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青?;【鷔67b及其分離篩選和應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):422806閱讀:326來源:國(guó)知局
專利名稱:青?;【鷔67b及其分離篩選和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及青?;【鶴67B及其分離篩選和應(yīng)用,屬微生物學(xué)的發(fā)光細(xì)菌分離篩選和應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。青海弧菌Q67B是淡水發(fā)光菌。從青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚體表采集淡水發(fā)光菌,經(jīng)分離、純化、篩選后,得到一種新的淡水發(fā)光菌種菌株,16SrDNA序列分析表明,該菌屬弧菌屬,定名為“青海弧菌Q67B”。2010年I月28日將其送交武漢市中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2010104。
背景技術(shù)
發(fā)光菌是一大類能自身發(fā)出熒光的細(xì)菌,在條件合適時(shí),其發(fā)光恒定。若發(fā)光菌接觸到有毒有害物質(zhì)時(shí),其發(fā)光就會(huì)受抑制,抑制程度與所接觸的毒物的毒性大小和毒物的濃度有關(guān)。因此發(fā)光菌可用于檢測(cè)樣品的生物學(xué)毒性。上世紀(jì)八十年代,發(fā)光菌就己被用于環(huán)境污染的檢測(cè)。我國(guó)也于1995年發(fā)布了將發(fā)光菌用于水環(huán)境污染的毒性檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。但不管國(guó)際還是國(guó)內(nèi),均使用來源于海洋的海洋發(fā)光菌,該發(fā)光菌適應(yīng)海洋的高鹽度(相當(dāng)于NaCl的質(zhì)量百分濃度為3%)和高滲透壓的環(huán)境條件,否則無法生長(zhǎng),更不會(huì)發(fā)光。當(dāng)用于陸地淡水樣品時(shí),必須在淡水樣品中添加NaCl,直至淡水樣品中NaCl的最終質(zhì)量百分濃度為3%,否則淡水樣品中的海洋發(fā)光菌很快就喪失發(fā)光能力,甚至細(xì)菌的細(xì)胞因低滲透壓而吸水破裂,無法繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)。上世紀(jì)九十年代,隨著發(fā)光菌應(yīng)用于環(huán)境污染的毒性檢測(cè)日益增多,許多研究者發(fā)現(xiàn),對(duì)有些種類的淡水樣品,其檢測(cè)結(jié)果往往與其它生物檢測(cè)結(jié)果不太吻合,尤其是那些含有重金屬鹽的樣品。究其原因,乃對(duì)淡水樣品添加NaCl所致。所以有研究者改用葡萄糖取代NaCl來調(diào)節(jié)滲透壓,使之與質(zhì)量百分濃度為3%的NaCl溶液等滲,但效果并不理想,檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性較差。這是因?yàn)楹Q蟀l(fā)光菌必需要有一定濃度的Na離子存在時(shí)才能保持良好而穩(wěn)定的發(fā)光性能,缺乏Na離子的環(huán)境對(duì)海洋發(fā)光菌的發(fā)光是不利的,必然影響到海洋發(fā)光菌發(fā)光的穩(wěn)定性,最終導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的嚴(yán)重偏差。如果使用不需要Na離子并適應(yīng)較低的滲透壓就能正常發(fā)光的淡水發(fā)光菌作為檢測(cè)用發(fā)光細(xì)菌,對(duì)淡水樣品就不必添加NaCl, 避免了應(yīng)用海洋發(fā)光菌作為檢測(cè)用發(fā)光細(xì)菌的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是公開一種青?;【鶴67B,其特征在于,(I)形態(tài)特征該菌的菌體呈桿狀微彎,大小介于O. 5 O. 7微米X1. 5 2微米,革蘭氏染色陰性,用利夫生鞭毛染色,觀察到單極生鞭毛似蝌蚪狀,細(xì)胞內(nèi)累積聚β_羥基丁酸;(2)生理生化特征該菌適于生長(zhǎng)的溫度范圍和pH范圍分別為4°C 40°C和PH5 pHIO,對(duì)弧菌抑制劑2,4- 二氨基-6,7- 二異丙基喋啶敏感,具有耐鹽、耐高滲透壓和低滲透壓的能力,能在介于質(zhì)量百分濃度0% 8%之間的NaCl溶液中生長(zhǎng)和發(fā)光;(3)基因特征16SrDNA序列AGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGG
TGGTGTTGTTAATAGCAGCATCATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT
AATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTGGATTAAGTCAGATGTGAA
AGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACTGGTTCACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTG
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CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTGGTTAGTTTAACCGCACT
TTCTTCGGAGAGAGTGGAGGACGATCACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC。所述的青?;【鶴67B的進(jìn)一步特征在于,該菌最適于生長(zhǎng)的溫度和pH值分別為25。。和 pH9. O。本發(fā)明的另一個(gè)目的是推出一種分離篩選青?;【鶴67B的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案,其特征在于,該菌經(jīng)過四個(gè)步驟,篩選得到第一步獲取淡水發(fā)光菌,從青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚體表采集到的發(fā)光菌,經(jīng)分離純化,獲得淡水發(fā)光菌;第二步溫度適應(yīng)性篩選,在兩個(gè)不同的溫度下對(duì)第一步獲得的淡水發(fā)光菌進(jìn)行溫度適應(yīng)性篩選;第三步PH值適應(yīng)性篩選,在兩個(gè)不同的pH值下對(duì)第二步獲得的淡水發(fā)光菌進(jìn)行PH值適應(yīng)性篩選;第四步毒物反應(yīng)靈敏性篩選,用重金屬鹽和有機(jī)毒物對(duì)第三步獲得的淡水發(fā)光菌先后進(jìn)行兩次毒物反應(yīng)靈敏性篩選。所述的分離篩選青海弧菌Q67B的方法的進(jìn)一步特征在于,所述的兩個(gè)不同的溫度是4°C和40。。。所述的分離篩選青?;【鶴67B的方法的進(jìn)一步特征在于,所述的兩個(gè)不同的pH值是 pH5. O 和 pHll. O。所述的分離篩選青?;【鶴67B的方法的進(jìn)一步特征在于,所述的重金屬鹽和有機(jī)毒物分別是HgCl2和苯酚。青?;【鶴67B具有寬的生長(zhǎng)和發(fā)光的溫度范圍4°C 40°C ;具有寬的生長(zhǎng)和發(fā)光的pH值范圍pH5. O pHll. O ;具有耐鹽、耐高滲透壓和低滲透壓的能力,能在介于質(zhì)量百分濃度0% 8%之間的NaCl溶液中生長(zhǎng)和發(fā)光;對(duì)毒物的毒性反應(yīng)靈敏,特別適合用于陸地淡水樣品或固體樣品的水相抽提物的生物毒性快速檢測(cè)和淡水樣品的生物毒性快速篩選?,F(xiàn)結(jié)合附圖
詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。一種分離篩選青?;【鶴67B的方法,其特征在于,具體操作步驟第一步獲取淡水發(fā)光菌 (I)取新鮮的青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚,截成小段,室溫下放置10小時(shí) 24小時(shí),在暗室內(nèi)檢視,在發(fā)綠色熒光的亮點(diǎn)處,用滅菌的接種針括取,劃線于培養(yǎng)皿內(nèi),(2)將第一步(I)所述的培養(yǎng)皿置于暗室中,20°C培養(yǎng)10小時(shí) 18小時(shí),從中挑取發(fā)光良好的單菌落,(3)對(duì)第一步(2)所述的單菌落進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)三 五次,取得單細(xì)胞純培養(yǎng)物,轉(zhuǎn)接于斜面試管,培養(yǎng)生長(zhǎng)后得斜面菌種,即淡水發(fā)光菌,保存于4°C冰箱備用,(4)所述的培養(yǎng)皿和斜面試管內(nèi)需用固體培養(yǎng)基,該固體培養(yǎng)基的配方為,MgSO4
2.47g, MgCO3 O. 79g, MgBr2 O. 09g, MgCl2O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0. 122g, NaCl 8. 29g,Mg(HCO3)2 0. 50g,酵母膏5g,胰胨5g,甘油3g,瓊脂20g,溶于IOOOmL蒸餾水中,ρΗ9· 0,121°C滅菌20分鐘,貯于4°C的冰箱備用;第二步溫度適應(yīng)性篩選(I)將第一步(3)所得的斜面菌種,轉(zhuǎn)接于五 十支斜面試管,(2)將第二步(I)所述的斜面試管置于暗室中,20°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),檢查發(fā)光狀況,選出發(fā)光良好的菌支,(3)將第二步(2)選出的菌支分別轉(zhuǎn)接于五 十支斜面試管,(4)將第二步(3)所述的試管置于暗室中,20°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),檢查發(fā)光狀況,選出發(fā)光良好的菌支,(5)將第二步(4)選出的菌支分別劃線轉(zhuǎn)接于十個(gè)平皿,平分成兩組,為第I組和第II組,分別于4°C和40°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),(6)另取十個(gè)平皿,平分成兩組,為第III組和第IV組,每組五個(gè)平皿,暗室中挑取第I組的每一個(gè)平皿中發(fā)光良好的一個(gè)單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于第III組的五個(gè)平皿,暗室中挑取第II組的每一個(gè)平皿中發(fā)光良好的一個(gè)單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于第IV組的五個(gè)平皿,將第III組和第IV組分別于40°C和4°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),(7)另取十支斜面試管,分別對(duì)應(yīng)上述第III組和第IV組的每個(gè)平皿,將各平皿中發(fā)光良好的一個(gè)單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于十支對(duì)應(yīng)斜面試管中,20°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),(8)另取五支斜面試管,選取第二步(7)所述的十支斜面試管中發(fā)光良好的五個(gè)斜面,分別轉(zhuǎn)接到五支斜面試管中,得到五支斜面菌種,保存于4°C冰箱內(nèi)備用,(9)所述的斜面試管和平皿內(nèi)需用固體培養(yǎng)基,該固體培養(yǎng)基與上述的第一步需用的固體培養(yǎng)基完全相同,(10)經(jīng)第二步溫度適應(yīng)性篩選操作后所得的菌種,具有耐低溫4°C和耐高溫40°C的性能; 第三步pH值適應(yīng)性篩選(I)取第二步的(8)所得的斜面菌種,分別轉(zhuǎn)接于pH5. O和pHll. O的液體培養(yǎng)基中,各為五瓶,20°C振蕩培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí), (2)在經(jīng)第三步(I)操作后的pH5. O和pHll. O液體培養(yǎng)物中,各選取其中發(fā)光良好的培養(yǎng)物,進(jìn)行交換轉(zhuǎn)接,即將PH5. O液體培養(yǎng)基中選中的菌種轉(zhuǎn)接于pHll. O液體培養(yǎng)基中,而將pHll. O液體培養(yǎng)基中選中的菌種轉(zhuǎn)接于pH5. O液體培養(yǎng)基中,20°C振蕩培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),(3)另取十個(gè)平皿,在經(jīng)第三步(2)操作后的液體培養(yǎng)基中,分別選取pH5. O和pHll. O中發(fā)光良好的培養(yǎng)物為菌種,將選中的菌種分別劃線于平皿中,來源于pH5. O和pHll. O的各五個(gè)平皿,20°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),( 4 )取十個(gè)斜面試管,在經(jīng)第三步(3 )操作后的十個(gè)平皿中,各選取發(fā)光良好的單菌落,將每一個(gè)選中的單菌落各自轉(zhuǎn)接于所述的斜面試管中,共十支,20°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),選取其中發(fā)光良好的斜面試管6支,得到經(jīng)pH值適應(yīng)性篩選的菌種,貯于4°C的冰禮備用,(5)第三步需用固體培養(yǎng)基,該固體培養(yǎng)基與第一步和第二步需用的固體培養(yǎng)基完全相同,第三步需用液體培養(yǎng)基,該液體培養(yǎng)基的配方為,MgSO4 2. 47g, MgCO3 O. 79g,MgBr2 O. 09g, MgCl2O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0.122g,NaCl 8. 29g, Mg (HCO3) 2 0.50g,酵母膏5g,胰胨5g,甘油3g,溶于IOOOmL蒸餾水中,分別用檸檬酸和氨水調(diào)節(jié)它們的pH,得到pH值分別為PH5. O和pHll. O的液體培養(yǎng)基,121°C滅菌20分鐘,固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基貯于4°C的冰箱備用;第四步毒物反應(yīng)靈敏性篩選采用兩種有代表性的毒物=HgCl2和苯酚,分別以倍增梯度濃度系列觀察淡水發(fā)光菌對(duì)上述毒物反應(yīng)的大小,以相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度和EC50大小為衡量毒物抑制淡水發(fā)光菌的指標(biāo),利用下式計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度
權(quán)利要求
1.一種青?;【鶴67B,其特征在于,(1)形態(tài)特征該菌的菌體呈桿狀微彎,大小介于O.5 O. 7微米X1. 5 2微米,革蘭氏染色陰性,用利夫生鞭毛染色,觀察到單極生鞭毛似蝌蚪狀,細(xì)胞內(nèi)累積聚β_羥基丁酸;(2)生理生化特征該菌適于生長(zhǎng)的溫度范圍和pH范圍分別為4°C 40°C和pH5 PH10,對(duì)弧菌抑制劑2,4- 二氨基-6,7- 二異丙基喋啶敏感,具有耐鹽、耐高滲透壓和低滲透壓的能力,能在介于質(zhì)量百分濃度0% 8%之間的NaCl溶液中生長(zhǎng)和發(fā)光;(3)基因特征16SrDNA序列
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的青海弧菌Q67B,其特征在于,該菌最適于生長(zhǎng)的溫度和pH值分別為25°C的和pH9.0。
3.一種分離篩選權(quán)利要求1所述的青?;【鶴67B的方法,其特征在于,該菌經(jīng)過四個(gè)步驟,篩選得到第一步獲取淡水發(fā)光菌,從青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚體表采集到的發(fā)光菌,經(jīng)分離純化,獲得淡水發(fā)光菌;第二步溫度適應(yīng)性篩選,在兩個(gè)不同的溫度下對(duì)第一步獲得的淡水發(fā)光菌進(jìn)行溫度適應(yīng)性篩選;第三步PH值適應(yīng)性篩選,在兩個(gè)不同的pH值下對(duì)第二步獲得的淡水發(fā)光菌進(jìn)行PH值適應(yīng)性篩選;第四步毒物反應(yīng)靈敏性篩選,用重金屬鹽和有機(jī)毒物對(duì)第三步獲得的淡水發(fā)光菌先后進(jìn)行兩次毒物反應(yīng)靈敏性篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離篩選方法,其特征在于,所述的兩個(gè)不同的溫度是4°C和 40。。。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離篩選方法,其特征在于,所述的兩個(gè)不同的pH值是 ρΗ5· O 和 pHll. O。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離篩選方法,其特征在于,所述的重金屬鹽和有機(jī)毒物分別是HgCl2和苯酚。
7.根據(jù)權(quán)利要求3、4、5或6所述的分離篩選方法,其特征在于,具體操作步驟第一步獲取淡水發(fā)光菌(1)取新鮮的青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚,截成小段,室溫下放置10小時(shí) 24小時(shí), 在暗室內(nèi)檢視,在發(fā)綠色熒光的亮點(diǎn)處,用滅菌的接種針括取,劃線于培養(yǎng)皿內(nèi),(2)將第一步(I)所述的培養(yǎng)皿置于暗室中,20°C培養(yǎng)10小時(shí) 18小時(shí),從中挑取發(fā)光良好的單菌落,(3)對(duì)第一步(2)所述的單菌落進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)三 五次,取得單細(xì)胞純培養(yǎng)物,轉(zhuǎn)接于斜面試管,培養(yǎng)生長(zhǎng)后得斜面菌種,即淡水發(fā)光菌,保存于4°C冰箱備用,(4)所述的培養(yǎng)皿和斜面試管內(nèi)需用固體培養(yǎng)基,該固體培養(yǎng)基的配方為,MgSO4.2.47g, MgCO3 O. 79g, MgBr2 O. 09g, MgCl2 O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0. 122g, NaCl 8. 29g, Mg(HCO3)2 0. 50g,酵母膏5g,胰胨5g,甘油3g,瓊脂20g,溶于IOOOmL蒸餾水中,ρΗ9· 0, 121°C滅菌20分鐘,貯于4°C的冰箱備用;第二步溫度適應(yīng)性篩選(1)將第一步(3)所得的斜面菌種,轉(zhuǎn)接于五 十支斜面試管,(2)將第二步(I)所述的斜面試管置于暗室中,20°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),檢查發(fā)光狀況,選出發(fā)光良好的菌支,(3)將第二步(2)選出的菌支分別轉(zhuǎn)接于五 十支斜面試管,(4)將第二步(3)所述的試管置于暗室中,20°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),檢查發(fā)光狀況, 選出發(fā)光良好的菌支,(5)將第二步(4)選出的菌支分別劃線轉(zhuǎn)接于十個(gè)平皿,平分成兩組,為第I組和第II 組,分別于4°C和40°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),(6)另取十個(gè)平皿,平分成兩組,為第III組和第IV組,每組五個(gè)平皿,暗室中挑取第I組的每一個(gè)平皿中發(fā)光良好的一個(gè)單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于第III組的五個(gè)平皿,暗室中挑取第II組的每一個(gè)平皿中發(fā)光良好的一個(gè)單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于第IV組的五個(gè)平皿,將第III組和第IV組分別于40°C和4°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),(7)另取十支斜面試管,分別對(duì)應(yīng)上述第III組和第IV組的每個(gè)平皿,將各平皿中發(fā)光良好的一個(gè)單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于十支對(duì)應(yīng)斜面試管中,20°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),(8)另取五支斜面試管,選取第二步(7)所述的十支斜面試管中發(fā)光良好的五個(gè)斜面, 分別轉(zhuǎn)接到五支斜面試管中,得到五支斜面菌種,保存于4°C冰箱內(nèi)備用,(9)所述的斜面試管和平皿內(nèi)需用固體培養(yǎng)基,該固體培養(yǎng)基與上述的第一步需用的固體培養(yǎng)基完全相同,(10)經(jīng)第二步溫度適應(yīng)性篩選操作后所得的菌種,具有耐低溫4°C和耐高溫40°C的性第三步pH值適應(yīng)性篩選(1)取第二步的(8)所得的斜面菌種, 分別轉(zhuǎn)接于pH5.O和pHll. O的液體培養(yǎng)基中,各為五瓶,20°C振蕩培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),(2)在經(jīng)第三步(I)操作后的pH5.O和pHl1. O液體培養(yǎng)物中,各選取其中發(fā)光良好的培養(yǎng)物,進(jìn)行交換轉(zhuǎn)接,即將pH5. O液體培養(yǎng)基中選中的菌種轉(zhuǎn)接于pHl1. O液體培養(yǎng)基中,而將pHll. O液體培養(yǎng)基中選中的菌種轉(zhuǎn)接于pH5. O液體培養(yǎng)基中,20°C振蕩培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),(3)另取十個(gè)平皿,在經(jīng)第三步(2)操作后的液體培養(yǎng)基中,分別選取pH5.O和pHll. O 中發(fā)光良好的培養(yǎng)物為菌種,將選中的菌種分別劃線于平皿中,來源于pH5. O和pHll. O的各五個(gè)平皿,20°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),(4)取十個(gè)斜面試管,在經(jīng)第三步(3)操作后的十個(gè)平皿中,各選取發(fā)光良好的單菌落, 將每一個(gè)選中的單菌落各自轉(zhuǎn)接于所述的斜面試管中,共十支,20°C培養(yǎng)16小時(shí) 18小時(shí),選取其中發(fā)光良好的斜面試管6支,得到經(jīng)pH值適應(yīng)性篩選的菌種,貯于4°C的冰箱備用,(5)第三步需用固體培養(yǎng)基,該固體培養(yǎng)基與第一步和第二步需用的固體培養(yǎng)基完全相同,第三步需用液體培養(yǎng)基,該液體培養(yǎng)基的配方為,MgSO4 2. 47g, MgCO3 O. 79g, MgBr2O.09g, MgCl2 O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0. 122g, NaCl 8. 29g, Mg (HCO3) 2 0. 50g,酵母膏 5g,胰胨5g,3g,溶于IOOOmL蒸餾水中,分別用檸檬酸和氨水調(diào)節(jié)它們的pH,得到pH值分別為PH5. O和pHll. O的液體培養(yǎng)基,121°C滅菌20分鐘,固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基貯于 4°C的冰箱備用;第四步毒物反應(yīng)靈敏性篩選采用兩種有代表性的毒物=HgCl2和苯酚,分別以倍增梯度濃度系列觀察淡水發(fā)光菌對(duì)上述毒物反應(yīng)的大小,以相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度和EC50大小為衡量毒物抑制淡水發(fā)光菌的指標(biāo),利用下式計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度樣品發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(%)=對(duì)照發(fā)光強(qiáng)度X 100% [I],EC50指相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度為50%時(shí)的毒物濃度,測(cè)光儀為上海植物生理研究所出品的生物和化學(xué)測(cè)光計(jì),(1)取第三步(5)得到的6支菌種,分別經(jīng)二次斜面轉(zhuǎn)接活化后,分別用蒸餾水洗下菌苔,充分混勻后,分別得到6支淡水發(fā)光菌液,用發(fā)光檢測(cè)法評(píng)估它們對(duì)毒物的反應(yīng),先評(píng)估它們對(duì)HgCl2的反應(yīng),每次僅用I支淡水發(fā)光菌液,操作如下在8個(gè)測(cè)量杯中各加2ml HgCl2樣品,形成濃度梯度系列,每亇濃度設(shè)2個(gè)平行,空白對(duì)照用蒸餾水,也設(shè)2個(gè)平行,然后逐個(gè)加入所述的那支淡水發(fā)光菌液的菌液,使測(cè)量杯中的淡水發(fā)光菌濃度為5X107/ml,作用15分鐘,立即測(cè)定各測(cè)量的發(fā)光強(qiáng)度,最后以對(duì)照發(fā)光值作基準(zhǔn),利用公式[I]計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度,并推算出EC50值,其余5支作相同的操作, 用EC50值判斷上述的6支淡水發(fā)光菌對(duì)同一毒物的反應(yīng)能力,EC50值越小,表示該菌種的菌株的毒物反應(yīng)越靈敏,篩選得到對(duì)HgCl2反應(yīng)最為靈敏的菌種3株,分別制成斜面,進(jìn)行下述測(cè)試篩選,(2)取第四步(I)得到的3株菌種的斜面,分別經(jīng)二次斜面轉(zhuǎn)接活化后,分別用蒸餾水洗下菌苔,充分混勻后,分別得到3支淡水發(fā)光菌液,用發(fā)光檢測(cè)法評(píng)估它們對(duì)苯酚的反應(yīng),每次僅用I支淡水發(fā)光菌液,操作如下在8個(gè)測(cè)量杯中各加2ml苯酚樣品,使形成濃度梯度系列,每亇濃度設(shè)2個(gè)平行,空白對(duì)照用蒸餾水,也設(shè)2個(gè)平行,然后向各測(cè)量杯內(nèi)逐個(gè)加入上述的那支淡水發(fā)光菌液,使測(cè)量杯中的淡水發(fā)光菌濃度為5X107/ml,作用15分鐘,立即測(cè)定各測(cè)量的發(fā)光強(qiáng)度,最后以對(duì)照發(fā)光值作基準(zhǔn),利用公式[I]計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度,并推算出EC50值,其余2支作相同的操作,比較上述檢測(cè)所得的3個(gè)EC50值,取EC50值最小的,與最小EC50值對(duì)應(yīng)的菌株就是分離篩選得到的青?;【鶴67B。
8.一種用權(quán)利要求1所述的青?;【鶴67B檢測(cè)毒物的生物毒性的方法,其特征在于, 具體操作步驟第一步菌液制備取青?;【鶴67B的菌種斜面I支,轉(zhuǎn)接于試管斜面上,20°C培養(yǎng)18 小時(shí),再轉(zhuǎn)接一次,20°C培養(yǎng)18小時(shí),發(fā)光明亮,用蒸餾水Iml 2ml洗下斜面上的菌苔,轉(zhuǎn)入燒杯,稀釋至光密度0D600為O. 03,得到菌液,立即用于以下操作;弟~■步被測(cè)樣品溶液制備若被測(cè)樣品為固體,用質(zhì)量百分濃度介于0% 8%的NaCl溶液配制濃度分別為O.1mg/ L、lmg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L的被測(cè)樣品溶液,若被測(cè)樣品為液體,用質(zhì)量百分濃度介于0% 8%的NaCl溶液稀釋成如下濃度梯度的被測(cè)樣品溶液100% (V/V)、75% (V/V)、 50% (V/V),25% (V/V),10% (V/V);第三步發(fā)光檢測(cè)取測(cè)光儀的專用測(cè)量杯12個(gè),將第二步所述的每種濃度的被測(cè)毒物溶液注入2個(gè)測(cè)量杯,注入量為2ml,在余下的2個(gè)測(cè)量杯,各注入2ml質(zhì)量百分濃度介于 0% 8%的NaCl溶液,作空白對(duì)照,為每個(gè)測(cè)量杯注入第一步制備的菌液,注入量為50μ 1, 15分鐘后,用測(cè)光儀測(cè)量各測(cè)量杯的發(fā)光強(qiáng)度,按下式計(jì)算各測(cè)量杯的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度樣品發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(%)= 對(duì)照發(fā)光強(qiáng)度X 100%;第四步得到被測(cè)毒物的EC50值以相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度為縱座標(biāo),被測(cè)樣品濃度為橫座標(biāo), 將第三步的計(jì)算得到的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度分別記在各自的對(duì)應(yīng)的被測(cè)毒物溶液的濃度位點(diǎn)上, 找出的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度50%時(shí)對(duì)應(yīng)的被測(cè)毒物溶液的濃度,就是被測(cè)毒物的EC50值。
全文摘要
本發(fā)明涉及青?;【鶴67B(CCTCC NOM2010104)及其分離篩選和應(yīng)用,屬微生物學(xué)的發(fā)光細(xì)菌分離篩選和應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域,該菌是從青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚體表采集到的發(fā)光菌,經(jīng)分離純化,再經(jīng)溫度適應(yīng)性篩選,又經(jīng)pH值適應(yīng)性篩選,最后經(jīng)毒物反應(yīng)靈敏性篩選,得到的一種淡水發(fā)光菌。該菌在清潔水體中發(fā)光恒定,接觸到毒物,其發(fā)光強(qiáng)度會(huì)明顯衰減,據(jù)此可推定毒物的毒性大小及毒物的濃度。在用于地表水如內(nèi)陸河流湖泊、地下水及排放污水的毒性檢測(cè)時(shí),可在10℃~37℃下進(jìn)行,無需調(diào)節(jié)水樣滲透壓和pH值,10~15分鐘內(nèi)就可判別水樣的毒性大小,快速、方便、靈敏。上述優(yōu)點(diǎn)是海洋發(fā)光菌所不具備的。
文檔編號(hào)C12R1/63GK103045524SQ20131001967
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者朱文杰 申請(qǐng)人:朱文杰
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