茄屬物種鑒定基因、引物及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提出以核基因waxy為主要基因序列，輔以其他葉綠體基因序列如trnS-trnG，ndhF等，用于茄屬植物物種鑒定，并提供了核基因waxy的序列合成引物，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了進(jìn)境檢疫性4種茄屬雜草及其他茄屬外來雜草的檢測方法。本發(fā)明特異性好，檢測方法快速簡單，準(zhǔn)確性高，靈敏度高，為檢測茄屬物種提供方法，也為防范外來生物提供了保證。
【專利說明】茄屬物種鑒定基因、引物及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說涉及茄屬物種分子鑒定基因序列及其PCR引物和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]茄屬全世界有1400余種，大多起源于南美，分布廣，適應(yīng)性強(qiáng)，部分入侵性雜草危害性大，其中有4種已被列我國列為進(jìn)境檢疫性雜草，另外有30余種具有潛在危害性。然而該類群形態(tài)變異復(fù)雜，物種鑒定極其困難，特別對于外來種的鑒定，問題尤為突出。
[0003]DNA條形碼技術(shù)可以克服因物種缺乏足夠的性狀信息和表型可塑性等因素影響物種準(zhǔn)確鑒定的問題，因此該技術(shù)已經(jīng)成為物種鑒定最具前景的發(fā)展方向。目前在動(dòng)物鑒定領(lǐng)域一段線粒體COI序列已經(jīng)成為公認(rèn)的通用序列應(yīng)用于實(shí)際鑒定。然而，在陸生植物中至今還沒有找到可作為通用DNA的分辨力強(qiáng)的可作為條形碼的基因序列。主要原因是植物線粒體基因組進(jìn)化速率慢、遺傳變異小，因此線粒體COI序列并不適合于植物；此外，在植物進(jìn)化歷程中的雜交、網(wǎng)狀進(jìn)化以及同一基因在不同類群中進(jìn)化速率的異質(zhì)性使植物條形碼的研究比動(dòng)物要復(fù)雜的多。近年來，各國諸多學(xué)者提出了眾多植物DNA條形碼的候選序列及其組合，例如葉綠體基因rbcL+matK組合以及核基因ITS被提議作為陸生植物的核心條形碼，但它們僅能解決較高階元(科、屬)的鑒定問題，在物種水平分辨率較差，如單個(gè)rbcL和matK只能區(qū)別不到50%的物種，其組合的分辨力也不足70%。因此目前研究成果的鑒定通用性不理想，都沒有達(dá)到應(yīng)用條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種PCR擴(kuò)增引物，其一對核苷酸序列為:
[0005]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ；
[0006]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提出了一種上述核基因waxy在茄屬植物物種鑒定中的用途。
[0008]如上所述的用途中，利用核基因waxy與葉綠體基因組中ndhF基因和trnS_trnG基因組合進(jìn)行茄屬雜交種的鑒定和父母本來源的鑒定。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提出了一種茄屬物種的檢測方法，包括:1.提取樣品總DNA ；i1.利用權(quán)利I所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；ii1.擴(kuò)增得到權(quán)利要求2所述核基因waxy序列；iv.經(jīng)測序分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；v.根據(jù)樣品在系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置及聚合、分離狀況判定結(jié)果；以及v1.當(dāng)被鑒定樣品為雜交種時(shí)，利用上述基因組合共同分析判定結(jié)果。
[0010]本發(fā)明所述基因，其種間變異大于種內(nèi)變異，可有效檢測茄屬所有物種；其“引物”擴(kuò)增效果好，檢測方法快速簡單，為防范外來生物提供了技術(shù)保證。
【專利附圖】

【附圖說明】[0011]圖1是本發(fā)明利用waxy序列構(gòu)建的茄屬系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0012]圖2是本發(fā)明利用waxy序列、ndhF基因和trnS-trnG基因共同構(gòu)建的爺屬系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0013]圖3是利用本發(fā)明鑒定茄屬物種銀毛龍葵時(shí)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0014]圖4是銀毛龍葵與它三種近緣種的遺傳距離間隔柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面實(shí)施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0016]本發(fā)明提出了一種植物核基因waxy作為茄屬物種鑒定的通用DNA序列，并由此設(shè)計(jì)了該基因的檢測引物，并進(jìn)一步提出了茄屬物種的檢測方法，有效解決了茄屬物種的鑒定問題，可應(yīng)用推廣。
[0017]針對設(shè)計(jì)引物。所述的引物由一對正向和反向引物組成，其核苷酸序列分別為正向引物WAXYS和反向引物WAXYA2:
[0018]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ；
[0019]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'
[0020]本發(fā)明關(guān)于茄屬物種的檢測方法，包括:以樣品總DNA為模板，利用waxy序列的檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)樣品在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚合、間隔狀況判定結(jié)果。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，提出了一種PCR擴(kuò)增引物，其一對核苷酸序列為:
[0022]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG T TG ATCG-3'；
[0023]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提出了一種上述核基因waxy在茄屬植物物種鑒定中的用途。可選地，在如上所述的用途中，利用核基因waxy與葉綠體基因組中ndhF基因和trnS-trnG基因組合進(jìn)行爺屬雜交種的鑒定和父母本來源的鑒定。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提出了一種茄屬物種的檢測方法，包括:1.提取樣品總DNA;i1.利用權(quán)利I所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；ii1.擴(kuò)增得到權(quán)利要求2所述核基因waxy序列；iv.經(jīng)測序分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；v.根據(jù)樣品在系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置及聚合、分離狀況判定結(jié)果；以及v1.當(dāng)被鑒定樣品為雜交種時(shí)，利用上述基因組合共同分析判定結(jié)
果O
[0026]以下根據(jù)不同的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案詳細(xì)說明。
[0027]理想的物種鑒定通用DNA序列應(yīng)該種間遺傳變異大于種內(nèi)變異，且自身短小，便于擴(kuò)增和測序。本發(fā)明根據(jù)上述原則確定核基因waxy序列為茄屬物種鑒定的主鑒定序列。
[0028]圖1是利用本發(fā)明確定的waxy序列構(gòu)建的爺屬系統(tǒng)發(fā)育樹。雖然爺屬物種上千種，本示例覆蓋了茄屬9大支系的48個(gè)種類，且其中部分種類存在若干重復(fù)，可以合理預(yù)見其分辨結(jié)果對于茄屬物種具有很好的鑒定能力。從圖1可以看出，包括4種檢疫性外來物種在內(nèi)的68個(gè)樣品得以成功區(qū)分鑒定，重復(fù)樣品成功聚合在一起，而親緣種之間存在明顯的遺傳距離，即waxy序列在茄屬種間變異大于種內(nèi)變異，達(dá)到通用檢測序列的理想要求。
[0029]當(dāng)發(fā)生種間雜交等特殊情況時(shí)，樣品僅通過waxy序列系統(tǒng)發(fā)育樹不能得到準(zhǔn)確鑒定。如圖1中有3個(gè)樣品與認(rèn)為屬于相同物種的樣品在系統(tǒng)發(fā)育樹上沒有發(fā)生聚合，而是產(chǎn)生間隔，這時(shí)需輔以葉綠體trnS-trnG和ndhF基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹共同分析。圖2中右邊是利用本發(fā)明構(gòu)建的waxy序列系統(tǒng)發(fā)育樹,左邊是構(gòu)建的葉綠體trnS-trnG和ndhF系統(tǒng)發(fā)育樹。由于葉綠體基因母系遺傳、核基因雙親遺傳，因此構(gòu)建的2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹可對茄屬雜交物種及其父母本來源進(jìn)行鑒定。圖1中未能得到準(zhǔn)確鑒定的3個(gè)樣品通過在圖2中的位置分析可知S.macrocarpon7是一個(gè)母本為S.macrocarpon父本為S.rostratum的雜交種；名為S.virginanum的兩個(gè)樣品均不是雜交種，至少其中之一為錯(cuò)誤鑒定樣品。
[0030]本發(fā)明還進(jìn)一步針對waxy序列設(shè)計(jì)引物。所述的引物由一對正向和反向引物組成，其核苷酸序列分別為正向引物WAXYS和反向引物WAXYA2:
[0031]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ；
[0032]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3' [0033]實(shí)施例
[0034]檢疫性雜草銀毛龍葵的鑒定
[0035]爺屬分子系統(tǒng)學(xué)研究表明銀毛龍葵屬于爺亞屬分支(Leptostemonum),該分支有350-450種，在進(jìn)化關(guān)系樹上分屬于10個(gè)亞支，銀毛龍葵屬于銀毛龍葵亞支(Elaeagnifolium Clade)。本發(fā)明收集了 5個(gè)銀毛龍葵不同來源個(gè)體及其多個(gè)近緣種,共16種26份樣品，這些樣品覆蓋了茄亞屬10亞支中的9支(表1)。樣品來自口岸截獲、口岸周邊監(jiān)測、與國外標(biāo)本館交換或從國外種子公司購買。
[0036]表1.實(shí)驗(yàn)材料
【權(quán)利要求】
1.一種PCR擴(kuò)增引物，其一對核苷酸序列為:
WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ； WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'。
2.核基因raxy在茄屬植物物種鑒定中的用途。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，利用核基因raxy與葉綠體基因組中ndhF基因和trnS-trnG基因組合進(jìn)行茄屬雜交種的鑒定和父母本來源的鑒定。
4.一種爺屬物種的檢測方法，其特征在于: i.提取樣品總DNA ； ii.利用權(quán)利I所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； ii1.擴(kuò)增得到權(quán)利要求2所述核基因waxy序列； iv.經(jīng)測序分析構(gòu)建系統(tǒng) 發(fā)育樹； V.根據(jù)樣品在系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置及聚合、分離狀況判定結(jié)果； v1.當(dāng)被鑒定樣品為雜交種時(shí)，利用權(quán)利要求3所述基因組合共同分析判定結(jié)果。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937784SQ201310018341
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月18日
【發(fā)明者】范曉虹, 張偉, 邵秀玲 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院