專利名稱：一種利于杜鵑花屬植物生長發(fā)育和菌根形成的菌液制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物生長發(fā)育菌液，即一種利于杜鵑花屬植物生長發(fā)育和菌根形成的菌液制備方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，杜鵑是世界著名觀賞植物，也是我國十大傳統(tǒng)名花之一。我國杜鵑花資源十分豐富，是杜鵑花的重要資源和地理分布中心。但國內(nèi)外對野生杜鵑花的引種、人工繁育、栽培和育種等研究開展緩慢，究其原因，大多因杜鵑花人工繁殖、栽培和生長發(fā)育等環(huán)節(jié)存在較大難點，特別是野生高山杜鵑尤為明顯。長白山杜鵑花屬植物包括牛皮杜鵑 {Rhododendron chrysanthum PalI·)、短果杜匿$ {Rhododendron brachycarpum D. Don)、 照白杜匿$ {Rhododendron micranthum Turcz.)、小葉杜匿$ {Rhododendron parvifolium Adams.)、大字杜醇{Rhododendron schlippenbachii Maxim.)、興安杜醇{Rhododendron dauricum L.)、迎紅杜匿$ {Rhododendron mucronulaturn Turcz.)、毛|￡杜匿$ {Rhododendron confertissimum Nakai)和 口十杜匿$ {Rhododendron redowskianum Maxim.)等共有 9 個種，均為吉林省重點保護(hù)植物。
杜鵑花類菌根是真菌和杜鵑花屬植物之間形成的一種共生體，它具有促進(jìn)杜鵑花對營養(yǎng)元素的吸收、改良根際土壤，增強植物的長勢、移栽成活率、抗旱和抗病力等作用。國內(nèi)杜鵑花菌根真菌研究處于起步階段，相關(guān)報道較少，大多處于基礎(chǔ)研究階段，一直未進(jìn)入應(yīng)用領(lǐng)域。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述不足而提供一種利于杜鵑花屬植物生長發(fā)育和菌根形成的菌液制備方法，該菌液用于浸泡杜鵑花種子、浸泡組培苗根、浸泡移栽的杜鵑花根部。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種利于杜鵑花屬植物生長發(fā)育和菌根形成的菌液制備方法，其步驟如下(I)材料與處理采集杜鵑花屬植物的成熟須根，消毒，切成根段備用。
(2)培養(yǎng)基和配置1000 mL 培養(yǎng)基的含量為KH2P04380 mg，MgS04 ·7Η20149 mg，維生素 C26 mg，泛酸鈣 67 11^，煙酸1.4 11^，蛋白胨3.0 g，葡萄糖16. 5 g，瓊脂粉8. 5 g，1. 5%脫氧膽酸鈉溶液4 mL和O.05 mg 口引哚乙酸。
(3)母液制備將步驟(I)中的根段切段后接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基表面，置于25±2 °C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
待菌絲從根上發(fā) 出，挑取橫切面真菌菌絲，轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基(步驟(2)中培養(yǎng)基)上繼續(xù)培養(yǎng)，純化，純化后的菌株接種到試管內(nèi)的斜面培養(yǎng)基上，置于3 5 °C的低溫設(shè)備中保存。
液體菌種母液的培養(yǎng)是將步驟(2)中培養(yǎng)基中的瓊脂去掉后配置的液體培養(yǎng)基， 6Phialocephala fortinii, PeziziIla ericace, Oidiodendron maius,Meliniomyces variabilis, Cryptosporiopsis ercae, Acaulospora lacunosa 分另lj在試管內(nèi)培養(yǎng)至菌絲長滿斜面后，分別取含有菌絲的瓊脂塊放入裝有液體培養(yǎng)基的三角錐形瓶中，錫紙封住瓶口后置于恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)15 20 d，收集500 mL培養(yǎng)液并以無菌水定容至1000 mL，并分裝于500 mL的茶色容器中用錫紙封口后搖均，置于溫度為25±2 °〇條件下保存7 10 d，期間每天搖動I 2次，每次20 30 min,即成液體菌種母液。
(4)菌液制備生產(chǎn)用菌液配置方法是液體菌種母液500 mL，紅糖500 g溶解后，加水至50 L發(fā)酵 7 10 d，聞到香味后即可使用。
本發(fā)明的優(yōu)點是1、本發(fā)明選取我國長白山區(qū)杜鵑花屬9個品種杜鵑花的根系進(jìn)行了菌根真菌的分離、純化、初步鑒定，并完成了液體母種和生產(chǎn)用菌液的制備，為長白山杜鵑花屬和國內(nèi)外其它種杜鵑的引種、人工繁育、栽培和育種等生產(chǎn)應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供技術(shù)方法，同時，可促進(jìn)杜鵑花的高效生產(chǎn)和推廣應(yīng)用?？捎迷摼航荻霹N花種子48 h， 散播于已用菌液灌透的基質(zhì)(基質(zhì)為腐殖土和蛭石，比例為3:1)中覆蓋腐熟松針保濕，18 d 可萌發(fā)，萌發(fā)率為92. 1%，移栽成活率90. 0%以上。杜鵑花組培苗出瓶后，用菌液浸泡組培苗根18 24 h后，將組培苗植于已用菌液灌透的基質(zhì)(基質(zhì)為腐殖土、腐熟松針和蛭石，比例為3:2:1)中，覆蓋透光性好的塑料薄膜保溫保濕(煉苗)?？商岣叱苫盥手?9. 5%以上。杜鵑花移栽時，可將杜鵑花粗根剪掉2/3，再用菌液浸泡12 18 h，可提高成活率至93. 9%以上。
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
具體實施方式
一種利于杜鵑花 屬植物生長發(fā)育和菌根形成的菌液制備方法，其步驟如下I材料與處理于長白山區(qū)采集牛皮杜胃$ {Rhododendron chrysan thum Pall.)、短果杜匿$ {Rhododendron brachycarpum D. Don)、照白杜匿$ (TPAotZoofeWro/ micranthum Turcz·)、小葉杜匿烏{Rhododendron parvi folium Adams.)、大字杜匿 $ {Rhododendron schlippenbachi i Maxim.)、興安杜匿 $ {Rhododendron dauricum L.)、迎紅杜匿 $ {Rhododendron mucronula turn Turcz.)、毛租杜胃$ {Rhododendron confer ti ssimum Nakai)和荀葉杜胃$ {Rhododendron redowskianum Maxim.)等9個種的杜醇花纖細(xì)根。破土后剪取近粗根處生長健壯直徑為1.O mm以下的成熟須根，用軟毛刷輕輕洗去泥土，流水沖洗過夜后剪成3 4 cm。在超凈工作臺下，用70%酒精(其中含有5%鏈霉素)消毒20 S，再用質(zhì)量濃度為0. 5%的次氯酸鈉溶液消毒8 min,無菌水沖洗8次，無菌濾紙吸干根表面水分，切除被殺毒滅菌劑損傷部分后并切成約2. O 3. O cm左右的根段備用。
2 方法2.1培養(yǎng)基和配置培養(yǎng)基成分及含量(1000 mL培養(yǎng)基的含量)為KH2P04380 mg，MgSO4 · 7H20149 mg，維生素C26 mg,泛酸|丐67 11^,煙酸1.4 mg,蛋白胨3. O g,葡萄糖16.5 g，瓊脂粉8. 5 g。
將以上組分混合均勻并溶化后分裝于培養(yǎng)皿中，121°C濕熱滅菌20 25 min取出，待溶液未凝固前，通過過濾滅菌每個培養(yǎng)皿中加入1. 5%脫氧膽酸鈉溶液4 mL和O. 05 mg吲哚乙酸。
2.2真菌的分離、純化、初步鑒定、保存、母液和菌液制備將步驟I中處理的根段切成O. 5 Cm (切口面要盡可能大)后接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基表面，每皿接3段，共10皿，置于(25±2) °〇的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
待菌絲從根上發(fā)出，挑取橫切面真菌菌絲，轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基(步驟2.1中的培養(yǎng)基)上繼續(xù)培養(yǎng)，每轉(zhuǎn)接培養(yǎng)I次都需顯微鏡下觀察菌株純度，直至獲得純化菌株(形態(tài)一致)。純化后的菌株接種到試管內(nèi)的斜面培養(yǎng)基上，至于3 5 °C的低溫設(shè)備中保存。
采用形態(tài)學(xué)方法對純化的菌種進(jìn)行初步鑒定，將菌株接種于培養(yǎng)基中，至于 (25 ±2) °C條件下培養(yǎng)。并記錄菌株生長速度，觀察菌落特征。
液體母種的培養(yǎng)是將步驟2.1中培養(yǎng)基中的瓊脂去掉后配置的液體培養(yǎng)基，分裝到250 mL三角錐形瓶中(每瓶50 75 mL)，將純化的多個菌種分別在試管內(nèi)培養(yǎng)至菌絲長滿斜面后，分別取1. O cm大小的含有菌絲的瓊脂塊放入裝有液體培養(yǎng)基的三角錐形瓶中 (每種各放I塊)，用適當(dāng)尺寸的錫紙封住瓶口后置于恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)15 20 d，收集 500 mL培養(yǎng)液并以無菌水定容至1000 mL,并分裝于500 mL的茶色容器中用錫紙封口后搖均，置于溫度為(25±2) °C條件下保存7 IOd (期間每天搖動I 2次，每次20 30 min)即成液體菌種母液。液體菌種母液防止于陰涼干燥處保存即可。
生產(chǎn)用菌液配置方法是液體菌種母液500 mL,紅糖500 g溶解后，加水至50 L發(fā)酵7 10 d，聞到香味后即可使用(期間用干凈的木棒每天攪拌2次)。
結(jié)果3.1菌根真菌的分離、純化和初步鑒定杜鵑花類菌根真菌生長及其緩慢，需要培養(yǎng)20 30天，生長稍快的菌落直徑達(dá)5 7 cm,生長較慢的僅O. 5 2. 5 cm。
通過對9種野生杜鵑花科植物根部菌根真菌的分離培養(yǎng)、純化和初步鑒定，共分離獲得根內(nèi)生真菌70余株，每種杜鵑花分離獲得的真菌菌落形態(tài)上可以大致分為3 8種以上。
利用形態(tài)學(xué)方法鑒定得到9種杜鵑的6種杜鵑花類菌根真菌的優(yōu)勢種，分別為 Phialocephala fort ini i, Pezizilla ericace，Oidiodendron maius，Meliniomyces variabiHs, Cryptosporiopsis ercae，Acaulospora lacunosa。
3.2純化后的菌根真菌母液和菌液制備根據(jù)步驟2. 2中方法 ，將含有6個菌種菌絲的瓊脂塊放入裝有液體培養(yǎng)基的三角錐形瓶中進(jìn)行混合培養(yǎng)，得到液體菌種母液。
生產(chǎn)用菌液配置方法是液體菌種母液500 mL,紅糖500 g溶解后，加水至50 L發(fā)酵7 10 d，聞到香味后即可使用。
3.3純化后的菌根真菌、母液和菌液保存純化后的菌株接種到試管內(nèi)的斜面培養(yǎng)基上，至于3 5 °C的低溫設(shè)備中保存。液體菌種母液防止于陰涼干燥處保存即可。
3.4純化后的菌根真菌菌液的應(yīng)用范圍及方法應(yīng)用以上真菌回接試驗和菌液侵染春鵑、夏鵑、烈香杜鵑、鹿角杜鵑、羊躑躅、細(xì)葉杜香、篤斯越桔、各種盆栽杜鵑和高山杜鵑等120余種均不同程度或至少I種真菌于不同種杜鵑花形成菌根結(jié)構(gòu)，但存在菌根形成快慢差異。
方法一可用菌液浸泡杜鵑花種子48 h，散播于已用菌液灌透的基質(zhì)(基質(zhì)為腐殖土和蛭石，比例為3:1)中覆蓋腐熟松針保濕，18 d可萌發(fā)，萌發(fā)率為92. 1%，移栽成活率 90. 0%以上。
方法二 杜鵑花組培苗出瓶后，用菌液浸泡組培苗根18 24 h后，將組培苗植于已用菌液灌透的基質(zhì)(基質(zhì)為腐殖土、腐熟松針和蛭石，比例為3:2:1)中，覆蓋透光性好的塑料薄膜保溫保濕(煉苗)?？商岣叱苫盥手?9. 5%以上。
方法三杜鵑花移栽 時，可將杜鵑花粗根剪掉2/3，再用菌液浸泡12 18 h，可提高成活率至93. 9%以上。
權(quán)利要求
1.一種利于杜鵑花屬植物生長發(fā)育和菌根形成的菌液制備方法，其特征在于步驟如下(1)材料與處理采集杜鵑花屬植物的成熟須根，消毒，切成根段備用；(2)培養(yǎng)基和配置·1000 mL 培養(yǎng)基的含量為KH2P04380 mg，MgS04 ·7Η20149 mg，維生素 C26 mg，泛酸鈣 67 11^，煙酸1.4 11^，蛋白胨3.0 g，葡萄糖16. 5 g，瓊脂粉8. 5 g，1. 5%脫氧膽酸鈉溶液4 mL和·O.05 mg卩引哚乙酸；(3)母液制備將步驟(I)中的根段切段后接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基表面，置于25±2 °C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待菌絲從根上發(fā)出，挑取橫切面真菌菌絲，轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，純化，純化后的菌株接種到試管內(nèi)的斜面培養(yǎng)基上，置于3 5 °C的低溫設(shè)備中保存；液體菌種母液的培養(yǎng)是將步驟(2)中培養(yǎng)基中的瓊脂去掉后配置的液體培養(yǎng)基，將 6 yIvIifft Phialocephala for tin i i, Pezi zi Ila ericace, Oidiodendron maius, Meliniomyces variabilis, Cryptosporiopsis ercae, Acaulospora /acwfliosa 分另lj在試管內(nèi)培養(yǎng)至菌絲長滿斜面后，分別取含有菌絲的瓊脂塊放入裝有液體培養(yǎng)基的三角錐形瓶中，錫紙封住瓶口后置于恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)15 20 d，收集500 mL培養(yǎng)液并以無菌水定容至1000 mL，并分裝于500 mL的茶色容器中用錫紙封口后搖均，置于溫度為25±2 °〇條件下保存7 10 d，期間每天搖動I 2次，每次20 30 min,即成液體菌種母液；(4)菌液制備生產(chǎn)用菌液配置方法是液體菌種母液500 mL，紅糖500 g溶解后，加水至50 L發(fā)酵 7 10 d，聞到香味后即可使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物生長發(fā)育菌液，即一種利于杜鵑花屬植物生長發(fā)育和菌根形成的菌液制備方法。其步驟如下(1)材料與處理采集杜鵑花屬植物的成熟須根，消毒，切成根段備用。(2)培養(yǎng)基和配置1000mL培養(yǎng)基的含量為KH2PO4380mg，MgSO4·7H2O149mg，維生素C26mg，泛酸鈣67mg，煙酸1.4mg，蛋白胨3.0g，葡萄糖16.5g，瓊脂粉8.5g，1.5%脫氧膽酸鈉溶液4mL和0.05mg吲哚乙酸。(3)母液制備。(4)菌液制備。為長白山杜鵑花屬和國內(nèi)外其它種杜鵑的引種、人工繁育、栽培和育種等生產(chǎn)應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供技術(shù)方法。
文檔編號C12N1/14GK103060207SQ20131001895
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者顧地周, 顧川岳, 朱俊義, 姜云天, 陸爽, 潘雨, 禚玲玲, 張學(xué)士, 王秋爽, 付航 申請人:通化師范學(xué)院