專利名稱：動物融合重組型干擾素的制作方法
技術領域：
本發(fā)明關于一種動物融合重組型干擾素，特別是關于一種具有抗動物病毒活性的融合重組型干擾素。
背景技術：
干擾素最早是在1957年由英國學者Alick Isaacs和Jean Lindenmann在進行流感病毒試驗中所發(fā)現(xiàn)，當細胞遭受病毒感染后，會立即制造一種細胞激素，誘發(fā)鄰近細胞產生抗病毒蛋白，干擾病毒的復制。該細胞激素隨后被命名為干擾素(Interferon，IFN)。干擾素的抗病毒作用，主要是由第一型干擾素(IFNci/￠)所負責。干擾素除了具有抗病毒作用外，還具有抗腫瘤、促進細胞分化和免疫調節(jié)等功用。目前市面上的干擾素制劑，多為針對人類所開發(fā)設計，例如:用來治療人類B型與C型肝炎等病毒性疾病以及卡波西氏瘤(Kaposi’ s sarcoma, KS)、黑色素腫瘤(malignantmelanoma)等腫瘤疾病上的干擾素。至于經濟動物方面，以干擾素治療病毒性疾病的情形并不普遍。若無有效的疫苗來預防某一動物病毒，當畜群受該病毒感染時，只能使用支持性療法處理，但效果往往不彰，而造成畜牧業(yè)重大損失；因此，動物干擾素的開發(fā)，對動物保健產業(yè)而言，可說是刻不容緩且極為重要的事。

發(fā)明內容
本發(fā)明于第一部份中提供一種動物融合重組型干擾素。由于干擾素屬于小分子蛋白質，在體內半衰期短(約2-8小時)且不穩(wěn)定，因此本發(fā)明所提供的動物融合重組型干擾素是將動物干擾素蛋白與半衰期較長的動物免疫球蛋白IgG-Fc片段融合，而形成較穩(wěn)定的動物融合重組型干擾素。于一較佳實施例中，該動物干擾素蛋白以及該動物免疫球蛋白IgG-Fc片段是以由甘氨酸(Glycine, G)及絲氨酸(Serine, S)組成的連接子(linker)所連接起來的。于一實施例中，該干擾素蛋白為豬干擾素a，該豬干擾素a系與如SEQ IDNos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45 及 47 所示之氨基酸序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，較佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一較佳實施例中，該豬干擾素 a 選自于由如 SEQ ID Nos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47所示之氨基酸序列所組成之群組中至少一者。于一實施例中，該動物免疫球蛋白IgG-Fc片段為豬免疫球蛋白IgG-Fc片段，該豬免疫球蛋白IgG-Fc片段與如SEQ ID Nos:4、49、51、53及55所示之氨基酸序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，較佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一較佳實施例中，該豬免疫球蛋白IgG-Fc片段選自 于由如SEQ ID Nos:4、49、51、53及55所示之氨基酸序列所組成之群組中至少一者。于一實施例中，該連接子系與如SEQ ID No:6所示之氨基酸序列具有至少80%序列同源性，較佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一較佳實施例中，該連接子具有如SEQ IDNo:6所示之氨基酸序列。于一實施例中，該動物融合重組型干擾素系與如SEQ ID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221 及 223 所示之氨基酸序列其中之一具有至少80%序列同源性，較佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一較佳實施例中，該動物融合重組型干擾素系選自于由如SEQID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221 及 223 所示之氨基酸序列所組成之群組。本發(fā)明于第二部分中提供一種編碼上述動物融合重組型干擾素的多核苷酸。本發(fā)明所提供之動物融合重組型干擾素是藉由基因轉殖技術而得。首先將編碼動物干擾素蛋白的DNA序列，以及編碼動物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列選殖到表現(xiàn)載體系統(tǒng)中，形成含有編碼動物融合重組型干擾素之DNA序列的質體，再將該質體轉殖到表現(xiàn)系統(tǒng)中，經誘導蛋白質表現(xiàn)后而得到動物融合重組型干擾素。于一較佳實 施例中，除了將編碼動物干擾素蛋白的DNA序列以及編碼動物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列選殖到表現(xiàn)載體系統(tǒng)中，并將編碼由甘氨酸及絲氨酸組成的連接子(linker)的DNA序列選殖到該表現(xiàn)載體系統(tǒng)中，以連接該編碼動物干擾素蛋白的DNA序列以及編碼動物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列。于一實施例中，該編碼動物干擾素蛋白的DNA序列系與如SEQ ID Nos:l、16、18、
20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44及46所示之DNA序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，較佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一較佳實施例中，該編碼動物干擾素蛋白的 DNA 序列系選自于由如 SEQ ID Nos:l、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42>44及46所示之DNA序列所組成之群組中至少一者。于一實施例中，該編碼動物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列與如SEQ IDNos:3、48、50、52及54所示之DNA序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，較佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,99%序列同源性。于一較佳實施例中，該編碼動物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列選自于由如SEQ ID Nos:3、48、50、52及54所示之DNA序列所組成之群組中至少一者。于一實施例中，該編碼由甘氨酸及絲氨酸組成的連接子(linker)的DNA序列與如SEQ ID No: 5所示之DNA序列具有至少80%序列同源性，較佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一較佳實施例中，該編碼由甘氨酸及絲氨酸組成的連接子的DNA序列系具有如SEQ ID No: 5所示之DNA序列。于一實施例中，該編碼動物融合重組型干擾素的DNA序列與如SEQ ID Nos:7、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220及222所示之DNA序列具有至少80%序列同源性，較佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一較佳實施例中，該編碼動物融合重組型干擾素的DNA序列具有如SEQ ID Nos:7、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220 及 222所示之DNA序列。

該表現(xiàn)載體可為原核生物表現(xiàn)載體或真核生物表現(xiàn)載體。該原核生物表現(xiàn)載體包含但不限于PET系列表現(xiàn)載體以及pGEX系列表現(xiàn)載體。該真核生物表現(xiàn)載體包含但不限于pSecTag系列表現(xiàn)載體。該表現(xiàn)系統(tǒng)可為原核生物表現(xiàn)系統(tǒng)(如:細菌)或真核生物表現(xiàn)系統(tǒng)(如:酵母菌、昆蟲細胞、植物細胞和哺乳動物細胞等)。于一實施例中，該表現(xiàn)系統(tǒng)為大腸桿菌(Escherichia coli)。于另一實施例中，該表現(xiàn)系統(tǒng)為哺乳動物細胞?？捎糜诒景l(fā)明動物融合重組型干擾素表現(xiàn)的哺乳動物細胞包含但不限于3T3細胞、中國倉鼠卵巢細胞(Chinesehamster ovary cells, CHO cells)、幼鼠腎細胞(baby hamster kidney cells, BHKcells)、人類子宮頸癌細胞(HeLa cells)，以及人類肝癌細胞0fepG2 cells)等。本發(fā)明于第三部分中提供一種以哺乳細胞產制本發(fā)明的動物融合重組型干擾素的優(yōu)化制程。將帶有編碼本發(fā)明的動物融合重組型干擾素的多核苷酸的哺乳細胞先以含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，待該細胞生長穩(wěn)定后，再改為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，于每隔1-5天更換新的無血清培養(yǎng)基，并收取細胞培養(yǎng)基，以獲得本發(fā)明的動物融合重組型干擾素。該哺乳動物細胞包含但不限于3T3細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO cells)、幼鼠腎細胞(BHK cells)、人類子宮頸癌細胞(HeLa cells)，以及人類肝癌細胞0fepG2 cells)等。于一實施例中，該哺乳細胞為中國倉鼠卵巢細胞(CHO cells)。該血清包含但不限于牛血清以及馬血清。于一實施例中，該血清為胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)。該血清在培養(yǎng)基中的含量為0.l_10%(v/v);于一實施例中，該血清含量為5%(v/v)。本發(fā)明于第四部分中提供一種動物融合重組型干擾素在制備動物抗病毒藥物中的用途。經試驗證明，本發(fā)明所提供的動物融合重組型干擾素具有抗病毒效果。分別以DNA病毒(如:偽狂犬病病毒，pseudorabies virus, PRV)以及RNA病毒(如:豬繁殖與呼吸道綜合癥病毒，porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)為體夕卜試驗(in vitro)測試對象，測試本發(fā)明動物融合重組型干擾素的抗病毒活性。結果顯示，本發(fā)明動物融合重組型干擾素可以有效抑制DNA病毒以及RNA病毒的宿主細胞內的增殖，且抗病毒效果優(yōu)于未與動物免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重組的動物干擾素。因此，本發(fā)明所提供的動物融合重組型干擾素可用來抑制動物病毒在動物體內增殖。本說明書中所述的所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同了解的意義。本發(fā)明以下面的實施例予以示范闡明，但本發(fā)明不受下述實施例所限制。


圖1A為帶有編碼豬融合重組型干擾素基因的質體轉染至CHO細胞后，以Zeocin抗生素篩選后以IFA分析的結果；圖1B為pSecTag2(B)載體轉染至CHO細胞后，以Zeocin抗生素篩選后以IFA分析的結果。圖2為 將帶有編碼豬融合重組型干擾素基因的質體或將pSecTag2 (B)載體轉染至CHO細胞后，以Zeocin抗生素篩選后以ELISA分析的結果。圖3為以不同抗體偵測帶有編碼豬融合重組型干擾素基因的CHO細胞所表現(xiàn)的蛋白中是否含有豬融合重組型干擾素的結果；第I道:帶有編碼豬融合重組型干擾素基因的CHO細胞所表現(xiàn)的蛋白的SDS-PAGE分析圖；第2道:以mouse anti IFN a單株抗體分析；第3道:以mouse anti His單株抗體分析；第4道:以goat anti porcine IgG抗體分析。圖4為豬融合重組型干擾素(P IFN-Fc組)及未與豬免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重組的干擾素(P IFN組)的抗PRRS病毒及抗PR病毒的活性比較。
具體實施例方式實施例一豬干擾素a I基因選殖取三品系雜交豬(LXY-D)的血液分離外圍血液單核細胞(Peripheral bloodmononuclear cell, PBMC),并以異硫氰酸狐(guanidine thiocyanate, GTC)法萃取總RNA (total RNA)。接著將萃取的總RNA進行反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse polymerasechain reaction, RT-PCR);先將萃取的RNA以70°C作用3分鐘后，將含有20 總RNA、101115叉反應液、81111.251111 (1見1\11113’端互補引子、11111蒸餾水、0.5111 RNasin 以及0.5 ill AMV反轉錄酶的反應管置于42°C作用30分鐘，以進行cDNA合成；再將合成后的cDNA進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)以增殖豬干擾素a I基因(P IFNa I)，在反應管中加入 IOii I cDNA、5iill0x PCR 反應液、8 y 11.25mM dNTP、liil5’端正向引子、IP 13’端反向引子、24iU蒸餾水、Iiil Taq聚合酶，混合均勻后放入PCR反應器中(Applied Biosystems GeneAmp PCR system2400),反應條件為先以 95°C 5 分鐘將DNA變性，接著以95 °C I分鐘、55°C 30秒、72°C 30秒進行30個循環(huán)，最后以72 °C 5分鐘完成PCR反應。其中，豬干擾素^1基因$ IFNa I)的特異性引子序列如下:正向引子(IFN-Fl):5，-CCCAAGCTTATGGCCCCAACCTCAGCC-3，(SEQ ID NO:9)HindIII
反向引子(IFN-Rl):
權利要求
1.一種動物融合重組型干擾素，包含一動物干擾素以及一動物免疫球蛋白Fe片段。
2.如權利要求1所述之動物融合重組型干擾素，其特征在于，該動物干擾素以及該動物免疫球蛋白Fe片段是由一連接子所連接。
3.如權利要求1或2所述之動物融合重組型干擾素，其特征在于，該動物干擾素具有一氨基酸序列，該氨基酸序列選自于由SEQ ID Nos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47所組成之群組中至少一者。
4.如權利要求1或2所述之動物融合重組型干擾素，其特征在于，該動物干擾素具有一氨基酸序列，該氨基酸序列與選自于由SEQ ID Nos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47所組成之群組至少一者的序列具有至少80%序列同源性。
5.如權利要求1或2所述之動物融合重組型干擾素，其特征在于，該動物免疫球蛋白Fe片段具有一氨基酸序列，該氨基酸序列選自于由SEQ ID Nos:4、49、51、53、及55所組成之群組中至少一者。
6.如權利要求1或2所述之動物融合重組型干擾素，其特征在于，該動物免疫球蛋白Fe片 段具有一氨基酸序列，該氨基酸序列與選自于由SEQ ID Nos:4、49、51、53、及55所組成之群組至少一者的序列具有至少80%序列同源性。
7.如權利要求2所述之動物融合重組型干擾素，其特征在于，該連接子具有如SEQIDNo: 6所示之序列。
8.如權利要求2所述之動物融合重組型干擾素，其特征在于，該連接子具有一氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID No:6所示之序列具有至少80%序列同源性。
9.如權利要求2所述之動物融合重組型干擾素，其特征在于，該動物融合重組型干擾素具有一氨基酸序列，該氨基酸序列選自于由SEQ ID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221 及 223 所組成之群組。
10.如權利要求2所述之動物融合重組型干擾素，其特征在于，該動物融合重組型干擾素具有一氨基酸序列，該氨基酸序列與選自于由SEQ ID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221 及 223 所組成之群組之一的序列具有至少80%序列同源性。
11.一種編碼如權利要求1所述之動物融合重組型干擾素的多核苷酸。
12.—種制備一動物融合重組型干擾素的方法，包含將帶有如權利要求11所述之多核苷酸的哺乳細胞以含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)至該細胞生長穩(wěn)定后，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并于每隔I至5天更換新的無血清培養(yǎng)基以及收獲該動物融合重組型干擾素。
13.如權利要求12所述之方法，其中該含有血清的培養(yǎng)基的血清含量為0.1至10體積百分比。
14.一種如權利要求1所述之動 物融合重組型干擾素在制備動物抗病毒藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明關于一種動物融合重組型干擾素，包含一動物干擾素以及一動物免疫球蛋白Fc片段。該動物干擾素以及該動物免疫球蛋白Fc片段進一步可由一連接子所連接。本發(fā)明并關于一種編碼該動物融合重組型干擾素的多核苷酸、一種制備該動物融合重組型干擾素的方法，以及該動物融合重組型干擾素的用途。
文檔編號C12P21/02GK103214579SQ20131002007
公開日2013年7月24日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權日2012年1月19日
發(fā)明者郭村勇, 吳忠晉, 陳漢婷 申請人:施懷哲維克生物科技股份有限公司