專利名稱：地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元制備參數(shù)的優(yōu)選方法、制備工藝及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種動(dòng)物飼用微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，具體地說是一種地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元制備參數(shù)的優(yōu)選方法、制備工藝及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道是機(jī)體最大的消化器官，也是最大的免疫器官。穩(wěn)定的腸道微生態(tài)群系可以促進(jìn)腸道功能的完善，能提聞動(dòng)物的生廣性能和免疫性能。機(jī)體在遭受外在或內(nèi)在各種因素(如疾病、斷奶等)刺激作用下，腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，有害菌群(如大腸桿菌)增多，有益菌群(如乳酸桿菌、芽孢桿菌)數(shù)量會(huì)減少，就會(huì)導(dǎo)致腸道的功能紊亂，出現(xiàn)腹瀉、胃口差、對(duì)食物過敏、抵抗力下降、反復(fù)生病等問題。一直以來，腸道功能紊亂的防治以抗生素為主，但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，抗生素在腸道中對(duì)微生物的作用是通殺:不僅對(duì)有害微生物有殺滅作用，同時(shí)對(duì)有益微生物也有殺滅作用。此外，未被殺死的部分微生物通過基因突變等自然進(jìn)化方式對(duì)抗治療，其結(jié)果造成某個(gè)菌種作為一個(gè)整體對(duì)某些抗生素不再敏感，最終形成耐藥性。因此在天然資源中尋找無毒、無殘留、無抗藥性的抗生素有效替代制劑成為畜牧獸醫(yī)業(yè)研究的熱點(diǎn)。益生菌是對(duì)改善宿主腸道菌群生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達(dá)到提高宿主健康水平和健康佳態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物。具有維持腸道的正常功能，有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、改善機(jī)體代謝、凈化腸道環(huán)境等多方面的作用。地衣芽孢桿菌bacillusIicheniformis是動(dòng)物體內(nèi)常見的益生菌，它有良好的益生功能。地衣芽孢桿菌在低pH和膽汁中存活并能植入腸粘膜，并具有安全性好，易于儲(chǔ)存的特點(diǎn)，被認(rèn)為是最理想的微生物添加劑。近年來，隨著我國(guó)動(dòng)物飼養(yǎng)水平的提高，益生菌的應(yīng)用效果有所下降。人們發(fā)現(xiàn)益生菌的活菌制劑具有穩(wěn)定性差、產(chǎn)品種類單一、應(yīng)用范圍有限、效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，在產(chǎn)品應(yīng)用方面存在較大困難。益生元一種膳食補(bǔ)充劑，它可以通過選擇性的刺激一種或少數(shù)種菌落中的細(xì)菌的生長(zhǎng)與活性而對(duì)宿主產(chǎn)生有益的影響從而改善宿主健康的不可被消化的食品成分。成功的益生元應(yīng)是在通過上消化道時(shí)，大部分不被消化而能被腸道菌群所發(fā)酵的。最重要的是它只是刺激有益菌群的生長(zhǎng)，而不是有潛在致病性或腐敗活性的有害細(xì)菌。益生元給益生菌提供“食物”，能夠被腸道內(nèi)有益細(xì)菌分解吸收，促進(jìn)有益細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。益生元主要包括各種寡糖類物質(zhì)。木寡糖又稱低聚木糖，譽(yù)為“超強(qiáng)雙歧因子”，被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)消化道微生物區(qū)系的作用，是促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)和抑制有害菌生長(zhǎng)的益生素。研究人員根據(jù)益生元和益生菌的特點(diǎn)，把兩者結(jié)合起來，成為合生元。合生元就是將益生菌與益生元合并使用。合生元具有益生菌與益生元雙重作用效果:既可發(fā)揮益生菌的生理性細(xì)菌活性，又可選擇性增加這種菌的數(shù)量使益生作用更持久，合生元對(duì)調(diào)整腸道微生態(tài)平衡要優(yōu)于益生菌與益生元單獨(dú)使用。它是一種很好的抗生素的替代品，也是非常好的微生態(tài)制劑。目前市面上對(duì)地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元產(chǎn)品沒有報(bào)道，因此對(duì)于地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元制備參數(shù)和工藝研究對(duì)合生元生產(chǎn)和應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元制備參數(shù)的優(yōu)選方法、制備工藝及應(yīng)用，通過體外培養(yǎng)試驗(yàn)，科學(xué)選取地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元制備參數(shù)，實(shí)現(xiàn)制備工藝優(yōu)化，確保合生元產(chǎn)品的使用效果。本發(fā)明的原理:根據(jù)地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線，確定地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)最佳溫度、轉(zhuǎn)速。利用菌液OD值，確定適宜的木寡糖添加量。再根據(jù)地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)代時(shí)G，確定合生元的最佳培養(yǎng)時(shí)間，最終確定地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元的最佳制備工藝。本發(fā)明提供的地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元制備參數(shù)的優(yōu)選方法如下:1、地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線繪制和培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速的確定:將活化后的地衣芽孢桿菌CICC20446菌液以容量比1%的接種量接種于已確定PH值(PH=7.0)的LB液體培養(yǎng)基中，分別于 34°C -120r min_1>37°C -120r min_1>40°C -120r mirf1 和 34°C -150r.mirT1、37 °C -150r min_1>40 °C -150r mirf1 及 34 °C -180r min_1>37 °C -180r mirf1、40°C -180r min—1的條件下振蕩培養(yǎng)，每隔0.5h取樣I次，連續(xù)培養(yǎng)12h，于600nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線，根據(jù)生長(zhǎng)曲線確定培養(yǎng)最佳溫度、轉(zhuǎn)速；2、木寡糖最適添加量的確定:在LB液體培養(yǎng)基里加入不同比例的木寡糖，使木寡糖的濃度分別為:0.5mg mL \1.5mg mL、2.5mg mL \3mg mL \3.5mg mL \4mg mL \
4.5mg mL-1 >5mg mL-1 >6mg mL_1>7mg mL—1,將每個(gè)濃度的培養(yǎng)基等量的裝入錐形瓶中。將活化后的地衣芽孢桿菌菌液以容量比1%的接種量分別加入上述含不同濃度的木寡糖液體培養(yǎng)基中，置40°C -120r/min培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，分別在2.5 7.5h時(shí)采樣，根據(jù)600nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以確定木寡糖適宜添加量；3、地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元最適培養(yǎng)時(shí)間的確定:將木寡糖的最適添加量確定好后，根據(jù)測(cè)量的最適添加濃度組的OD值，利用公式計(jì)算代時(shí)G，從而根據(jù)地衣芽孢桿菌在每個(gè)時(shí)間段的代時(shí)以確定合生元的最適培養(yǎng)時(shí)間；G=(t2-tl)/3.322(lgx2-lgxl)式中:tl、t2分別代表培養(yǎng)時(shí)間，xl,x2分別代表不同時(shí)間合生元的OD值；4、地衣芽孢桿菌-木寡糖 菌液活菌數(shù)檢測(cè):利用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)地衣芽孢桿菌-木寡糖菌液活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明提供的地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元制備工藝如下:1、根據(jù)地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線，確定地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)最佳溫度和轉(zhuǎn)速為40 0C -120r/min。2、以LB液體培養(yǎng)基，加入木寡糖，使木寡糖的最佳含量為3.5 mg mL—1 ；3、將活化后的地衣芽孢桿菌菌液以容量比1%的接種量接種于含量為3.5mg mL—1的木寡糖液體培養(yǎng)基中，置40°C-120r/min培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，最適培養(yǎng)時(shí)間為4h，取出后即得深黃色的地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元產(chǎn)品。本發(fā)明的積極效果:
1、科學(xué)選取地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元制備參數(shù)，實(shí)現(xiàn)制備工藝優(yōu)化，確保合生元產(chǎn)品的使用效果。2、用量小，木寡糖最佳添加濃度為3.5mg mL'地衣芽孢桿菌菌量為L(zhǎng)gxiO8HiL'本發(fā)明制備的微生態(tài)制劑的原料用量不會(huì)對(duì)動(dòng)物本身產(chǎn)生毒副作用，同時(shí)也不會(huì)增加生產(chǎn)成本；3、本發(fā)明的地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元菌液中活菌數(shù)為IO8CFU mL—1以上，活菌數(shù)較高。


圖1是地衣芽孢桿菌(CICC20446) 120R不同溫度下生長(zhǎng)曲線。圖2是地衣芽孢桿菌(CICC20446) 150R不同溫度下生長(zhǎng)曲線。圖3是地衣芽孢桿菌(CICC20446) 180R不同溫度下生長(zhǎng)曲線。圖4是不同時(shí)間段合生元菌液中地衣芽孢桿菌的代時(shí)。
具體實(shí)施例方式(I)地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線繪制及培養(yǎng)條件的確定在無菌實(shí)驗(yàn)室中，按1%容量比例的接菌量將活化后的地衣芽孢桿菌液接種于裝有50mL已確定PH值(PH=7.0)的LB液體培養(yǎng)基的IOOmL錐形瓶中(LB培養(yǎng)基的成分及比例:蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g, NaCll0.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L, PH7.0)，分別于 34 °C -120r min_1>37 °C -120r min'40 °C -120r mirf1 和 34 °C -150r mirf1、37 °C -150r min_1>4 0 °C -150r mirf1 及 34 °C -180r min_1>37 °C -180r mirf1、40°C -180r min—1的條件下振蕩培養(yǎng)，每隔0.5h取樣I次，連續(xù)培養(yǎng)12h，于600nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)、吸光度(0D值)為縱坐標(biāo)繪制曲線(見圖1、2、3)，根據(jù)生長(zhǎng)曲線確定地衣芽孢桿菌培養(yǎng)最佳溫度、轉(zhuǎn)速。由圖1可見，該菌株在三個(gè)溫度、轉(zhuǎn)速下都能良好的生長(zhǎng)，但40°C、120r ^mirT1條件下的地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況要優(yōu)于其它溫度、轉(zhuǎn)速條件下。因此培養(yǎng)該菌株的最佳條件為40°C、120r mirT1。本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌活化后用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)菌數(shù)，確定含菌量為1.9 X IO8CFU mL'(2)木寡糖最適添加量的確定將經(jīng)過0.22pm微孔濾膜除菌的木寡糖(低聚木糖，山東龍力生物科技股份有限公司生產(chǎn)并銷售)加入到已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，使木寡糖的濃度分別為:0.5mg*mr\
1.5mg *mL \2.5mg *mL \3mg *mL \3.5mg *mL \4mg *mL \4.5mg *mL \5mg *mL \6mg *mL \7mg mL'將每個(gè)濃度的培養(yǎng)基裝入IOOmL錐形瓶中，每瓶50mL。將活化后的地衣芽孢桿菌菌液以容量比例1%的接種量分別加入上述含不同濃度的木寡糖液體培養(yǎng)基中，置40°C -120r ^mirT1培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，分別在2.5 7.5h采樣，每隔0.5h取樣I次，于600nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度(以LB液體培養(yǎng)基組為空白對(duì)照組，見表I)。由表I可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌液OD值呈上升趨勢(shì)，即地衣芽孢桿菌CICC20446在不斷生長(zhǎng)。添加濃度為3.5mg mL—1木寡糖的培養(yǎng)基中地衣芽孢桿菌CICC20446菌液濃度達(dá)到最高。試驗(yàn)說明，適量的木寡糖能促進(jìn)地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)，過量的木寡糖能抑制其生長(zhǎng)。木寡糖的最適添加量為3.5mg IiiL-1O表I不同濃度木寡糖對(duì)地衣芽孢桿菌CICC20446生長(zhǎng)的影響(OD值)

權(quán)利要求
1.種地衣芽孢桿菌合-木寡糖合生元制備參數(shù)的優(yōu)選方法，其特征是: a、生長(zhǎng)曲線及培養(yǎng)溫度的確定:將活化后的地衣芽孢桿菌CICC20446菌液以容量比1%的接種量接種于已確定PH值為7.0的LB液體培養(yǎng)基中，于不同溫度和不同轉(zhuǎn)數(shù)下培養(yǎng)，隔0.5 h取樣I次，連續(xù)培養(yǎng)12h，于600 nm下測(cè)定其吸光度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，確定最適生長(zhǎng)溫度、轉(zhuǎn)速； b、木寡糖最適添加量的確定:將經(jīng)0.22 iim微孔濾器除菌后的木寡糖加入滅菌的LB液體培養(yǎng)基，使木寡糖的濃度分別為:0.5 mg*mL_1>1.5 mg*mL'2.5 mg*mL_1>3 mg*mL'3.5mg*mL \ 4 mg*mL \4.5 mg*mL \5 mg*mL \ 6 mg*mL \7 mg*mL S 將每個(gè)濃度的培養(yǎng)基裝入容器瓶中，每個(gè)容器瓶中的液體相等； 將活化后的地衣芽孢桿菌菌液以容量比1%的接種量分別加入上述含不同濃度的木寡糖液體培養(yǎng)基中，置40°C -120 r-min^1培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，在2.5^7.5 h內(nèi)每隔0.5 h采樣I次，根據(jù)600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以確定木寡糖適宜添加量； C、地衣芽孢桿菌合-木寡糖合生元最適培養(yǎng)時(shí)間的確定:將木寡糖的最適添加量確定好后，根據(jù)測(cè)量的最適添加濃度組的OD值，利用公式計(jì)算代時(shí)G，從而根據(jù)地衣芽孢桿菌在每個(gè)時(shí)間段的代時(shí)以確定他們的最適培養(yǎng)時(shí)間；G =(t2-tl)/3.322(lgx2-lgxl) 式中:tl、t2分別代 表培養(yǎng)時(shí)間，xl,x2分別代表不同時(shí)間合生元的OD值； d、地衣芽孢桿菌合-木寡糖合生元菌液活菌數(shù)檢測(cè):利用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)地衣芽孢桿菌合-木寡糖菌液活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
2.種如權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌合-木寡糖合生元制備參數(shù)的優(yōu)選方法的制備工藝如下: a、以LB液體培養(yǎng)基，加入木寡糖，使木寡糖的含量為2.S^mg-mr1 ； b、將活化后的地衣芽孢桿菌菌液以容量比1%的接種量接種于含量為3.5、.5 mg-mL-1的木寡糖液體培養(yǎng)基中，置40°C -120 r-min^1培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，2.5^7.5 h后取出，即得深黃色的地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元產(chǎn)品。
3.據(jù)權(quán)利要求2所述的地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元制備參數(shù)的優(yōu)選方法的制備工藝，其特征是:LB液體培養(yǎng)基中的木寡糖的最佳含量為3.5 mg-mr1 ;地衣芽孢桿菌接種于木寡糖液體培養(yǎng)基中在40°C-120 I^mirT1培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng),最適培養(yǎng)時(shí)間為4 h。
4.種如權(quán)利要求2所述黃地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元制備工藝生產(chǎn)產(chǎn)品的應(yīng)用:每天灌喂一次，灌喂量15 20 mL。
全文摘要
一種地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元制備參數(shù)的優(yōu)選方法、制備工藝及應(yīng)用，將活化后的地衣芽孢桿菌CICC20446菌液以容量比1%接種于含2.5～4mg mL-1木寡糖的液體培養(yǎng)基中，分別置40℃-120r min-1培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)3.5～4.5h。該發(fā)明的地衣芽孢桿菌-木寡糖合生元可以顯著提高動(dòng)物的日增重，降低料重比和腹瀉率，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能有顯著改善作用。
文檔編號(hào)C12R1/10GK103082092SQ20131002040
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者劉顯軍, 李建濤, 陳靜, 王佳 申請(qǐng)人:劉顯軍