專利名稱：一種用于禽肺病毒a亞群特異性檢測的熒光定量rt-pcr試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，特別涉及一種用于禽肺病毒A亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒及其應(yīng)用，屬于病毒檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)又稱火雞鼻氣管炎病毒(turkyrhinotracheits virus, TRTV)。禽肺病毒屬于副粘病毒科，肺病毒亞科，偏肺病毒亞屬。禽肺病毒引起的疾病最早在火雞上發(fā)現(xiàn)，該病毒引起火雞的呼吸道疾病并導(dǎo)致產(chǎn)蛋量下降。在雞上禽肺病毒是引起腫頭綜合征的重要因素，但APV的致死率不高(2% 5%)。自1978年南非首次報道APV，歐洲和中東多次報道APV，在世界的許多地方APV對火雞和雞造成嚴(yán)重的威脅。根據(jù)編碼禽肺病毒G蛋白的基因不同將歐洲病毒株分為兩個亞型，即A亞型APV (APV/A)(英國)和B亞型APV (APV/B)(歐洲大陸)。APV/A亞型與APV/B亞型相似，但G蛋白只有38%的相似率，這兩個亞型在歐洲廣泛流行。APV/A亞型在南非和英格蘭首次分離到:在亞洲的日本、韓國、黎巴嫩和以色列等國家有針對于APV/A亞型的報道。我們對國內(nèi)的雞群進(jìn)行了禽肺病毒血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示APV普遍感染，發(fā)現(xiàn)有的祖代種雞場的抗體陽性率有的高達(dá)100%，這應(yīng)該引起中國養(yǎng)禽業(yè)的足夠重視。但尚未知道是哪一種亞型的APV引起的，建立一種快速、靈敏的診斷方法且能快速分型對診斷和控制APV極為重要。尤其是APV/A亞群，中國臨近國家如日本、韓國和以色列等已有APV/A亞群的流行的報道，極有可能對中國的養(yǎng)雞業(yè)造成危害。在2008年已有報道在中國東南方的雞市場檢測到APV/A亞群。因此建立一種針對APV/A亞群的高效的診斷方法是當(dāng)務(wù)之急。熒光定量PCR是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，具有快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點，非常適用于病毒感染的檢測，尤其是感染的早期診斷，該方法不僅能精確定量，而且由于其具有探針與引物的雙重特異性，從而減少了假陽性。目前，APV的實驗室常規(guī)診斷方法主要是RT-PCR，但是該方法在用于APV檢測時仍在敏感性、特異性和時效性等方面均存在不足，特別是在該病的早期診斷中體現(xiàn)得尤為明顯。本研究為針對A亞群APV檢測的熒光定量RT-PCR的檢測試劑盒及其應(yīng)用，本發(fā)明的檢測試劑盒具有良好的敏感性和特異性，方便快捷且同時能夠區(qū)分亞群，為APV的早期、分型檢測提供了強有力的診斷方法，同時為APV感染、增殖規(guī)律的研究提供了重要的檢測技術(shù)手段，對APV的臨床診斷和致病機理的研究具有一定應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明 所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)A亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為:根據(jù)GenBank中，禽肺病毒A亞群序列設(shè)計I對針對G基因的引物和I條特異性TaqMan探針，建立了一種快速檢測APV A亞群病毒載量的特異性TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法并組裝了試劑盒。通過對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化，使得使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行的熒光定量RT-PCR檢測在IXlO3 IX IO9個拷貝.μ L—1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，靈敏度達(dá)到IO2個拷貝.μ L_\是常規(guī)RT-PCR方法的100倍，而且與常規(guī)RT-PCR方法相比(BA YON-AUBOYER M, JESTIN V，TOQUIN D, et al Comparison of F-, G-and N-basedRT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detectionand typing of turkey rhinotracheitis virus.Arch Virol，1999，144:1091—1109 ;或 DAR A Mj TUNE Kj MUNIR S，et al,PCR-based detection of an emerging avianpneumovirus in US turkey flocks, J Vet Diagn Invest，2001，13(3):201-205 ;或GHARAIBEHIS M，ALGHARAIBEHG Rj Serological and Molecular Detection of AvianPneumovirus in Chickens with Respiratory Disease in Jordan, Poultry science，2007，86 (6): 1677-1681)，使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行的熒光定量RT-PCR檢測可對結(jié)果進(jìn)行實時監(jiān)控，無需進(jìn)一步進(jìn)行凝膠電泳分析。試驗表明，使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行的熒光定量RT-PCR檢測與其他禽病病毒無交叉反應(yīng)，且A亞群的熒光定量RT-PCR與其他亞群的RNA標(biāo)準(zhǔn)品不反應(yīng)，說明本發(fā)明試劑盒具有良好的敏感性和特異性。將備檢樣品提取RNA后，不用反轉(zhuǎn)錄，直接進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，利用所建立的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒可以在2h內(nèi)快速準(zhǔn)確地對APV A亞群進(jìn)行檢測，既能進(jìn)行定性檢測，又能準(zhǔn)確定量，而且能夠?qū)㈥栃詷悠返膩喨哼M(jìn)行準(zhǔn)確的判斷。本發(fā)明的一種用于禽肺病毒A亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于包括特異性擴增禽肺病毒A亞群G基因的特異性引物對和探針，其中所述的引物對中兩條引物的核苷酸序列分別如下所示:上游引物:5’GGTACATATTGGCTATAGTC3’(SEQID N0.1 所示)下游引物:5’CTCCTCCATTGTAGTTTCTGCACTCC3’(SEQID N0.2 所示)所述的探針序列如下所示:5’FAM-GTTAGCGTCATAGTTGAACAGTCAGTGTTAG-TAMRA3’ (SEQ ID N0.3 所示)。在本發(fā)明中，所述的試劑盒中還可包括反應(yīng)混合液，T7RNA聚合酶以及不含RNase的雙蒸水。其中，反應(yīng)混合液中包含有PCR擴增所需要的成分:25mmol/L MgCl2以及IOmmol/L dNTPs。所述的反應(yīng)混合液可為 2XQuantiTect Probe RT-PCR Master Mix,購自 Qiagen公司。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的試劑盒在制備禽肺病毒A亞群檢測試劑中的應(yīng)用。及所述的試劑盒在制備以禽肺病毒G基因為靶點區(qū)分禽肺病毒亞群試劑中的應(yīng)用。


圖1為熒光定量RT-PCR的動力學(xué)曲線；圖2為熒光定量 RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為常規(guī)RT-PCR的敏感性試驗；圖4為使用熒光定量RT-PCR對APV的A、B和C亞群的G基因以及B亞群病毒進(jìn)行擴增的動力學(xué)曲線。
具體實施例方式下面通過實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1本發(fā)明試劑盒中探針及引物序列的設(shè)計和合成根據(jù)GenBank中APV的A亞群的G基因序列(GenBank登錄號為GA:AY640317.1)設(shè)計I對分別針對目的基因的上下游引物:上游引物GAF: 5’ GGTACATATTGGCTATAGTC3’下游引物GAR: 5’ CTCCTCCATTGTAGTTTCTGCACTCC3’及I條特異性Taqman探針: 探針GA: 5，F(xiàn)AM-GTTAGCGTCATAGTTGAACAGTCAGTGTTAG-TAMRA3，。引物由北京六合華大基因公司合成，探針由TaKaRa公司合成。實施例2本發(fā)明試劑盒在檢測禽肺病毒(APV) A亞群病毒中的應(yīng)用I材料與方法1.1菌株與質(zhì)粒E.coli DH5a由本實驗室保存，APV的四個亞群的G基因(GenBank登錄號分別為Ga:AY640317.1，Gb:AB548428.1，GC:AY590688.1，GD:AJ251085.1)由哈爾濱博仕生物合成并克隆到 pBluescript IIKS ( + )載體上，分別命名為 PBL_Ga，PBL-Gb, PBL-Gc, PBL-Gd 由本實
驗室保存。1.2儀器與試劑LightCycler480熒光定量PCR儀購自Roche公司，紫外分光光度計購自GE公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自AxyGen公司；0neStep RT-PCR試劑盒和QuantiTectw Probe RT-PCR試劑盒購自Qiagen公司，T7RNA polymerase購自Pragma公司。1.3探針的設(shè)計與合成按照實施例1方法制備。1.4陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備以合成的PBL-Ga, PBL-Gb, PBL-Gc, PBL-Gd質(zhì)粒為模板，利用T7RNA聚合酶試劑盒分別生成RNA，測其濃度后，換算成拷貝數(shù)，并稀釋至IOltl個拷貝.yL'-SCTC保存，用前稀釋作為陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品。1.5熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化以陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在不同退火溫度下進(jìn)行常規(guī)RT-PCR反應(yīng)，擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，確定最佳的引物退火溫度。應(yīng)用矩陣法對熒光定量RT-PCR的引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。1.6熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋至濃度范圍為IXlO3 IXlO9個拷貝.μΓ1。以稀釋的RNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)，進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.7敏感性試驗將陽性RNAlO倍梯度稀釋至最低濃度為10個拷貝.μ L—1，每個梯度做3個重復(fù)，進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，確定檢測的敏感性。同時以等量的RNA為模板，進(jìn)行常規(guī)RT-PCR反應(yīng)，具體引物(Ga/Gx)和退火溫度參照文獻(xiàn)(BAYON-AUBOYER M, JESTIN V，TOQUIND, et al Comparison of F-,G-and N-based RT-PCR protocols with conventionalvirological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitisvirus.Arch Virol, 1999，144:1091-1109)。取擴增產(chǎn)物5 μ L，用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，比較二者敏感性的差異。1.8特異性試驗雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)，禽流感病毒(AIV H5，AIV H7，AIV H9)，雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)，新城 疫病毒(NDV)，雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒(ARV)和網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)等病毒的RNA，利用建立的熒光定量RT-PCR方法對其進(jìn)行檢測，同時利用建立的熒光定量RT-PCR檢測APV其他3個亞群的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，同時設(shè)陰性和陽性對照。2 結(jié)果2.1熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化A亞群熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系共為20 μ L，含10 μ L2 X QuantiTect ProbeRT-PCR Master Mix，6.75 μ L 水，0.25 μ L Enzyme，0.125 μ L 探針 GA (20ηΜ)，0.1875 μ L上游引物GAF (40ηΜ)，0.1875 μ L下游引物GAR (40nM),陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品2.5 μ L。反應(yīng)條件為:48°C 30min,95°C IOmin ；95°C 15sec,60°C lmin，40 個循環(huán)。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立通過熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了檢測APV A亞群的動力學(xué)曲線(見圖1)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)。標(biāo)準(zhǔn)品濃度從IX IO3 IX IO9個拷貝.μΓ1具有良好的線性關(guān)系(Error均小于0.2, LightCycler480分析軟件計算得到的Error值為用于擬合線性回歸時的單個數(shù)據(jù)點的平均方差，它代表定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以接受的誤差值應(yīng)小于
0.2)。圖1x軸為循環(huán)閾值，y軸為熒光強度。圖2x軸為RNA標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值，y軸為循環(huán)閾值。2.3敏感性試驗熒光定量RT-PCR能檢出的模板最低濃度為IO2個拷貝.μ L_\而常規(guī)RT-PCR能檢出的模板最低濃度為IO4個拷貝.μ Γ1 (見圖3)，表明所建立的熒光定量RT-PCR的敏感性是常規(guī)RT-PCR的100倍。2.4特異性試驗用熒光定量RT-PCR 對 IBV，AIV Η5，AIV Η7，AIV Η9, IBDV, NDV, ARV 和 REV 進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為陰性，這些病毒的擴增曲線均為水平線，未達(dá)到檢出閾值，而RNA標(biāo)準(zhǔn)品(Ga:AY640317.1)，有良好的擴增。用熒光定量RT-PCR對APV的A、B和C亞群的G基因(GenBank登錄號分別為Ga:AY640317.1、Gb:AB548428.1 和 GC:AY590688.1)和 B 亞群病毒 RNA 進(jìn)行檢測，結(jié)果只有 A亞群的為陽性，其他兩個亞群均為陰性(見圖4)。圖4x軸為循環(huán)閾值，y軸為熒光強度。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，對本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于禽肺病毒A亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于包括特異性擴增禽肺病毒A亞群G基因的特異性引物對和探針，其中所述的引物對中兩條引物的核苷酸序列分別如下所示: 上游引物:5’ GGTACATATTGGCTATAGTC3’ 下游引物:5’ CTCCTCCATTGTAGTTTCTGCACTCC3’ 所述的探針序列如下所示:5’ FAM-GTTAGCGTCATAGTTGAACAGTCAGTGTTAG-TAMRA3’。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中還包括反應(yīng)混合液，T7RNA聚合酶以及不含RNase的雙蒸水。
3.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒在制備禽肺病毒A亞群檢測試劑中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒在制備以禽肺病毒G基因為靶點區(qū)分禽肺病毒亞群試劑中的應(yīng)用。`
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于禽肺病毒A亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于包括特異性擴增禽肺病毒A亞群G基因的特異性引物對和探針，其中所述的引物對中兩條引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1、2所示，所述的探針序列如SEQ ID NO.3所示。使用本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)對禽肺病毒A亞群病毒的檢測，本發(fā)明的試劑盒在1×103～1×109個拷貝·μL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，靈敏度達(dá)到102個拷貝·μL-1，是普通RT-PCR方法的100倍，且與其他禽病病毒無交叉反應(yīng)。結(jié)果表明，本發(fā)明的試劑盒具有良好的敏感性和特異性，可用于禽肺病毒A亞群的定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103103290SQ20131001445
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者高玉龍, 王笑梅, 秦立廷, 王永強, 祁小樂, 高宏雷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所