專利名稱：一種用于禽肺病毒c亞群特異性檢測的熒光定量rt-pcr檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，特別涉及一種用于禽肺病毒C亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒及其應(yīng)用，屬于病毒檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
C亞型禽肺病毒(APV/C)是在1997年于美國科羅拉多州的發(fā)病火雞群中分離得至|J。APV屬于副粘病毒科，肺病毒亞科，偏肺病毒亞屬。根據(jù)其G基因的不同將歐洲病毒株分為A、B、C、D四個亞型。C亞型G基因與A和B亞型的同源性較低，且比A和B的G基因序列要長很多。APV的M蛋白高度保守，A和B亞型M蛋白的同源性為89%，但C亞型與A和B亞型M蛋白的同源性分別為78%和77%，APV/C亞型與APV/A和APV/B亞型F蛋白的同源性為83%，因此，美國流行的APV/C亞型與歐洲流行的APV/A和APV/B亞型有著顯著的不同，但APV/C亞型與人偏肺病毒(HMPV)核酸序列相似。雖然在中國沒有關(guān)于APV/C亞型的報道，且美國與中國地理位置上距離遠(yuǎn)，但中國和美國養(yǎng)禽業(yè)進(jìn)出口貿(mào)易頻繁，很有可能對中國的養(yǎng)禽業(yè)造成危害。另外，中國的臨近國韓國已有對APV/C亞型的報道，因此建立一種針對APV/C亞型的快速、靈敏的診斷方法對APV快速檢測、預(yù)防具有重要意義。本研究為針對C亞群APV檢測的熒光定量RT-PCR的檢測試劑盒及其應(yīng)用，本發(fā)明的檢測試劑盒具有良好的敏感性和特異性，方便快捷且同時能夠區(qū)分亞群，為APV的臨床檢測、流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)C亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為:根據(jù)GenBank中，禽肺病毒(APV) C亞群序列設(shè)計I對針對G基因的引物和I條特異性TaqMan探針，建立了一種快速檢測APV C亞群病毒載量的特異性TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法并組裝了試劑盒。通過對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化，使得使用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行的熒光定量RT-PCR檢測在I X IO3 I X IO9個拷貝.μ L—1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，靈敏度達(dá)到IO2個拷貝.μ L—1，是常規(guī)RT-PCR方法的100倍，而且與常規(guī)RT-PCR方法相比(BAYON-AUB0YER Μ, JESTIN V, TOQUIN D, et al Comparison of F-, G-and N-basedRT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detectionand typing of turkey rhinotracheitis virus.A rch Virol,1999, 144:1091-1109 ；或 DAR A Mj TUNE Kj MUNIR S，et al, PCR-based detection of an emerging avianpneumovirus in US turkey flocks, J Vet Diagn Invest，2001，13(3):201-205 ;或GHARAIBEHIS M，ALGHARAIBEHG Rj Serological and Molecular Detection of AvianPneumovirus in Chickens with Respiratory Disease in Jordan, Poultry science，2007,86 (6): 1677-1681)，使用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行的熒光定量RT-PCR檢測可對結(jié)果進(jìn)行實時監(jiān)控，無需進(jìn)一步進(jìn)行凝膠電泳分析。試驗表明，使用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行的熒光定量RT-PCR檢測與其他禽病病毒無交叉反應(yīng)，且C亞群的熒光定量RT-PCR與其他亞群的RNA標(biāo)準(zhǔn)品不反應(yīng)，說明本發(fā)明試劑盒具有良好的敏感性和特異性。將備檢樣品提取RNA后，不用反轉(zhuǎn)錄，直接進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，利用所建立的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒可以在2h內(nèi)快速準(zhǔn)確地對APV C亞群進(jìn)行檢測，既能進(jìn)行定性檢測，又能準(zhǔn)確定量，而且能夠?qū)㈥栃詷悠返膩喨哼M(jìn)行準(zhǔn)確的判斷。本發(fā)明一種用于禽肺病毒C亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于包括特異性擴(kuò)增禽肺病毒C亞群G基因的特異性引物對和探針，其中所述的引物對中兩條引物的核苷酸序列分別如下所示: 上游引物:5’GGGCTAGTCAGCTTTGAACTC3’(SEQID N0.1 所示)下游引物:5’CTGTGTTTGTCTTATTATCCCTTGG3’(SEQID N0.2 所示)所述的探針序列如下所示:5’FAM-GCCCTAAGTTTATGTAGGATCCAAGGGACTC-TAMRA3’ (SEQ ID N0.3 所示)。在本發(fā)明中，所述的試劑盒中還可包括反應(yīng)混合液，T7RNA聚合酶以及不含RNase的雙蒸水。其中，反應(yīng)混合液中包含有PCR擴(kuò)增所需要的成分:25mmol/L MgCl2以及IOmmol/L dNTPs。所述的反應(yīng)混合液可為 2XQuantiTect Probe RT-PCR Master Mix,購自 Qiagen公司。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的試劑盒在制備禽肺病毒C亞群檢測試劑中的應(yīng)用。及所述的試劑盒在制備以禽肺病毒G基因為靶點區(qū)分禽肺病毒亞群試劑中的應(yīng)用。


圖1為熒光定量RT-PCR的動力學(xué)曲線；圖2為熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為常規(guī)RT-PCR的敏感性試驗；圖4為使用熒光定量RT-PCR對APV的A、B和C亞群的G基因以及B亞群病毒進(jìn)行擴(kuò)增的動力學(xué)曲線。
具體實施例方式下面通過實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1本發(fā)明試劑盒中探針及引物序列的設(shè)計和合成根據(jù)GenBank中APV的C亞群的G基因序列(GenBank登錄號為GC:AY590688.1)設(shè)計I對分別針對目的基因的上下游引物:上游引物GCF:5’GGGCTAGTCAGCTTTGAACTC3’(SEQ ID N0.1 所示)下游引物GCR:5’ CTGTGTTTGTCTTATTATCCCTTGG3’ (SEQ ID N0.2 所示)及I條特異性Taqman探針:探針GC:5’FAM-GCCCTAAGTTTATGTAGGATCCAAGGGACTC-TAMRA3’ (SEQ ID N0.3 所示)。引物由北京六合華大基因公司合成，探針由TaKaRa公司合成。實施例2本發(fā)明試劑盒在檢測禽肺病毒(APV) C亞群病毒中的應(yīng)用I材料與方法1.1菌株與質(zhì)粒E.coli DH5a由本實驗室保存，APV的四個亞群的G基因(GenBank登錄號分別為Ga:AY640317.1，Gb:AB548428.1，GC:AY590688.1，GD:AJ251085.1)由哈爾濱博仕生物合成并克隆到 pBluescript IIKS ( + )載體上，分別命名為 PBL_Ga，PBL-Gb, PBL-Gc, PBL-Gd 由本實
驗室保存。1.2儀器與試劑LightCycler480熒光定量PCR儀購自Roche公司，紫外分光光度計購自GE公司；質(zhì)粒提取試劑盒AxyGen公司；OneStep RT-PCR試劑盒和QuantiTect^ Probe RT-PCR試劑盒購自 Qiagen 公司，T7RNA polymerase 購自 Pragma 公司。1.3探針的設(shè)計與合成按照實施例1方法制備。1.4陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備以合成的PBL-Ga, PBL-Gb, PBL-Gc, PBL-Gd 質(zhì)粒為模板，利用 T7RNA polymerase 試劑盒分別生成RNA，測其濃度后，換算成拷貝數(shù)，并稀釋至IOltl個拷貝.μ Λ-80 保存，用前稀釋作為陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品。1.5熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化以陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在不同退火溫度下進(jìn)行常規(guī)RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，確定最佳的引物退火溫度。應(yīng)用矩陣法對熒光定量RT-PCR的引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。1.6熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋至濃度范圍為IX IO3 IX IO9個拷貝.μ L'以稀釋的RNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)，進(jìn)行熒光定量-RT-PCR檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.7敏感性試驗將陽性RNAlO倍梯度稀釋至最低濃度為每微升10個拷貝，每個梯度做3個重復(fù)，進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，確定檢測的敏感性。同時以等量的RNA為模板，進(jìn)行常規(guī)RT-PCR反應(yīng)，具體引物(2F/2R)和退火溫度參照文獻(xiàn)(DARA M, TUNE K, MUNIR S，et al, PCR-baseddetection of an emerging avian pneumovirus in US turkey flocks, J Vet DiagnInvest, 2001, 13(3): 201-205.)。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ L，用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，比較二者敏感性的差異。 1.8特異性試驗雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)，禽流感病毒(AIV H5，AIV H7，AIV H9)，雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)，新城疫病毒(NDV)，雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒(ARV)和網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)等病毒的RNA，利用建立的熒光定量RT-PCR方法對其進(jìn)行檢測，同時利用建立的針對C亞群的熒光定量RT-PCR檢測APV其他3個亞群的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，同時設(shè)陰性和陽性對照。
2 結(jié)果2.1熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化C亞群熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系共為20 μ L，含10 μ L2XQuantiTect ProbeRT-PCR Master Mix，6.75 μ L 水，0.25 μ L Enzyme，0.125 μ L 探針 GC (20ηΜ)，0.1875 μ L上游引物GCF (40ηΜ)，0.1875 μ L下游引物GCR (40ηΜ),陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品2.5 μ L。反應(yīng)條件為:48°C 30min,95°C IOmin ；95°C 15sec,60°C lmin，40 個循環(huán)。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了檢測APV C亞群的動力學(xué)曲線(見圖1)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)。標(biāo)準(zhǔn)品濃度從IX IO3 IX IO9個拷貝.μΓ1具有良好的線性關(guān)系(Error均小于0.2, Light Cycler480分析軟件計算得到的Error值為用于擬合線性回歸時的單個數(shù)據(jù)點的平均方差，它代表定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以接受的誤差值應(yīng)小于0.2)。圖1x軸為循環(huán)閾值，y軸為熒光強(qiáng)度。圖2x軸為RNA標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值，y軸為循環(huán)閾值。2.3敏感性試驗熒光定量RT-PCR能檢出的模板最低濃度為IO2個拷貝.μ L_\而常規(guī)RT-PCR能檢出的模板最低濃度為IO4個拷貝.μ Γ1 (見圖3)，表明所建立的熒光定量RT-PCR的敏感性是常規(guī)RT-PCR的100倍。2.4特異性試驗用熒光定量RT-PCR 對 IBV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，IBDV，NDV，ARV 和 REV 進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為陰性，這些病毒的擴(kuò)增曲線均為水平線，未達(dá)到檢出閾值，而RNA標(biāo)準(zhǔn)品(GC:AY590688.1)，有良好的擴(kuò)增。用熒光定量RT-PCR對APV的A、B和C亞群的G基因(GenBank登錄號分別為Ga:AY640317.1、Gb:AB548428.1 和 GC:AY590688.1)和 B 亞群病毒 RNA 進(jìn)行檢測，結(jié)果只有 C亞群的為陽性，其他兩個亞群均為陰性(見圖4)。圖4x軸為循環(huán)閾值，y軸為熒光強(qiáng)度。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，對本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
序列表
<110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱待醫(yī)研究所
〈120〉一種爪丁‘禽肺病毒C亞群特異性檢廁的熒光定量RT-PCR試劑盒及其應(yīng)/I]
<130> KLPI120964
<170> PatentIn 3, 5
<210> I
<211〉 21bp <212> DNA
〈213〉人X合成序列(引物)
<400> I
gggctagtcagctttgaactc
<210> 2<211> 26bp<212> DNA
〈213〉人工合成序列(引物)
<400> 2
ctgtgtttgtcttattatcccttgg
<210〉 3<211> Slbp<212〉DM
<213>人工合成序列(探針)
<-400> 3
gc cctaagtttatgtaggatc c aagggactc
權(quán)利要求
1.一種用于禽肺病毒C亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于包括特異性擴(kuò)增禽肺病毒C亞群G基因的特異性引物對和I條特異性Taqman探針，其中所述的引物對中兩條引物的核苷酸序列分別如下所示: 上游引物:5’ GGGCTAGTCAGCTTTGAACTC3’ 下游引物:5’ CTGTGTTTGTCTTATTATCCCTTGG3’ 所述的探針序列如下所示:5’ FAM-GCCCTAAGTTTATGTAGGATCCAAGGGACTC-TAMRA3’。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中還包括反應(yīng)混合液，T7RNA聚合酶以及不含RNase的雙蒸水。
3.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒在制備禽肺病毒C亞群檢測試劑中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒在制備以禽肺病毒G基因為靶點區(qū)分禽肺病毒亞群試劑中的應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于禽肺病毒C亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于包括特異性擴(kuò)增禽肺病毒C亞群G基因的特異性引物對和探針，其中所述的引物對中兩條引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1、2所示，所述的探針序列如SEQ ID NO.3所示。使用本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)對禽肺病毒C亞群病毒的檢測，本發(fā)明的試劑盒在1×103～1×109個拷貝·μL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，靈敏度達(dá)到102個拷貝·μL-1，是普通RT-PCR方法的100倍，且與其他禽病病毒無交叉反應(yīng)。結(jié)果表明，本發(fā)明的試劑盒具有良好的敏感性和特異性，可用于禽肺病毒C亞群的定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103103289SQ20131001442
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者高玉龍, 王笑梅, 高宏雷, 王永強(qiáng), 祁小樂, 秦立廷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所