一種提高利迪鏈菌素產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高利迪鏈菌素產(chǎn)量的方法，包括如下步驟：（1）培養(yǎng)基和氨基酸母液的配制；（2）種子培養(yǎng)；（3）添加脯氨酸發(fā)酵：將二級(jí)種子離心，得到菌絲體，用發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌絲體，然后按體積比為5%～30%的接種密度接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，再加入脯氨酸母液，在攪拌轉(zhuǎn)速為200～600rpm，通氣量為1～3vvm，pH為6～8的條件下，發(fā)酵80～150h，得發(fā)酵液；（4）利迪鏈菌素含量測(cè)定。本發(fā)明通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中的脯氨酸添加，大幅提高發(fā)酵過(guò)程中利迪鏈菌素的產(chǎn)量，從而為利迪鏈菌素的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種提高利迪鏈菌素產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一種增加發(fā)酵過(guò)程中利迪鏈菌素產(chǎn)量的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]利迪鏈菌素為典型的Tetramic acid類抗生素，具有良好的抗細(xì)菌、抗腫瘤、抗HIV蛋白酶活性。最新研究表明，利迪鏈菌素是一個(gè)重要的RNA聚合酶抑制劑，相繼在Cell和MolCell上有3篇相關(guān)論文論及，從而引起了廣泛關(guān)注。提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的水平是微生物新藥研發(fā)過(guò)程及工業(yè)微生物發(fā)酵的一項(xiàng)重要研究任務(wù)，包括菌種改良和過(guò)程優(yōu)化控制。國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)資料顯示，利迪鏈菌素的產(chǎn)量較低，影響了人們對(duì)利迪鏈菌素的深入研究與進(jìn)一步開發(fā)利用。目前用于提高抗生素生產(chǎn)菌株產(chǎn)量的方法主要有定向誘變和隨機(jī)誘變的方法，也有對(duì)菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高抗生素的產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提供一種有效提高發(fā)酵過(guò)程中利迪鏈菌素產(chǎn)量的方法。通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加脯氨酸，大幅增加利迪鏈菌素的生產(chǎn)水平。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0005]一種提高發(fā)酵中利迪鏈菌素產(chǎn)量的方法，包括如下步驟:
[0006]( I)培養(yǎng)基和氨基酸母液的配制:
[0007]①種子培養(yǎng)基:淀粉10~100g,葡萄糖I~IOg,酵母浸粉I~IOg,蛋白胨I~10g, MgSO4.7Η200.I ~5g，NaCl0.1 ~5g，K2HPO40.1 ~5g，加水定容至 1L，121°C蒸汽滅菌20min ；
[0008]②發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉10~100g，葡萄糖I~10g，蛋白胨I~10g，MgS04*7H200.1~5g，NaCl0.1 ~5g，K2HPO40.1 ~10g，加水定容至 1L，121°C蒸汽滅菌 20min ；
[0009]③脯氨酸母液:稱取0.1~5g脯氨酸,用超純水定容至50~500mL,通過(guò)0.1~
0.45 μ m的無(wú)菌過(guò)濾器，得無(wú)菌脯氨酸母液；
[0010](2)種子培養(yǎng):將利迪鏈霉菌(Streptomyces Iydicus)在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng),得到一級(jí)種子；將一級(jí)種子在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到二級(jí)種子；
[0011](3)添加脯氨酸發(fā)酵:將100~700ml所述二級(jí)種子在3000~6000rpm離心3~20min，得到菌絲體，用100~700ml發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌絲體，然后按體積比為10%~30%的接種密度接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，再加入50~500ml脯氨酸母液，在攪拌轉(zhuǎn)速為200~600rpm,通氣量為I~3vvm, pH為6~8的條件下,發(fā)酵80~150h,得發(fā)酵液；
[0012](4)利迪鏈菌素含量測(cè)定:
[0013]取發(fā)酵液在4~30°C，轉(zhuǎn)速為8000~15000rpm，離心5~20min，收集上清液，過(guò)
0.1~0.45 μ m濾器，得濾液；測(cè)定利迪鏈菌素含量。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0015]本發(fā)明通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中的脯氨酸添加，大幅提高發(fā)酵過(guò)程中利迪鏈菌素的產(chǎn)量，從而為利迪鏈菌素的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為表征利迪鏈霉菌E9添加脯氨酸發(fā)酵過(guò)程中的葡萄糖消耗圖。
[0017]圖2為表征利迪鏈霉菌E9添加脯氨酸發(fā)酵過(guò)程中的利迪鏈霉菌生物量圖。
[0018]圖3為表征利迪鏈霉菌E9添加脯氨酸發(fā)酵過(guò)程中的利迪鏈菌素產(chǎn)量累積圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明:
[0020]本發(fā)明是以利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)E9CGMCC N0.3075和利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)NRRL2433 (ATCC N0.25470)為例進(jìn)行說(shuō)明，但并不對(duì)本發(fā)明作任何限定，實(shí)驗(yàn)證明，用其它產(chǎn)利迪鏈菌素的菌株也可以完成本發(fā)明。
利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) E9已由2009年5月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) E9 的編號(hào)為:CGMCC N0.3075。
[0021]實(shí)施例1
[0022]( I)培養(yǎng)基和氨基酸母液的配制:
[0023]①種子培養(yǎng)基:淀粉30g，葡萄糖5g，酵母浸粉2g，蛋白胨4g，MgSO4.7H200.5g,NaCl0.5g，K2HPO4L 5g，加水定容至 1L，121°C蒸汽滅菌 20min ；
[0024]②發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉40g，葡萄糖5g，蛋白胨2g，MgSO4.7Η200.5g，NaCl0.5g,K2HPO4Ig,加水定容至 1L，pH6.5，121°C蒸汽滅菌 20min ；
[0025]③脯氨酸母液:稱取0.3g脯氨酸，用超純水定容至IOOmL,通過(guò)0.2 μ m的無(wú)菌過(guò)
濾器，得無(wú)菌脯氨酸母液；
[0026](2)種子培養(yǎng):將利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus) E9CGMCC N0.3075 斜面接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)48h，得到一級(jí)種子；將一級(jí)種子以體積比為10%接種于裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)24h，得到二級(jí)種子；
[0027](3)添加脯氨酸發(fā)酵:將300ml所述二級(jí)種子在4500rpm離心10min，得到菌絲體，用300ml發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌絲體，然后按體積比為10%的接種密度接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，再加入IOOmL脯氨酸母液,在攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm,通氣量為2vvm, pH控制在6.5，發(fā)酵120h ；
[0028]同時(shí)以不添加脯氨酸母液的利迪鏈霉菌E9CGMCC N0.3075發(fā)酵作為對(duì)照。
[0029](4)利迪鏈菌素含量測(cè)定:
[0030]取發(fā)酵液在4°C，轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心10min，收集上清液，過(guò)0.22 μ m濾器，得濾
液；測(cè)定利迪鏈菌素含量。
[0031]發(fā)酵開始計(jì)時(shí)起的24小時(shí)，每3小時(shí)測(cè)一次葡萄糖含量(見圖1，圖中Control代表對(duì)照發(fā)酵，Proline代表添加脯氨酸發(fā)酵)。
[0032]在整個(gè)發(fā)酵 的120h，任意取6個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)干重(見圖2)，任意取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)利迪鏈菌素含量(見圖3)。[0033]發(fā)酵120h，添加脯氨酸發(fā)酵中利迪鏈菌素含量為174.5mg/L,未添加脯氨酸發(fā)酵中利迪鏈菌素含量為130.4mg/L。
[0034]實(shí)施例2
[0035]( I)培養(yǎng)基和氨基酸母液的配制:
[0036]①種子培養(yǎng)基:淀粉IOg,葡萄糖6g,酵母浸粉5g,蛋白胨5g, MgSO4.7H201g,NaCllg，K2HPO4Ig,加水定容至 1L，121°C蒸汽滅菌 20min ；
[0037]②發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉30g，葡萄糖 8g，蛋白胨 3g，MgSO4.7H201g, NaCllg, K2HPO4Ig,加水定容至1L, 121°C蒸汽滅菌20min ；
[0038]③脯氨酸母液:稱取Ig脯氨酸，用超純水定容至200mL，通過(guò)0.3 μ m的無(wú)菌過(guò)濾器，得無(wú)菌脯氨酸母液；
[0039]( 2 )種子培養(yǎng):同實(shí)施例1步驟(2 );
[0040](3)添加脯氨酸發(fā)酵:將200ml所述二級(jí)種子在4000rpm離心10min，得到菌絲體，用200ml發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌絲體，然后按體積比為10%的接種密度接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，再加入200mL脯氨酸母液,在攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm,通氣量為1.5vvm, pH控制在7，發(fā)酵IOOh0
[0041]同時(shí)以不添加脯氨酸母液的利迪鏈霉菌E9CGMCC N0.3075發(fā)酵作為對(duì)照。
[0042](4)利迪鏈菌素含 量測(cè)定:
[0043]取發(fā)酵液在30°C，轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心20min，收集上清液，過(guò)0.1 μ m濾器，得濾
液；測(cè)定利迪鏈菌素含量。
[0044]添加脯氨酸發(fā)酵中利迪鏈菌素含量為190.2mg/L,未添加脯氨酸發(fā)酵中利迪鏈菌素含量為128.4mg/Lo
[0045]實(shí)施例3
[0046]( I)培養(yǎng)基和氨基酸母液的配制:
[0047]①種子培養(yǎng)基:淀粉50g，葡萄糖lg，酵母浸粉lg，蛋白胨lg，MgSO4.7H200.lg，NaCl0.lg, K2HPO40.lg，加水定容至 1L，121°C蒸汽滅菌 20min ；
[0048]②發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉IOg,葡萄糖lg，蛋白胨lg, MgSO4.7H200.lg, NaCl0.1g,K2HPO40.lg，加水定容至1L，121°C蒸汽滅菌20min ；
[0049]③脯氨酸母液:稱取0.1g脯氨酸，用超純水定容至50mL，通過(guò)0.1 μ m的無(wú)菌過(guò)濾器，得無(wú)菌脯氨酸母液；
[0050](2 )種子培養(yǎng):同實(shí)施例1步驟(2 );
[0051](3)添加脯氨酸發(fā)酵:將100mL所述二級(jí)種子在3000rpm離心20min，得到菌絲體，用100mL發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌絲體，然后按體積比為5%的接種密度接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，再加入50mL脯氨酸母液,在攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm,通氣量為lvvm,pH控制在6,發(fā)酵150h。
[0052]同時(shí)以不添加脯氨酸母液的利迪鏈霉菌E9CGMCC N0.3075發(fā)酵作為對(duì)照。
[0053](4)利迪鏈菌素含量測(cè)定:
[0054]取發(fā)酵液在20°C，轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心5min，收集上清液，過(guò)0.45 μ m濾器，得濾
液；測(cè)定利迪鏈菌素含量。
[0055]添加脯氨酸發(fā)酵中利迪鏈菌素含量為154.7mg/L,未添加脯氨酸發(fā)酵中利迪鏈菌素含量為132.3mg/L。
[0056]實(shí)施例4
[0057]( I)培養(yǎng)基和氨基酸母液的配制: [0058]①種子培養(yǎng)基:淀粉100g，葡萄糖10g，酵母浸粉10g，蛋白胨10g，MgSO4.7H205g，NaC15g，K2HP045g，加水定容至 1L，121°C 蒸汽滅菌 20min ；
[0059]②發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉100g,葡萄糖IOg,蛋白胨10g, MgSO4.7H205g, NaC15g,K2HPO4IOg,加水定容至1L，121°C蒸汽滅菌20min ；
[0060]③脯氨酸母液:稱取5g脯氨酸,用超純水定容至500mL,通過(guò)0.45 μ m的無(wú)菌過(guò)濾器，得無(wú)菌脯氨酸母液；
[0061](2)種子培養(yǎng):同實(shí)施例1步驟(2);
[0062](3)添加脯氨酸發(fā)酵:將700ml所述二級(jí)種子在6000rpm離心3min，得到菌絲體，用700ml發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌絲體，然后按體積比為30%的接種密度接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，再加入500mL脯氨酸母液,在攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm,通氣量為3vvm, pH控制在8，發(fā)酵80h。
[0063]同時(shí)以不添加脯氨酸母液的利迪鏈霉菌E9CGMCC N0.3075發(fā)酵作為對(duì)照。
[0064](4)利迪鏈菌素含量測(cè)定:
[0065]取發(fā)酵液在25°C，轉(zhuǎn)速為lOOOOrpm，離心10min，收集上清液，過(guò)0.22 μ m濾器，得
濾液；測(cè)定利迪鏈菌素含量。
[0066]添加脯氨酸發(fā)酵中利迪鏈菌素含量為164.2mg/L,未添加脯氨酸發(fā)酵中利迪鏈菌素含量為120.4mg/Lo
[0067]實(shí)施例5
[0068]( I)培養(yǎng)基和氨基酸母液的配制:
[0069]①種子培養(yǎng)基:淀粉30g，葡萄糖5g，酵母浸粉2g，蛋白胨4g，MgSO4.7H200.5g,NaCl0.5g，K2HPO4L 5g，加水定容至 1L，121°C蒸汽滅菌 20min ；
[0070]②發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉40g，葡萄糖5g，蛋白胨2g，MgSO4.7Η200.5g，NaCl0.5g,K2HPO4Ig,加水定容至 1L，pH6.5，121°C蒸汽滅菌 20min ；
[0071]③脯氨酸母液:稱取0.3g脯氨酸，用超純水定容至IOOmL,通過(guò)0.2 μ m的無(wú)菌過(guò)
濾器，得無(wú)菌脯氨酸母液；
[0072](2)種子培養(yǎng):將利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus)NRRL2433 (ATCC N0.25470)斜面接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)48h，得到一級(jí)種子；將一級(jí)種子以體積比為10%接種于裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)24h，得到二級(jí)種子；
[0073](3)添加脯氨酸發(fā)酵:將300ml所述二級(jí)種子在4500rpm離心10min，得到菌絲體，用300ml發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌絲體，然后按體積比為10%的接種密度接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，再加入IOOmL脯氨酸母液,在攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm,通氣量為2vvm, pH控制在6.5，發(fā)酵120h ；
[0074]同時(shí)以不添加脯氨酸母液的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)NRRL2433 (ATCCN0.25470)發(fā)酵作為對(duì)照。
[0075](4)利迪鏈菌素含量測(cè)定:[0076]取發(fā)酵液在4°C，轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心10min，收集上清液，過(guò)0.22 μ m濾器，得濾
液；測(cè)定利迪鏈菌素含量。
[0077]發(fā)酵開始計(jì)時(shí)起的24小時(shí)，每3小時(shí)測(cè)一次葡萄糖含量(見圖1，圖中Control代表對(duì)照發(fā)酵，Proline代表添加脯氨酸發(fā)酵)。
[0078]在整個(gè)發(fā)酵的120h，任意取6個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)干重，任意取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)利迪鏈菌素含量。
[0079]發(fā)酵120h，添加脯氨酸發(fā)酵中利迪鏈菌素含量為104.5mg/L,未添加脯氨酸發(fā)酵中利迪鏈菌素含量 為76.8mg/L。
【權(quán)利要求】
1.一種提高利迪鏈菌素產(chǎn)量的方法，其特征是包括如下步驟: (1)培養(yǎng)基和氨基酸母液的配制: ①種子培養(yǎng)基:淀粉10~100g,葡萄糖1~10g,酵母浸粉1~10g,蛋白胨1~10g,MgSO4.7Η200.1 ~5g，NaC10.1 ~5g，K2HPO40.1 ~5g，加水定容至 1L，121°C蒸汽滅菌 20min ； ②發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉10~100g，葡萄糖1~10g，蛋白胨1~10g，MgSO4.7H200.1~5g，NaCl0.1 ~5g，K2HPO40.1 ~10g，加水定容至 1L，121°C蒸汽滅菌 20min ； ③脯氨酸母液:稱取0.1~5g脯氨酸，用超純水定容至50~500mL,通過(guò)0.1~0.45 μ m的無(wú)菌過(guò)濾器，得無(wú)菌脯氨酸母液； (2)種子培養(yǎng):將利迪鏈霉菌(Streptomyces1ydicus)在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng),得到一級(jí)種子；將一級(jí)種子在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到二級(jí)種子； (3)添加脯氨酸發(fā)酵:將100~700ml所述二級(jí)種子在3000~6000rpm離心3~20min,得到菌絲體，用100~700ml發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌絲體，然后按體積比為5%~30%的接種密度接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，再加入50~500ml脯氨酸母液，在攪拌轉(zhuǎn)速為200~600rpm,通氣量為1~3vvm, pH為6~8的條件下,發(fā)酵80~150h,得發(fā)酵液； (4)利迪鏈菌素含量測(cè)定: 取發(fā)酵液在4~30°C，轉(zhuǎn)速為8000~15000rpm，離心5~20min，收集上清液，過(guò)0.1~0.45 μ m濾器，得濾液；測(cè)定利迪鏈菌素含量。
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK103937850SQ201310022043
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2013年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月21日
【發(fā)明者】程景勝, 陳懇, 元英進(jìn), 梁英權(quán), 崔少飛 申請(qǐng)人:天津大學(xué)