGlY162-PMV361-rBCG均可增強(qiáng)宿主的抗棘球蝴能力。3.4對(duì)小鼠血清特異性抗體及細(xì)胞因子水平的影響rBCG-EgGlY162疫苗有非常理想的免疫調(diào)節(jié)作用，血清中總IgG，IgG亞類和IgE水平及相應(yīng)細(xì)胞因子水平變化明顯，說(shuō)明有上調(diào)Thl型免疫應(yīng)答，起到了免疫佐劑的作用。(如表3、4、5所示)。表I重組BCG_EgGlY162免疫預(yù)防小鼠的細(xì)粒棘球蝴囊濕重抑制率
權(quán)利要求
1.重組細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)BCG疫苗的制備方法，其包括如下步驟(1)合成上游和下游引物上游引物5' -CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3'；下游引物5' -CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3'；(2)目的基因egGlY162的PCR擴(kuò)增以細(xì)粒棘球蝴cDNA為模板，采用上述的上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為滅菌水 16 μ 1，質(zhì)粒 2 μ 1，EcoRI O. 5 μ I, HindIII O. 5 μ I, mix 20 μ 1，共 40 μ I 擴(kuò)增體系; Touchdown PCR 反應(yīng)條件95°C 4 min ；95°C 30s, 65°C 30s 降 1°C，72°C 2min 共 11 個(gè)循環(huán)；95°C 30s, 50°C 30s, 75°C 2min 共 25 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸，7min，末次 4°C，將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到大小為360bp的目的條帶；(3)目的片段egGlY162與載體PMV361的連接egGlY162擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化回收后先與PMD19-T載體連接，利用α互補(bǔ)原則篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定，將經(jīng)上述鑒定正確的陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后提取egGlY162-PMD19質(zhì)粒，將該質(zhì)粒經(jīng)EcoR1、Hind III限制性內(nèi)切酶酶切， 凝膠回收目的片段后與同樣用EcoRI和Hind III進(jìn)行雙酶切的pMV361質(zhì)粒膠回收產(chǎn)物， 按3 :1的摩爾比(目的片段載體)在T4DNA連接酶的催化下進(jìn)行連接，連接體系為 buffer 緩沖液 I μ 1，目的片段 7 yl，PMV361 載體 I μ I，T4DNA 連接酶 I μ1，*10μ1 的連接體系，16°C，連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化入E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞后，利用PMV361質(zhì)粒所攜帶的卡那霉素抗性篩選egGlY162-PMV361重組子，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定和EcoRI 和Hind III雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為egGlY162-PMV361 ；(4)重組egGlY162-PMV361載體的電轉(zhuǎn)化將-80°C保存的BCG菌株復(fù)蘇后接種于含10% OADC的7H9液體培養(yǎng)基，180r / min， 37°C，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即培養(yǎng)液變混濁，沙樣生長(zhǎng)后用于感受態(tài)細(xì)胞的制備。取在7H9液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的BCG培養(yǎng)物，37°C繼續(xù)震蕩培養(yǎng)10天，4°C，5000 r/min離心IOmin收集菌體，以滅菌10%甘油洗滌4次，最后一次用適量的10%甘油重懸菌體，即得到BCG感受態(tài)細(xì)胞。分別將egGlY162-PMV361質(zhì)粒及空質(zhì)粒pMV361經(jīng)電穿孔法分別轉(zhuǎn)化入BCG感受態(tài)細(xì)胞中，具體電轉(zhuǎn)化條件為電容25Uf，電阻1000 Ω，場(chǎng)強(qiáng)18 X 105V/ m，轉(zhuǎn)化時(shí)間為5 ms，轉(zhuǎn)化次數(shù)為3 ;放電結(jié)束后將100 μ L菌液立即轉(zhuǎn)移入I mL 7H9液體培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜(>24h)。取培養(yǎng)過(guò)夜的轉(zhuǎn)化后菌液800r/min室溫離心lOmin，取沉淀 100 μ L均勻涂布于含OADC和30 μ g/ml卡那霉素的7H10固體培養(yǎng)基表面，37°C培養(yǎng)3_4 周，培養(yǎng)基表面見(jiàn)轉(zhuǎn)化后菌落生長(zhǎng)。從7H10固體培養(yǎng)基平板表面挑取BCG重組子，接種于罕O(jiān)ADC的7H9液體培養(yǎng)基中，37°C，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定證實(shí)為陽(yáng)性克隆后，分別命名為egGlY162-PMV361-rBCG及PMV361- rBCG ；(5)重組egGlY162-PMV361-rBCG 的誘導(dǎo)表達(dá)將經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定證實(shí)含有egGlY162-PMV361質(zhì)粒的rBCG陽(yáng)性克隆接種在含30 μ g/ ml卡那霉素的7H9液體培養(yǎng)基中，370C，180r/min振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(需3w左右)， 進(jìn)行45°C熱誘導(dǎo)45min，離心收集菌體；加入Iml預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重懸菌泥后超聲粉碎，再加入等體積2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，100°C煮沸5min,冰浴5min, 4°C, 12000rpm離心 5min ;取10μ I上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，最終獲得的egGlY162-PMV361_rBCG表達(dá)的融合抗原，其分子量約為71KD 。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種細(xì)粒棘球蚴重組BCG疫苗的制備；本疫苗具有熱穩(wěn)定性好，便于運(yùn)輸和保存，單次免疫就可誘導(dǎo)高效價(jià)的針對(duì)“靶抗原”的抗體，免疫力持久，免疫次數(shù)少，簡(jiǎn)化了免疫程序，增強(qiáng)了針對(duì)細(xì)粒棘球蚴病的免疫效果。
文檔編號(hào)C12N15/74GK103041382SQ20131001385
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者丁劍冰, 馬海梅, 祖力皮也·吐?tīng)栠d, 馬秀敏, 曹春寶, 德里夏提·依米提, 朱明 , 溫浩 申請(qǐng)人:新疆醫(yī)科大學(xué)