專利名稱：一種山羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種山羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
前體脂肪細(xì)胞是脂肪細(xì)胞的一種，由多能干細(xì)胞(mult1-potential stem cell, MSC)或胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)分化而來(lái),細(xì)胞體積小,呈梭形，間質(zhì)少，胞漿內(nèi)不含脂滴，但具有向胞漿內(nèi)聚集脂滴的能力，在體內(nèi)和體外都可以分裂增殖，并在胞漿內(nèi)聚集脂滴而分化為成熟的脂肪細(xì)胞。目前，培養(yǎng)成功的前體脂肪細(xì)胞主要來(lái)源于人、鼠和豬，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)室也陸續(xù)對(duì)山羊前體脂肪細(xì)胞展開(kāi)了研究，現(xiàn)在所用的培養(yǎng)方法主要有組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法；組織塊培養(yǎng)法需要時(shí)間長(zhǎng)人力多，細(xì)胞大約在1(Γ12 天達(dá)到單層融合；消化培養(yǎng)法較組織塊培養(yǎng)法所需時(shí)間縮短，細(xì)胞生長(zhǎng)融合時(shí)間也需71 天，且細(xì)胞在多次傳代后出現(xiàn)老化，增殖減慢至死亡現(xiàn)象。因此，提供一種簡(jiǎn)單高效，節(jié)省時(shí)間，維持細(xì)胞活力的山羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)方法很有應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，尋求設(shè)計(jì)提供一種簡(jiǎn)單高效，節(jié)省時(shí)間，維持細(xì)胞活力的山羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，對(duì)現(xiàn)有的消化培養(yǎng)方法進(jìn)行改良， 使細(xì)胞消化和原代細(xì)胞貼壁數(shù)目增多；通過(guò)改良培養(yǎng)液的組成，使細(xì)胞衰老死亡現(xiàn)象明顯減弱。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明基于傳統(tǒng)消化培養(yǎng)方法，選取山羊前體肋間脂肪組織， 利用改良過(guò)的膠原酶I培養(yǎng)基處理脂肪組織，采用改良的含胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液對(duì)山羊前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得山羊前體脂肪細(xì)胞；其具體工藝步驟為
(I)、膠原酶I培養(yǎng)基的制備將IOOmg膠原酶1、3g牛血清白蛋白和Iml青鏈霉素溶液(PS)溶解于50mlHBSS溶液中，調(diào)節(jié)其溶液的PH值為7. 2 7. 4，經(jīng)過(guò)O. 22微米過(guò)濾器過(guò)濾和分裝，配制成重量百分比濃度為O. 2%的膠原酶I培養(yǎng)基，在_20°C溫度條件下保存?zhèn)溆茫?br> (2)、細(xì)胞培養(yǎng)液的制備在DMEM低糖培養(yǎng)液中添加其體積15%的胎牛血清、2%的非必需氨基酸(NEAA)、1%L-谷氨酰胺、1%青鏈霉素溶液(PS)和20ng/ml的小鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，經(jīng)O. 22微米過(guò)濾器過(guò)濾和分裝后，配制成細(xì)胞培養(yǎng)液，在4°C溫度條件下保存?zhèn)溆茫?br> (3)、脂肪組織的取樣與前處理將山羊從頸部放血并處死后，在無(wú)菌條件下取出山羊前體肋間脂肪組織，將其迅速放入酒精中浸泡2-10秒，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗后將其移入含重量百分比濃度為1%青鏈霉素溶液(PS)的滅菌PBS緩沖液中并置入無(wú)菌室，用無(wú)菌PBS漂`洗3 5次，并用眼科剪去除脂肪組織中可見(jiàn)的血管和結(jié)締組織，得到脂肪組織樣品；
(4)、山羊前體脂肪細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)用無(wú)菌眼科剪將已處理過(guò)的脂肪組織樣品快速地剪切成O. 5^1mm3小塊，移入15ml離心管中，再加入2_3倍脂肪組織樣品體積的O.2%的膠原酶I培養(yǎng)基混合均勻，在37°C恒溫?fù)u床中消化75-85min，其間每IOmin振蕩I 次，加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化；然后分別用80目、150目和300目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾去除未消化的組織塊及大體積的脂肪細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞培養(yǎng)液移入離心管，在2000r/ min轉(zhuǎn)速條件下離心6-10min ;除去離心后的上清液后加入細(xì)胞培養(yǎng)液清洗I次，在2000r/ min轉(zhuǎn)速條件下離心5min后制成細(xì)胞懸液并在顯微鏡下計(jì)數(shù)，以5X 104cells/mL接種細(xì)胞至60mm培養(yǎng)皿，置入溫度為37°C、飽和濕度、體積比為5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液，實(shí)現(xiàn)山羊前體脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，建立了山羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)的新模型，縮短細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間，獲得的細(xì)胞形態(tài)好，細(xì)胞生長(zhǎng)活力強(qiáng)，可完整的認(rèn)識(shí)脂肪組織產(chǎn)生和增生的全過(guò)程，并可直接觀察各種因素對(duì)過(guò)程的調(diào)控，是研究脂肪分化、脂肪生成、代謝以和肥胖等各種疾病發(fā)生機(jī)理的必備工具；其總體工藝簡(jiǎn)單，原理可靠，培養(yǎng)過(guò)程易控，培養(yǎng)效果好，環(huán)境友好。


圖1為本發(fā)明培養(yǎng)的山羊前體脂肪細(xì)胞示意圖，其中，圖a為培養(yǎng)I天后的山羊前體脂肪細(xì)胞，圖b為培養(yǎng)3天后的山羊前體脂肪細(xì)胞，圖c為培養(yǎng)5天后的山羊前體脂肪細(xì)胞，從圖中可明顯看出所培養(yǎng)的山羊前體脂肪細(xì)胞貼壁數(shù)量大，增殖速度快。
圖2為本發(fā)明培養(yǎng)的山羊前體脂肪細(xì)胞增殖活性曲線圖。
圖3為本發(fā)明培養(yǎng)的山羊前體脂肪細(xì)胞經(jīng)紅油O染色后的脂肪滴示意圖片。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1 :
本實(shí)施例基于傳統(tǒng)消化培養(yǎng)方法，取用山羊肋間脂肪組織，利用改良過(guò)的膠原酶I 培養(yǎng)基處理脂肪組織，采用改良的含胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液對(duì)山羊前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得山羊前體脂肪細(xì)胞；其具體工藝步驟為
(I)、膠原酶I培養(yǎng)基的制備將IOOmg膠原酶1、3g牛血清白蛋白和Iml青鏈霉素溶液(PS)溶解于50mlHBSS溶液中，調(diào)節(jié)PH值至7. 2 7. 4，經(jīng)過(guò)O. 22微米過(guò)濾器過(guò)濾和分裝，配制成重量百分比為O. 2%的膠原酶I培養(yǎng)基，在_20°C溫度條件下保存?zhèn)溆茫?br> (2)、細(xì)胞培養(yǎng)液的制備在DMEM低糖培養(yǎng)液中添加其體積15%的胎牛血清、 2%NEAA、1%L-谷氨酰胺、1%青鏈霉素溶液(PS)和20ng/mlEGF，經(jīng)O. 22微米過(guò)濾器過(guò)濾和分裝后，配制成細(xì)胞培養(yǎng)液，在4°C溫度條件下保存?zhèn)溆茫?br> (3)、脂肪組織的取樣與前處理將山羊頸部放血處死后，在無(wú)菌條件下取出山羊肋間脂肪組織，將其迅速放入酒精中浸泡數(shù)秒，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗后將其移入含重量百分比濃度為1%雙抗的滅菌PBS緩沖液中后帶入無(wú)菌室，用新的無(wú)菌PBS漂洗3 5次， 并用眼 科剪去除脂肪組織中可見(jiàn)的血管和結(jié)締組織，得到脂肪組織樣品；
(4)、山羊前體脂肪細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)用無(wú)菌眼科剪將已處理過(guò)的脂肪組織樣品快速地剪切成O. 5^1mm3小塊，移入15ml離心管中，再加入2_3倍脂肪組織樣品體積的O.2%膠原酶I培養(yǎng)基混合均勻，在37°C恒溫?fù)u床中消化80min，其間每IOmin振蕩I次，加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化；然后用80目、150目和300目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾去除未消化的組織塊及大體積的脂肪細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞培養(yǎng)液移入離心管，在2000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心Smin ;除去離心后的上清液后加入細(xì)胞培養(yǎng)液清洗I次，在2000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心5min后制成細(xì)胞懸液并在顯微鏡下計(jì)數(shù)，以5 X 104cells/mL接種細(xì)胞至60mm培養(yǎng)皿，置入溫度為37°C、飽和濕度、體積比為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液，得到原代培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)山羊前體脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)。
本實(shí)施例經(jīng)膠原酶消化后的原代培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞呈球形懸浮在培養(yǎng)液中，培養(yǎng) 24h后大量細(xì)胞貼壁，形狀為橢圓形、細(xì)長(zhǎng)型或梭形；培養(yǎng)3天貼壁細(xì)胞體積變大，大部分為長(zhǎng)梭形或不規(guī)整三角形，呈現(xiàn)纖維狀結(jié)構(gòu)；之后細(xì)胞增殖迅速，密度明顯變大，至培養(yǎng)五天時(shí)細(xì)胞達(dá)到單層融合。
本實(shí)施例采用CCK法檢測(cè)山羊傳代培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞增殖活性，分別選取Pl代、 PlO代和P20代細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，以1000個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入 200 μ I細(xì)胞培養(yǎng)液后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)重復(fù),每隔2天換液一次,在培養(yǎng)后第2、4、6、8、10和12天分別取一塊培養(yǎng)板加入20 μ ICCK溶液，在37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h后選擇酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm處測(cè)各孔吸光值，利用CCK法繪制山羊前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(如圖2所示)繪制的山羊前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線為S型，符合體外培養(yǎng)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)增殖規(guī)律，40h后進(jìn)入緩慢的潛伏生長(zhǎng)期，4-10天后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期；傳代培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞與原代培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞形態(tài)特征基本一致，細(xì)胞成分更均一，形態(tài)更一致，生長(zhǎng)更旺盛，抗污染能力變強(qiáng)，后期增殖活性高，隨著傳代次數(shù)增多細(xì)胞增殖活性維持不變 。
本實(shí)施例采用油紅O染色法檢測(cè)山羊前體脂肪細(xì)胞的分化，先在DMEM低糖培養(yǎng)液中添加5g/L牛血清白蛋白(BSA)UOygAiL牛胰島素、O. 5mM/L3_異丁基-1-甲基黃嘌呤 (ΙΒΜΧ)、1 μ M地塞米松(DEX)和IM吲哚美辛混合均勻后調(diào)節(jié)PH值至7. 2-7. 4，經(jīng)O. 22微米濾器過(guò)濾和分裝后得到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液4°C條件下保存?zhèn)溆?，山羊前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)后在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)；誘導(dǎo)分化第2天細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)開(kāi)始有小脂滴出現(xiàn)，第6天時(shí)，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)小脂滴明顯增多，有少數(shù)開(kāi)始融合成大脂滴；誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)12天后采用油紅O染色法鑒定脂肪細(xì)胞，除去培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞2次后用重量百分比濃度為10%的多聚甲醛固定15min，再用PBS洗2次，油紅O染色20min后再用PBS洗2次，晾干后用甘油明膠封固觀察拍照，如圖3所示，得到的脂肪滴多。
本實(shí)施例涉及的DMEM低糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素溶液 (PS)、非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰氨、HBSS購(gòu)自HyClone公司；牛血清白蛋白(BSA)、 I型膠原酶、胰島素(INS)，地塞米松(DEX)，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、吲哚美辛 (IDM)、小鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、油紅O購(gòu)自sigma公司；cck_8試劑盒購(gòu)自碧云天公司。
實(shí)施例2
本實(shí)施例在待原代培養(yǎng)的山羊前體脂肪細(xì)胞達(dá)到80°/Γ90%匯合時(shí)，每板細(xì)胞中加入300 μ L胰蛋白酶消化液在37°C消化3min，該胰蛋白酶消化液制備方法如下將O. 25g胰蛋白酶與IOOml的PBS緩沖液相混合配成O. 25%胰蛋白酶消化液；加入與胰蛋白酶消化液相同體積的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，2000r/min離心5min得沉淀，將此沉淀與細(xì)胞培養(yǎng)液按照1:3的體積比進(jìn)行傳代，接種培養(yǎng)于60mm培養(yǎng)皿中，在此培養(yǎng)過(guò)程中每2天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液；上述培養(yǎng)直至細(xì)胞匯合到80°/Γ90%時(shí)并鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，重復(fù)上述消化步驟； 依次向下傳代直至傳代接種培養(yǎng)至第20代。
實(shí)施例3:
本實(shí)施例用油紅O染色法檢測(cè)山羊前體脂肪細(xì)胞分化，在山羊前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)至100%匯合狀態(tài)后更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)；誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液制備方法為在DMEM低糖培養(yǎng)液中添加其體積O. 5 %牛血清白蛋白(BSA)、10%胎牛血清(FBS)、 10μ g/mL牛胰島素(INS)、0. 5mM3_異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、O. 5 μ M地塞米松(DEX) 和O.1mM吲哚美辛(IDM)混勻后調(diào)節(jié)PH值至7. 2-7. 4，經(jīng)O. 22微米濾器過(guò)濾、分裝，4°C保存?zhèn)溆?；誘導(dǎo)第2d細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)開(kāi)始有小脂滴出現(xiàn)，至第6d時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)小脂滴明顯增多，并且有少數(shù)開(kāi)始融合成大脂滴；誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)12d結(jié)束，按油紅O染色法鑒定脂肪細(xì)胞傾去培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞2次，10%多聚甲醛固定15min，PBS洗2次，油紅O染色 20min, PBS洗2次，稍干后以甘油明膠封固觀察拍照；結(jié)果顯示，兩種培養(yǎng)方法的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果基本一致，而改良消化培養(yǎng)法得到的 脂肪滴較多。
權(quán)利要求
1.一種山羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，其特征在于基于傳統(tǒng)消化培養(yǎng)方法，選取山羊前體肋間脂肪組織，利用改良過(guò)的膠原酶I培養(yǎng)基處理脂肪組織，采用改良的含胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液對(duì)山羊前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得山羊前體脂肪細(xì)胞；其具體工藝步驟為(1)、膠原酶I培養(yǎng)基的制備將IOOmg膠原酶1、3g牛血清白蛋白和Iml青鏈霉素溶液溶解于50mlHBSS溶液中，調(diào)節(jié)其溶液的PH值為7. 2 7. 4，經(jīng)過(guò)O. 22微米過(guò)濾器過(guò)濾和分裝，配制成重量百分比濃度為O. 2%的膠原酶I培養(yǎng)基，在_20°C溫度條件下保存?zhèn)溆茫?2)、細(xì)胞培養(yǎng)液的制備在DMEM低糖培養(yǎng)液中添加其體積15%的胎牛血清、2%的非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%青鏈霉素溶液和20ng/ml的小鼠表皮生長(zhǎng)因子，經(jīng)O. 22微米過(guò)濾器過(guò)濾和分裝后，配制成細(xì)胞培養(yǎng)液，在4°C溫度條件下保存?zhèn)溆茫?3)、脂肪組織的取樣與前處理將山羊從頸部放血并處死后，在無(wú)菌條件下取出山羊前體肋間脂肪組織，將其迅速放入酒精中浸泡2-10秒，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗后將其移入含重量百分比濃度為1%青鏈霉素溶液的滅菌PBS緩沖液中并置入無(wú)菌室，用無(wú)菌PBS漂洗3 5次，并用眼科剪去除脂肪組織中可見(jiàn)的血管和結(jié)締組織，得到脂肪組織樣品；(4)、山羊前體脂肪細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)用無(wú)菌眼科剪將已處理過(guò)的脂肪組織樣品快速地剪切成O. 5 Imm3小塊，移入15ml離心管中，再加入2_3倍脂肪組織樣品體積的O. 2% 的膠原酶I培養(yǎng)基混合均勻，在37°C恒溫?fù)u床中消化75-85min，其間每IOmin振蕩I次， 加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化；然后分別用80目、150目和300目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾去除未消化的組織塊及大體積的脂肪細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞培養(yǎng)液移入離心管，在2000r/min 轉(zhuǎn)速條件下離心6-10min ;除去離心后的上清液后加入細(xì)胞培養(yǎng)液清洗I次，在2000r/min 轉(zhuǎn)速條件下離心5min后制成細(xì)胞懸液并在顯微鏡下計(jì)數(shù)，以5X 104cells/mL接種細(xì)胞至 60mm培養(yǎng)皿，置入溫度為37°C、飽和濕度、體積比為5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液，實(shí)現(xiàn)山羊前體脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種山羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，先配制膠原酶I培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)液，將山羊處死后取出山羊前體肋間脂肪組織，將其迅速放入酒精中浸泡，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗后將其移入滅菌PBS緩沖液中并置入無(wú)菌室用無(wú)菌PBS漂洗，再用眼科剪去除血管和結(jié)締組織，得到脂肪組織樣品后快速地剪切成小塊移入離心管中，再加入膠原酶I培養(yǎng)基混合均勻后消化；然后用細(xì)胞篩過(guò)濾去除未消化的組織塊及脂肪細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞培養(yǎng)液移入離心管離心后除去上清液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液清洗并離心后制成細(xì)胞懸液，最后接種細(xì)胞至培養(yǎng)皿，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；其總體工藝簡(jiǎn)單，原理可靠，培養(yǎng)過(guò)程易控，培養(yǎng)效果好，環(huán)境友好。
文檔編號(hào)C12N5/077GK103060268SQ201310018339
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者曲貞曉, 潘慶杰, 沈偉, 閔令江, 孫小鳳, 張敏, 姜穎 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)