專利名稱：頂體蛋白的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及頂體蛋白的用途及制備方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康，威脅人類生命的主要疾病之一，已成為人類致死的首要原因。據(jù)統(tǒng)計，中國每年有160萬人死于癌癥，世界上每年有740萬人死于癌癥。雖然目前治療癌癥的藥物和治療手段不斷在更新，但癌癥發(fā)病率和死亡率仍在不斷增加，預(yù)計2030年全世界將有超過1200萬人死于癌癥。癌是機體正常細(xì)胞快速產(chǎn)生異常細(xì)胞，并發(fā)生轉(zhuǎn)移，擴散到其他器官，同時異常細(xì)胞增生過程中，吸收營養(yǎng)，破壞人體免疫力和抵抗力，導(dǎo)致機體功能紊亂，失去平衡，最終導(dǎo)致人死亡。目前國際上對癌癥病因及發(fā)病機理尚未完全認(rèn)識，對于癌癥的治療，常規(guī)療法無外乎手術(shù)治療、藥物化療、放射性治療和以毒攻毒等。他們對癌癥的治療雖能起一定作用，使部分患者病情暫時好轉(zhuǎn)，但容易再次復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，同時正常的組織細(xì)胞及機體免疫力不可避免地在治療過程中受損，給患者帶來難以忍受的痛苦和食欲不振、嘔吐、發(fā)燒、大小便失禁、抑郁、失眠等癥狀，患者生活質(zhì)量嚴(yán)重降低。經(jīng)過傳統(tǒng)的化學(xué)治療后，患者會頭發(fā)脫落、骨瘦如柴，不能飲食吞咽。致使許多患者未死于癌癥而死于放化療和手術(shù)。當(dāng)這些弊端日益顯現(xiàn)時，一些人進而轉(zhuǎn)向基因和免疫學(xué)等途徑，但迄今未取得實質(zhì)性的進展。專利CN200710017785. 3已描述了動物精液藥材在治療腫瘤、抑郁癥等多種疾病中的藥物應(yīng)用，專利申請201010219062. 3描述了動物精液凍干粉的制備方法。但精液的主要成分為水，約占90%以上，在有形成分中，除成熟精子外，尚有1%的其他細(xì)胞，如未成熟的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞以及生殖管道脫落的上皮細(xì)胞和少量白細(xì)胞，除細(xì)胞外，精液內(nèi)還含有脂肪及蛋白質(zhì)顆粒、色素顆粒、前列腺液的磷脂小體，無機鹽、酶類、乳酸及果糖等；現(xiàn)有技術(shù)并未確定動物精液中何種物質(zhì)起到治療腫瘤、抑郁癥等疾病的作用，直接應(yīng)用動物精液制備的藥物純度也較低，因此效用較差，患者的服用劑量大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的頂體蛋白的提取方法，主要解決了現(xiàn)有應(yīng)用動物精液制備治療腫瘤、抑郁癥等多種疾病中的藥物純度低、需服用的劑量大及精液中的非特異性蛋白、脂肪和糖類化合物等雜質(zhì)對治療效果的干擾的問題；本發(fā)明提供的頂體蛋白的提取方法，極大地提高了藥物的純度和藥效，突破了現(xiàn)有技術(shù)的局限性。本發(fā)明的具體技術(shù)解決方案如下頂體蛋白可以用于抑制癌細(xì)胞的擴散， 尤其是用于抑制MCF-7、Bel7402、BGC823、A2780、A549或HCT-8細(xì)胞的擴散。頂體蛋白在制備治療癌癥、抑郁癥的藥物中的應(yīng)用。癌癥包括婦科腫瘤、消化道腫瘤、肺癌、肝癌、白血病和惡性淋巴瘤；婦科腫瘤包括子宮肌瘤、卵巢癌、乳房瘤、乳腺癌和宮頸癌；消化道腫瘤包括食道癌、胃癌、大腸癌。頂體蛋白可以用于制備膠囊、顆粒、片劑、滴丸、中西藥復(fù)方制劑、口服液或注射液。本發(fā)明頂體蛋白提純通過下述方法得到I]取動物精液或復(fù)溶的動物精液凍干粉，動物精液一般選擇健康驢、牛、羊或馬的精液，其中優(yōu)選為驢精液；向其中加入濃度為19Γ5%的稀酸溶液，再加入無機酸將pH調(diào)節(jié)至2 5，以2000r/mirT8000r/min的轉(zhuǎn)速離心15 30min后棄去沉淀物，較佳范圍為離心轉(zhuǎn)速2500r/mirT6000r/min，離心時間7 20min ;然后將得到的上清液合并，濃縮；其中，1% 5%的稀酸溶液可選醋酸溶液、甲酸溶液、丙酸溶液、丁酸溶液、鹽酸溶液、氫溴酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液等，其中優(yōu)選為醋酸溶液，稀酸溶液濃度為1°/Γ5%，較佳范圍為1. 7% 4. 5%，優(yōu)選為2% ;調(diào)節(jié)pH的無機酸為lmol/L的硫酸、鹽酸、氫溴酸或磷酸，其中優(yōu)選為鹽酸；無機酸調(diào)節(jié)pH范圍為2 5，優(yōu)選為2. 81. 6，最佳pH為3 ;其中動物精液與稀酸的質(zhì)量比為1: f 1:20，較佳范圍為1:2 1:15，最優(yōu)比為1:4 ;動物精液凍干粉與復(fù)溶溶劑水的質(zhì)量比為1: f 1:20，較佳范圍為1:5 1:15，最優(yōu)比為1:10，其中動物精液凍干粉復(fù)溶溶液與稀酸的質(zhì)量比為1:1 1:16，較佳范圍為1:2 1:12，最優(yōu)比為1:5. 5 ;2]向步驟I處理所得的上清液中加入無機銨鹽，調(diào)節(jié)飽和度至O. 2-0. 5后在4°C環(huán)境中放置3-5小時，飽和度的調(diào)節(jié)的較佳范圍為O. 25-0. 48，優(yōu)選為O. 3 ;再以2000r/min 8000r/min離心15 30min,較佳范圍為離心轉(zhuǎn)速2500r/min 6000r/min,離心時間7^20min ;然后棄去上清液，沉淀用醋酸緩沖溶液溶解后，得到頂體蛋白粗提物；無機銨鹽包括硫酸銨、硫酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫銨、磷酸銨等，其中優(yōu)選的為硫酸銨；醋酸緩沖溶液為O. lmol/L, pH為1. 8^4,較佳范圍為2 3. 5，優(yōu)選pH為2 ;3]將經(jīng)步驟3處理所得的蛋白粗提物進行柱層析，用醋酸緩沖溶液平衡洗脫，處理完成后收集洗脫液；一般是用葡聚糖凝膠柱、羥丙基葡聚糖凝膠柱、丙烯酰胺凝膠柱或瓊脂糖凝膠柱進行柱層析，其中優(yōu)選的為葡聚糖凝膠柱和羥丙基葡聚糖凝膠柱；醋酸緩沖溶液是pH=2，0. lmol/L的醋酸緩沖溶液，醋酸緩沖溶液平衡洗脫的流速為O. 5ml/min，處理完成后收集在680nm處有最大吸收的洗脫液；4]將洗脫液以2000r/min 8000r/min離心5 IOmin,棄去上清液,所得沉淀洗漆后以2000r/mirT8000r/min繼續(xù)離心f 3次，每次離心5 10min，收集沉淀，即得到頂體蛋白。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明通過大量的實驗研究，突破現(xiàn)有技術(shù)應(yīng)用上的局限性，獲取了頂體蛋白在治療子宮肌瘤、乳房瘤、胃癌、肺癌、肝癌、白血病、大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、惡性淋巴瘤及治療抑郁癥等疾病的藥物中的應(yīng)用；極大地提高了該類藥物的純度，并降低了患者的服用劑量和動物精液凍干粉中含有的其他物質(zhì)可能造成的影響。經(jīng)檢測，動物精液中頂體蛋白含量約為O. P/Γο. 4%。經(jīng)提純后，頂體蛋白含量大于90%，與動物精液或其凍干粉相比，藥物濃度得到了很大提高，并且剔除了精液中的非特異性蛋白、脂肪和糖類化合物，從藥效上提高抗腫瘤活性，并且降低了服用劑量，更方便臨床應(yīng)用?？芍瞥煽芍瞥赡z囊、顆粒、片劑、滴丸、口服液、注射液等各種制劑應(yīng)用于臨床，優(yōu)選為膠囊。本品也可與其他藥物制成中西藥復(fù)方制劑應(yīng)用。
具體實施例方式頂體蛋白是卵子與精子受精過程中所不可缺少的生物活性物質(zhì)。其化學(xué)成分為絲氨酸蛋白溶解類物質(zhì)，可溶解卵膜。當(dāng)卵子和精子都成功地被輸送到受精部位時，精子的頭部一旦接觸到卵子表面時，位于其頭部頂端的細(xì)胞器之一的頂體就隨之發(fā)生頂體反應(yīng)，由頂體部分伸長為頂體絲，并分泌出多種酶蛋白，即頂體蛋白，頂體蛋白溶解卵膜，使精子頭部穿透卵的放射冠和透明帶，而進入卵子，完成受精過程。因此，頂體蛋白活性臨床上常成為精液分析評價精子功能的定量指標(biāo)。頂體蛋白可通過對冷凍保存的精子使用去垢劑，聲處理和低pH等方法提取，并用凝膠過濾，離子交換層析，等電聚集，親和層析和電泳等生化技術(shù)，可獲得純頂體蛋白。但不同哺乳動物和采用的不同分離方法所得到的頂體蛋白分子量差異較大，如人頂體素為30KD 70KD，而豬的約為41KD 56KD。頂體素分子是由酶原區(qū)、催化區(qū)、尾區(qū)三部分組成，其中酶原區(qū)、催化區(qū)氨基酸序列無種屬差異，尾區(qū)有種屬差異。經(jīng)藥效學(xué)實驗證實，頂體蛋白對MCF-7、Bel7402、BGC823、A2780、A549及HCT-8六種人癌細(xì)胞株有抑制作用，對小鼠S180腫瘤抑制作用明顯，與動物精液凍干粉相比，抑瘤作用明顯，同時藥用劑量也顯著降低。同時本品與化療藥物聯(lián)用能明顯增加對化療藥物治療腫瘤的治療作用，提示本品有應(yīng)用于治療腫瘤的廣泛前景。人體臨床應(yīng)用情況表明，本品治療癌癥有實質(zhì)性的臨床應(yīng)用效果；將動物精液提純得到頂體蛋白屬于重大創(chuàng)新和發(fā)明，有利于降低患者服藥劑量 ，為上述疾病的治療提供了一種新的藥用物質(zhì)。頂體蛋白可制成膠囊、顆粒、片劑、滴丸、口服液、注射液等各種制劑應(yīng)用于臨床，優(yōu)選為膠囊，頂體蛋白具有較好的穩(wěn)定性，優(yōu)選的膠囊在遮光、密封條件下可保存24個月，可穩(wěn)定有效的應(yīng)用于臨床。本品也可與其他藥物制成中西藥復(fù)方制劑應(yīng)用。以下結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明實施例1 :向Ikg動物精液中加入禮的2%醋酸溶液，用lmol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH為3，以5000r/min轉(zhuǎn)速離心20min,棄去沉淀物,上清液合并,濃縮；上清液加硫酸銨至飽和度為O. 3，于4 °C放置4小時，以3000r/min轉(zhuǎn)速離心20min,棄去上清液。沉淀用O. lmol/L (pH2)的醋酸溶液溶解即得頂體蛋白粗提物柱層析將粗提物用Sephadex G-25凝膠柱進行柱層析，以O(shè). lmol/L (pH2)的醋酸緩沖溶液平衡洗脫，流速為O. 5ml/min。用紫外分光光度法檢測，收集按Lowry法在680nm處有最大吸收的洗脫液；將洗脫液以3000r/min離心lOmin，棄去上清液，所得沉淀用純蒸餾水洗滌后繼續(xù)離心，收集沉淀，即得到頂體蛋白，收率為O. 133%，用ELISA定量檢測法測定頂體蛋白含量，含量92%。實施例2
將50g動物精液凍干粉用500ml蒸餾水溶化，加入3L的3%醋酸溶液，用lmol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH為4,以6000r/min轉(zhuǎn)速離心15min,棄去沉淀物,上清液合并,濃縮；上清液加硫酸銨至飽和度為0.4，于4°C放置4小時，以3500r/min轉(zhuǎn)速離心15min,棄去上清液,沉淀用O. lmol/L (pH2. 5)的醋酸緩沖溶液溶解即得頂體蛋白粗提物；柱層析將粗提物用Sephadex LH-20凝膠柱進行柱層析，以O(shè). lmol/L (pH2)的醋酸緩沖溶液平衡洗脫，流速為O. 5ml/min ;用紫外分光光度法檢測，收集按Lowry法在680nm處有最大吸收的洗脫液；將洗脫液以3000r/min離心IOmin,棄去上清液,所得沉淀用純蒸懼水洗漆后繼續(xù)離心，收集沉淀，即得到頂體蛋白，收率為2. 8%，用ELISA定量檢測法測定頂體蛋白含量，含量大于93. 7%。頂體蛋白的藥效學(xué)實驗如下MTT 試驗用胰酶消化 MCF-7、Bel7402、BGC823、A2780、A549 及 HCT-8 六種人癌細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞所)，以含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，濃度為104/ml，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔接種100 μ I (1000個細(xì)胞/孔)。用培養(yǎng)基稀釋藥物，設(shè)6個濃度:10、20、40、80、160、320μ g/ml，每組設(shè)三個平行孔，每孔加樣O. lml。置37。。、5% CO2孵箱中培養(yǎng)96小時后棄去培養(yǎng)液，每孔加入O.1mlO. 5%MTT溶液(RPMI1640配制)。37°C保溫4小時,棄上清,每孔加入DMS00.1ml溶解Formazan顆粒,振蕩混勻,用酶標(biāo)儀檢測(參比波長450nm、檢測波長570nm)，計算藥物對細(xì)胞生長的抑制率。表1. MTT法觀察頂體蛋白對人癌細(xì)胞株的生長抑制作用結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種頂體蛋白的制備方法，其特殊之處在于，包括以下步驟 1]取動物精液或復(fù)溶的動物精液凍干粉，向其中加入濃度為1°/Γ5%的稀酸溶液，再加入無機酸將pH調(diào)節(jié)至2 5,以2000r/min 8000r/min的轉(zhuǎn)速離心15 30min后棄去沉淀物，將得到的上清液合并，濃縮；選取動物精液時，動物精液與稀酸的質(zhì)量比為1:1 1:20 ;選取動物精液凍干粉時，動物精液凍干粉與復(fù)溶溶劑水的質(zhì)量比為1: Γ1:20，動物精液凍干粉復(fù)溶溶液與稀酸的比例為質(zhì)量比為1:廣1:16 ; 2]向步驟I處理所得的上清液中加入無機銨鹽，調(diào)節(jié)飽和度至O.2-0. 5后放置3-5小時,再以2000r/min"8000r/min離心15 30min,棄去上清液,沉淀用醋酸緩沖溶液溶解后，得到頂體蛋白粗提物； 3]將經(jīng)步驟3處理所得的蛋白粗提物進行柱層析，用醋酸緩沖溶液平衡洗脫，處理完成后收集洗脫液； 4]將洗脫液以2000r/min"8000r/min離心5 10min,棄去上清液,所得沉淀洗漆后以2000r/mirT8000r/min繼續(xù)離心廣3次，每次離心5 10min，收集沉淀，即得到頂體蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的頂體蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟I中，稀酸溶液是濃度為1. 7% 4· 5%的醋酸溶液、甲酸溶液、丙酸溶液、丁酸溶液、鹽酸溶液、硫酸溶液或磷酸溶液，調(diào)節(jié)PH的無機酸為lmol/L的硫酸、鹽酸、氫溴酸或磷酸，調(diào)節(jié)pH至2. 8 4. 6 ;動物精液與稀酸的質(zhì)量比為1:4 ;選取動物精液凍干粉時,動物精液凍干粉與復(fù)溶溶劑水的質(zhì)量比為1:10,動物精液凍干粉復(fù)溶溶液與稀酸的比例為質(zhì)量比為1:5. 5 ;所述步驟2中無機銨鹽是硫酸銨、硫酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫銨或磷酸銨，調(diào)節(jié)飽和度至O. 3后在4°C環(huán)境中放置3-5小時；所述醋酸緩沖溶液是pH=2,0. lmol/L的醋酸緩沖溶液；所述步驟3中，是用葡聚糖凝膠柱、羥丙基葡聚糖凝膠柱、丙烯酰胺凝膠柱或瓊脂糖凝膠柱進行柱層析，所述醋酸緩沖溶液是pH=2，0. lmol/L的醋酸緩沖溶液，醋酸緩沖溶液平衡洗脫的流速為O. 5ml/min,處理完成后收集在680nm處有最大吸收的洗脫液；所述步驟4中，洗滌沉淀使用純蒸餾水；所述步驟I至4中的離心轉(zhuǎn)速為2500r/mirT6000r/min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的頂體蛋白，其特征在于所述動物精液凍干粉為健康驢、牛、羊或馬的精液凍干粉。
全文摘要
本發(fā)明提供的頂體蛋白的提取方法，極大地提高了藥物的純度和藥效，突破了現(xiàn)有技術(shù)的局限性。獲取了頂體蛋白在治療子宮肌瘤、乳房瘤、胃癌、肺癌、肝癌、白血病、大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、惡性淋巴瘤及治療抑郁癥等疾病的藥物中的應(yīng)用；極大地提高了該類藥物的純度，并降低了患者的服用劑量和動物精液凍干粉中含有的其他物質(zhì)可能造成的影響。
文檔編號C12N9/64GK103060293SQ201310025130
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月13日
發(fā)明者李偃, 程輝 申請人:陜西精健新星生物醫(yī)藥有限公司