超富集植物龍葵金屬硫蛋白（mt-l2）基因序列及其克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)中基因克隆領(lǐng)域，具體的說是一種超富集植物龍葵金屬硫蛋白（MT-L2）基因序列及其克隆方法。超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列為2型金屬硫蛋白基因，其基因序列為SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2中核苷酸序列所示。超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因的成功克隆和測序，為進(jìn)一步分析MT-L2影響下生物抗逆能力，為MT-L2其它功能的篩選及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】超富集植物龍葵金屬硫蛋白(MT-L2)基因序列及其克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)中基因克隆領(lǐng)域，具體的說是一種超富集植物龍葵金屬硫蛋白(MT-L2)基因序列及其克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金屬硫蛋白(Metallothionein, MTs)是一類低分子量、高Cys含量、具有金屬結(jié)合能力的多肽，最早在蓄積鎘的馬腎組織中發(fā)現(xiàn)，而在植物中分離的與動物MTs同源的蛋白被稱為植物類金屬硫蛋白(Metallothionein Like, MT-L)。最早是由Casterline和Barnett于1977年從大豆根中發(fā)現(xiàn)的。根據(jù)Cys的位置與排列方式，植物類金屬硫蛋白被分為三類。MT-Ll具有6個(gè)Cys-X-Cys單元，C端和N端結(jié)構(gòu)域各含3個(gè)，2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間是由約40個(gè)氨基酸殘基組成的不含Cys的間隔區(qū)，間隔區(qū)氨基酸殘基較多是絕大多數(shù)植物MT的共同特征；MT_L2與MT-Ll類似，但第一和第二個(gè)Cys以Cys-Cys形式出現(xiàn)，而且通常位于多肽鏈的第三和第四位，N端多有一個(gè)高度保守的序列MSCCGGNCGCG，C端結(jié)構(gòu)域有3個(gè)Cys-X-Cys單元，MT-Ll與MT-L2的最大區(qū)別在于前者的Cys集中分布在肽鏈的N端和C端，中間由一段不含Cys的間隔區(qū)相連，后者的Cys則散布在整個(gè)肽鏈中；MT-L3為非基因編碼產(chǎn)物，是以谷胱甘肽為底物酶促合成的多聚物，在N端有4個(gè)Cys，前面3個(gè)多以 Cys-Gly-Asn-Cys-Asp-Cys 方式排列，第四個(gè) Cys 通常包含 Gln-Cys-X-Lys-Lys-Gly 單元中，C端結(jié)構(gòu)域有6個(gè)Cys。MT-L4包含3個(gè)富含Cys的結(jié)構(gòu)域，每個(gè)都包含5_6個(gè)Cys殘基，結(jié)構(gòu)域之間為10-15個(gè)氨基酸殘基組成的間隔區(qū)，多數(shù)Cys以Cys-X-Cys的形式存在。MT-L通過Cys殘基上的-SH可以與CcUZn等重金屬離子螯合形成無毒或低毒的絡(luò)合物，還可以與重金屬等脅迫 條件誘發(fā)產(chǎn)生的自由基、ROS發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而降低氧化損傷。植物MT-L基因家族的成員大多數(shù)以單拷貝或兩個(gè)拷貝的方式分散在整個(gè)基因組中。植物MT-L基因表達(dá)具有組織器官特異性和發(fā)育階段特異性，目前研究最多的是金屬離子對植物MT-L基因表達(dá)的影響，已有研究報(bào)道植物MT-L基因與重金屬Cd的耐受性有一定相關(guān)性，但金屬離子影響MT-L基因表達(dá)的機(jī)理仍不十分清楚，特別是在重金屬超富集植物中MT-L基因究竟扮演何等角色是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0003]由ZL200410021546.1專利中可知龍葵(Solanum nigrum L.)為具有Cd超富集特征的植物，經(jīng)分析表明:龍葵在土壤中Cd含量為20-110mg/kg條件下，其植物葉片或莖中Cd含量范圍為110-496mg/kg，超過100mg/kg這一 Cd超富集植物應(yīng)達(dá)到的臨界含量標(biāo)準(zhǔn)，并且具有超富集植物的其它特征；植物盆栽試驗(yàn)表明:在Cd污染水平為25.0和50.0mg/kg時(shí)，該植物莖和葉中Cd含量超過100mg/kg這一 Cd超富集植物應(yīng)達(dá)到的臨界含量標(biāo)準(zhǔn)；小區(qū)試驗(yàn)和污染區(qū)采樣試驗(yàn)也表明:該植物也表現(xiàn)出Cd超富集植物的基本特征。此外，研究表明:龍葵生育期較短，通常只有80天左右，在沈陽地區(qū)采取花期收獲方式一年可收獲兩季，吉林和黑龍江地區(qū)至少可生長一季。其株高一般為80-150cm，生物量較大，根系分布廣，株型緊湊，非常適合作為重金屬Cd污染土壤的修復(fù)植物。因此，研究超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因?yàn)榻沂竞屠闷浣舛痉烙到y(tǒng)功能具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種超富集植物龍葵金屬硫蛋白(MT-L2)基因序列及其克隆方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列，超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列為2型金屬硫蛋白基因，其基因序列為SEQ ID N0.1和/或SEQ ID N0.2中核苷酸序列所示。
[0007]超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列編碼蛋白，超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列編碼蛋白為SEQ ID N0.3和/或SEQ ID N0.4中氨基酸序列所示。
[0008]超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列的克隆方法，首先從鮮活的龍葵葉片中提取總RNA;然后利用反轉(zhuǎn)錄酶AMV和反轉(zhuǎn)錄引物(隨機(jī)引物)合成第一鏈cDNA ;而后以合成的第一鏈 cDNA 為模板，利用兼并引物 MT-L2-F (5’-ATGTCTTGCTGTGGAGGAAN-3，)和 MT-L2-R(5，-GATCCACATTTGCAGCCATT-3’ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物克隆至pMD_18T載體后，取陽性克隆經(jīng)測序最終獲得超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列SEQ ID N0.1和/或SEQID N0.2。
[0009]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0010]1.采用本發(fā)明對超 富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因的成功克隆和測序，首次確定其全部編碼序列，從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列，該序列可以用以設(shè)計(jì)引物再克隆該基因，也可以根據(jù)該序列或該序列所推導(dǎo)的氨基酸序列對該基因進(jìn)行重組表達(dá)或基因轉(zhuǎn)移。
[0011]2.超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因的成功克隆和測序，為進(jìn)一步分析MT-L2影響下生物抗逆能力，為MT-L2其它功能的篩選及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)；
[0012]3.利用本發(fā)明所得MT-L2基因?qū)Σ煌瑵舛任廴疚锏谋磉_(dá)情況來作為重金屬超富集植物篩選工具提供了方法學(xué)的指導(dǎo)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明實(shí)施例2提供的超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因PCR的電泳圖。
[0014]圖2為本發(fā)明實(shí)施例3提供的Cd脅迫處理能夠顯著誘導(dǎo)MT-L2表達(dá)的效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明通過對GeneBank中龍葵2型金屬硫蛋白基因序列進(jìn)行比對分析，利用ABI公司的Primer Express Software v2.0軟件分析所有龍葵2型金屬硫蛋白基因序列的同源性區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物；其克隆方法包括:(1)通過分析龍葵2型金屬硫蛋白基因的同源性區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物MT-L2-F和MT-L2-R ; (2)從鮮活的超富集植物龍葵葉片中提取總RNA ；(3)利用反轉(zhuǎn)錄酶AMV和反轉(zhuǎn)錄引物(隨機(jī)引物)合成第一鏈cDNA ； (4)以合成的第一鏈cDNA為模板，利用兼并引物MT-L2-F和MT-L2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小約為200bp ;此外，所述兼并引物還可以為序列表中SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2核苷酸序列片段；(5)克隆及測序最終獲得超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因核苷酸序列SEQ ID N0.1或SEQ IDN0.2。
[0016]本發(fā)明首次從超富集植物龍葵中克隆到兩種2型金屬硫蛋白基因:MT_L2a序列cDNA全長243bp，其中開放閱讀框位于1-242位核苷酸，編碼80個(gè)氨基酸殘基；MT_L2b序列cDNA全長270bp,其中開放閱讀框位于1-261位核苷酸,編碼86個(gè)氨基酸殘基。
[0017]實(shí)施例1
[0018]龍葵MT_L2a 基因如 SEQ ID N0.1 所示:
[0019]atgtcttgct gtggaggaag ctgtggctgt ggatctggct gcaagtgcggcagtggctgtggaggatgtg ggatgtaccc tgacttggag agcaccacta cctttaccatcattgagggtgttgcaccta tgatgaacta tggaaaggtt gagggaggac ctaagaatgcaacagaaggtggaaatggct gcaaatgtgg atcaatctct agaggatccc cgggtaccga gctcgaatcgtaa
[0020](a)序列特征:
[0021]?長度:243bp 1-242位核苷酸
[0022]?類型:核苷酸序列
[0023]籲鏈型 :單鏈
[0024]?拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
[0025](b)分子類型:雙鏈DNA
[0026](C)假設(shè):否
[0027](d)反義:否
[0028]( e )最初來源:龍葵
[0029]龍葵MT_L2b 基因如 SEQ ID N0.2 所示:
[0030]atgtcttgct gtggaggaag ctgtggctgt ggatctggct gcaagtgcggcagtggctgtggaggatgtg ggatgtaccc tgacttggag agcaccacta cctttaccatcattgagggtgttgcaccta tgatgaacta tggaaaggtt gagggaggac ctaagaatgcaacagaaggaggaaatggct gcaaatgtgg atcaatcgtc gacctgcagg catgcaagcttggcactggccgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa
[0031](a)序列特征:
[0032]?長度:270bpl_261位核苷酸
[0033]?類型:核苷酸序列
[0034]籲鏈型:單鏈
[0035]?拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
[0036](b)分子類型:雙鏈DNA
[0037](C)假設(shè):否
[0038](d)反義:否
[0039]( e )最初來源:龍葵
[0040]實(shí)施例2龍葵MT-L2基因的克隆方法
[0041]從龍葵中克隆上述MT-L2基因的方法為:
[0042](I)從鮮活的超富集植物龍葵葉片中提取總RNA ；
[0043](2)以總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶AMV和隨機(jī)引物(Random Primers,Invitrogen,美國)合成第一鏈cDNA ；
[0044](3)以合成的第一鏈cDNA為模板，利用兼并引物MT-L2-F和MT-L2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小約為200bp (見圖1)；
[0045](4)將PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體后，取多個(gè)陽性克隆經(jīng)測序最終獲得超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列MT-L2a和MT_L2b。
[0046]其中所述引物包括:
[0047]MT-L2-F:5’ -ATGTCTTGCTGTGGAGGAAN-3’
[0048]MT-L2-R:5’ -GATCCACATTTGCAGCCATT-3’
[0049]具體操作條件如下:
[0050]1.RNA提取步驟
[0051](I)總 RNA 提取:
[0052]稱取1.5g葉片組織放入用液氮預(yù)冷過的碾缽中，在液氮中研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)至無 RNA 酶、無熱源的 1.5ml Eppendorf 管中，加 Iml Trizol,用 QIAGEN Tissue Ruptor 勻漿；室溫放置10分鐘，加200 μ I氯仿，充分混勻，15000rpm離心5分鐘；取上清，至1.5mlEppendorf管加600 μ I氯仿，混勻，15000rpm離心5分鐘；取上清，至1.5ml Eppendorf管加500ul異丙醇,混勻，15000rpm離心10分鐘；棄上清,用預(yù)冷的75%乙醇Iml沖洗，13000rpm離心5分鐘；棄上清，RNA沉淀于空氣中干燥3分鐘；將干燥后的RNA溶解于DEPC處理水中，至完全溶解。將總RNA作適當(dāng)稀釋后，紫外分光光度計(jì)測OD26tZOD28tl的比值，并定量。定量公式:RNA濃度(μ g/ml) =OD260值X 40 X稀釋倍數(shù)(本實(shí)驗(yàn)為400倍)
[0053]2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
[0054](I)按下列順序在1.5ml離心管中加入下列組份:
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種超富集植物龍葵金屬硫蛋白(MT-L2)基因序列，其特征在于:超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列為2型金屬硫蛋白基因，其基因序列為SEQ ID N0.1和/或SEQ IDN0.2中核苷酸序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列編碼蛋白，其特征在于:超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列編碼蛋白為SEQ IDN0.3和/或SEQ ID N0.4中氨基酸序列所示。
3.—種權(quán)利要求1所述的超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列的克隆方法，其特征在于:首先從鮮活的龍葵葉片中提取總RNA;然后利用反轉(zhuǎn)錄酶AMV和反轉(zhuǎn)錄引物合成第一鏈cDNA ;而后以合成的第一鏈cDNA為模板，利用兼并引物MT-L2-F(5，-ATGTCTTGCTGTGGAGGAAN-3，)和 MT-L2-R (5，-GATCCACATTTGCAGCCATT-3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體后，取多個(gè)陽性克隆經(jīng)測序最終獲得超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列SEQ ID N0.1和/或SEQ ID N0.2。
【文檔編號】C12N15/29GK103937809SQ201310023804
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月22日
【發(fā)明者】張倩茹, 魏樹和, 焦洪靜 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所