Srrp35基因和表達(dá)產(chǎn)物在癌癥診斷與治療中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種SRRP35基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，用于制備癌癥診斷及治療的產(chǎn)品。本發(fā)明的SRRP35基因及其表達(dá)產(chǎn)物，可作為診斷癌癥尤其是肝癌的特異性標(biāo)志基因；本發(fā)明的SRRP35基因及其表達(dá)產(chǎn)物，還可作為制備治療癌癥尤其是肝癌藥物的靶基因，提供新的癌癥治療途徑。
【專(zhuān)利說(shuō)明】SRRP35基因和表達(dá)產(chǎn)物在癌癥診斷與治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及SRRP35基因和表達(dá)產(chǎn)物在癌癥檢測(cè)方面的應(yīng)用，尤其是在肝癌的檢測(cè)的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及SRRP35基因、蛋白及其激動(dòng)劑在癌癥治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma, HCC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤,其死亡率位居第二。肝癌的診斷，尤其是早期診斷，是臨床診療和預(yù)后的關(guān)鍵?？捎米髟l(fā)性肝癌標(biāo)志物的生物分子，通常認(rèn)為有以下四類(lèi):癌胚和糖蛋白抗原；酶和同工酶；細(xì)胞因子；基因。在全球范圍內(nèi)，對(duì)肝癌的定性診斷以檢測(cè)血清AFP (甲胎蛋白)為主，但AFP的敏感性(40%~65%)和特異性(76%~96%)均不令人滿(mǎn)意。
[0003]此外，肝癌的治療在過(guò)去20年里取得了很大的進(jìn)展，出現(xiàn)了一些局部非手術(shù)治療方案，但是，由于目前肝癌的化療藥物基本沿用其他腫瘤的治療藥物，針對(duì)性較差，因此，總體療效不佳。[0004]因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)可用于肝癌診斷的相關(guān)蛋白，為了有效地抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)可用于抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物，以提高化療的特異性和有效性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開(kāi)了一種人SRRP35基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，用于制備癌癥尤其是肝癌的診斷及治療產(chǎn)品。
[0006]本發(fā)明的第一方面提供了一種SRRP35基因或SRRP35蛋白的用途，用于制備檢測(cè)癌癥的試劑或試劑盒；
[0007]在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥是肝癌。
[0008]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒包括:對(duì)SRRP35蛋白或mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑以及相應(yīng)的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)。
[0009]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括SRRP35特異性引物、特異性抗體、探針和/或芯片。
[0010]在另一優(yōu)選例中，上述的試劑包括檢測(cè)用芯片，包括核酸芯片和蛋白質(zhì)芯片。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述的核酸芯片包括基片和點(diǎn)樣在基片上的癌癥相關(guān)基因的特異性寡核苷酸探針，所述的癌癥相關(guān)基因的特異性寡核苷酸探針包括與SRRP35基因或mRNA特異性結(jié)合的探針。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白質(zhì)芯片包括基片和點(diǎn)樣在基片上的癌癥相關(guān)蛋白的特異性抗體，所述的癌癥相關(guān)蛋白的特異性抗體包括抗SRRP35蛋白的特異性抗體。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的SRRP35蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0014]本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測(cè)癌癥的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測(cè)SRRP35蛋白或mRNA的檢測(cè)試劑；以及標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)，所述標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)注明所述試劑盒用于檢測(cè)癌癥。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)中注明以下內(nèi)容:
[0016]當(dāng)檢測(cè)對(duì)象的SRRP35相對(duì)β -肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量與癌旁組織的SRRP35相對(duì)肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量之比≤ 1，則提示該檢測(cè)對(duì)象患癌癥的幾率高于普通人群。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)試劑包括:特異性引物、特異性抗體、探針和/或芯片;
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于檢測(cè)人腫瘤組織樣品或血液樣品；
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤組織樣品為肝癌樣品。
[0020]本發(fā)明的第三方面，提供了一種SRRP35蛋白、SRRP35基因或其激動(dòng)劑的用途，用于制備抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的藥物，或用于制備治療癌癥的藥物。
[0021]本發(fā)明的第四方面，提供了一種體外非治療性的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法，包括步驟:在SRRP35蛋白或其激動(dòng)劑存在下，培養(yǎng)癌細(xì)胞，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括向癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加SRRP35激動(dòng)劑，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的癌細(xì)胞是肝癌細(xì)胞。
[0024]本發(fā)明的第五方面，提供了一種篩選治療癌癥的候選化合物的方法，包括步驟:
[0025](a)測(cè)試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察所述測(cè)試組的細(xì)胞中SRRP35的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察對(duì)照組的所述細(xì)胞中SRRP35的表達(dá)量和/或活性；
[0026]其中，如果測(cè)試組中細(xì)胞的SRRP35的表達(dá)量和/或活性大于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)SRRP35的表達(dá)和/或活性有促進(jìn)作用的治療癌癥的候選化合物。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞包括:癌細(xì)胞或正常細(xì)胞；
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞為肝癌細(xì)胞或肝細(xì)胞。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟:
[0030](b)對(duì)于步驟(a)中獲得的候選化合物，進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的抑制作用。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中包括步驟:測(cè)試組中，癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；在對(duì)照組中，在癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；其中，如果測(cè)試組中癌細(xì)胞的數(shù)量或生長(zhǎng)速度小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖有抑制作用的治療癌癥的候選化合物。
[0032]本發(fā)明的第六方面，還提供了一種抑制或治療癌癥的方法，包括步驟:給需要治療的對(duì)象(哺乳動(dòng)物)施用安全有效量的SRRP35激動(dòng)劑的用途。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥包括肝癌。
[0034]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1A為實(shí)施例1中實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SRRP35基因在32例肝癌病人癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況示意圖，其中，“N”指癌旁組織，“C”指肝癌組織。結(jié)果顯示20例(62.5%)病人的癌組織中SRRP35基因表達(dá)量低于相應(yīng)的癌旁組織。
[0036]圖1B顯示了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SRRP35基因在人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)模式。
[0037]圖2A顯示了 SRRP35在肝癌細(xì)胞株Sk-1fep-1和WRL-68中的過(guò)表達(dá)情況，說(shuō)明SRRP35在真核表達(dá)載體中成功表達(dá)。
[0038]圖2B顯示了過(guò)表達(dá)的SRRP35蛋白減弱了肝癌細(xì)胞株Sk-Hep-1和WRL-68的克隆形成能力。
[0039]圖2C顯示了過(guò)表達(dá)的SRRP35蛋白抑制Sk-1fep-1和WRL-68細(xì)胞的增值。
[0040]圖3A顯示了人工合成的SiRNA有效的干擾了 SRRP35基因的表達(dá)。
[0041]圖3B顯示了通過(guò) RNA干擾的方法沉默SRRP35的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞Huh_7和H印3B的增值。
[0042]圖4顯示了通過(guò)RNA干擾的方法沉默SRRP35的表達(dá)提高了肝癌細(xì)胞Huh_7和Hep3B在軟瓊脂中的克隆形成能力，進(jìn)而說(shuō)明SRRP35抑制肝癌細(xì)胞的惡性表征。
[0043]圖5A顯示了過(guò)表達(dá)的SRRP35基因抑制肝癌細(xì)胞WRL-68在裸鼠皮下形成腫瘤的能力。無(wú)論在體積和腫瘤重量上SRRP35過(guò)表達(dá)組都比對(duì)照組小和輕，同時(shí)兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0044]圖5B顯示了沉默SRRP35基因表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞Huh_7在裸鼠皮下形成腫瘤的能力。無(wú)論在體積和腫瘤重量上SRRP35沉默表達(dá)組都比對(duì)照組大和重，同時(shí)兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【具體實(shí)施方式】
[0045]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，SRRP35在癌組織中低表達(dá)，而在癌旁組織及正常組織中高表達(dá)，因此SRRP35可作為癌癥檢測(cè)的標(biāo)志物用于檢測(cè)或輔助性檢測(cè)癌癥。此外，SRRP35的激動(dòng)劑可抑制癌細(xì)胞(尤其是肝癌細(xì)胞)的生長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0046]本發(fā)明人還以真核表達(dá)載體系統(tǒng)為介導(dǎo)系統(tǒng)，在肝癌細(xì)胞Sk-h印-1和WRL-68中過(guò)表達(dá)SRRP35基因(經(jīng)鑒定過(guò)表達(dá)倍數(shù)為大于20倍)。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):SRRP35基因的過(guò)表達(dá)明顯抑制肝癌細(xì)胞Sk-hep-Ι和WRL-68的生長(zhǎng)。因此，可將SRRP35基因用于肝癌的基因治療。
[0047]SRRP35蛋白和多核苷酸
[0048]在本發(fā)明中，“本發(fā)明蛋白”、“本發(fā)明多肽”、“SRRP35蛋白”可互換使用，指簡(jiǎn)稱(chēng)為SRRP35)。應(yīng)理解，所述術(shù)語(yǔ)還包括SRRP35的活性片段和衍生物。
[0049]在本發(fā)明中，“本發(fā)明基因”、“本發(fā)明多核苷酸”指編碼SRRP35蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。SRRP35基因定位于細(xì)胞染色體6ql5，cDNA全長(zhǎng)為786bp,編碼全長(zhǎng)261個(gè)氨基酸的蛋白。
[0050]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“SRRP35蛋白”、“SRRP35多肽”或“癌癥標(biāo)志物SRRP35”可互換使用，都指具有人蛋白SRRP35氨基酸序列的蛋白或多肽。[0051]SRRP35,又名 SRSF12 (serine/arginine-rich splicing factorl2,富含絲氨酸和精氨酸的剪切因子12)，因最初發(fā)現(xiàn)作為SR的抑制因子且分子量為35kD而得名。SR蛋白是一類(lèi)富含絲氨酸和精氨酸的具有RRM RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的剪切因子，具有調(diào)控真核細(xì)胞pre-mRNA轉(zhuǎn)錄本選擇性剪切掉內(nèi)含子并拼接外顯子的功能。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，SRRP35能夠拮抗其它SR蛋白并激活腺病毒ElA的pre-mRNA5’最末端的選擇性剪切(Alison E, etal.2001.THE J0URNAL0F BIOLOGICAL CHEMISTRY)。
[0052]SRRP35 基因的 cDNA 序列如 SEQ IDN0.:1 所示；Genbank 登錄號(hào) 135295，SRRP35 的cDNA序列CCDS47459.1以及其編碼的氨基酸序列NP542781.3。
[0053]SRRP35基因所編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.:2所示。
[0054]如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。[0055]如本文所用，“分離的SRRP35蛋白或多肽”是指SRRP35蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化SRRP35蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。在本發(fā)明中，SRRP35蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0056]本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0057]本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0058]編碼SRRP35的成熟多肽的多核苷酸包括:只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0059]本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。
[0060]本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼SRRP35蛋白的多核苷酸。
[0061]本發(fā)明的人SRRP35核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0062]一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0063]此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
[0064]應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
[0065]本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或SRRP35蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
[0066]通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的SRRP35蛋白。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟:
[0067](I).用本發(fā)明的編碼人SRRP35蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0068](2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
[0069](3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0070]本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人SRRP35編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0071]此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0072]包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0073]宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CH0、COS、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
[0074]用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0075]獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0076]在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
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[0077]抗體
[0078]本發(fā)明還包括對(duì)人SRRP35蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人SRRP35基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人SRRP35基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。
[0079]本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
[0080]抗人SRRP35蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人SRRP35 蛋白。
[0081]激動(dòng)劑和藥物組合物
[0082]利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與SRRP35蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，尤其是激動(dòng)劑等。
[0083]本發(fā)明SRRP35蛋白的激動(dòng)劑，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可促進(jìn)SRRP35蛋白的表達(dá)和/或活性，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞(包括肝癌)的生長(zhǎng)或增殖。通常，可將這些激動(dòng)劑配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于):瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
[0084]本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明SRRP35蛋白或其激動(dòng)劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類(lèi)的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約I微克-10毫克/千克體重。
[0085]檢測(cè)方法和試劑盒
[0086]本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人SRRP35蛋白水平或mRNA水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人SRRP35蛋白水平，可以用于診斷肝癌。
[0087]一種檢測(cè)樣品中是否存在SRRP35蛋白的方法是利用SRRP35蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括:將樣品與SRRP35蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在SRRP35蛋白。
[0088]SRRP35蛋白或其多核苷酸可用于SRRP35蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷?？筍RRP35的抗體可以固定在蛋白質(zhì)芯片上，用于檢測(cè)樣品中的SRRP35 蛋白。
[0089]本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)肝癌的試劑盒，它含有特異性擴(kuò)增SRRP35的引物對(duì)和/或SRRP35特異性抗體。
[0090]篩選方法
[0091]本發(fā)明還提供了基于SRRP35進(jìn)行藥物篩選的方法。一種方法是先篩選影響(促進(jìn))SRRP35表達(dá)或活性的化合物，然后對(duì)篩選出的化合物進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)癌細(xì)胞。一種篩選方法可基于SRRP35的mRNA的表達(dá)水平。
[0092]其中，代表性的癌細(xì)胞包括(但并不限于):肝癌細(xì)胞。
[0093]通用方法:
[0094](I)臨床組織樣本的獲取
[0095]肝癌及癌旁組織取自手術(shù)治療的肝癌患者，在獲取樣本前均與患者簽訂了知情同意書(shū)。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取腫瘤原發(fā)灶及周?chē)?cm以外的癌旁組織，投入液氮中速凍并移至一 80°C冰箱保存，運(yùn)輸時(shí)儲(chǔ)存于液氮中。癌與癌旁組織均通過(guò)病理專(zhuān)家做出最終診斷。樣本依據(jù)Edmondson分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為1-1I I級(jí)。
[0096](2)組織及 細(xì)胞RNA抽提
[0097]采用TRIzol Reagent (Invitrogen)試劑抽提RNA,具體操作如下:
[0098]I)研缽、碾杵和勻漿器等器皿洗凈，分別再用ddH20和DEPC H2O沖洗，然后在180°C烘箱中烘約4小時(shí)，以去除RNA酶；
[0099]2)在研缽中加入適量液氮使之預(yù)冷，將組織從液氮中迅速取出，切取約50-1OOmg大小，在研缽中研磨成粉末；
[0100]3)用刮匙將研磨好的組織粉末盡可能完全的移至無(wú)RNA酶的EP管中，EP管被預(yù)先加入適量體積(Iml) TRIzoI試劑，充分勻漿；
[0101]4)室溫放置5分鐘，按比例向離心管中加入氯仿(200μ 1/lml TRIzol)，迅速劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘，4°C, 12000Xg條件下尚心15分鐘；
[0102]5)將上層水相盡可能地轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶的EP管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻5次，室溫靜置10分鐘，4°C，12000 X g條件下離心10分鐘，此時(shí)可見(jiàn)RNA沉淀；
[0103]6)將上清倒掉，加入75%乙醇(lml/lml TRIzol),混勻，洗滌RNA，離心4°C，7500 X g條件下離心5分鐘；
[0104]7)棄上清，盡可能除盡殘留乙醇，沉淀自然干燥5-10min (注意切勿完全干燥)；加入30 - 50 μ I DEPC H2O,吹吸幾次，溶解RNA沉淀；
[0105]8)酶標(biāo)儀測(cè)定RNA濃度及純度0D260/280( 1.8 - 2.0);凝膠電泳觀察有無(wú)降解，一80°C保存。
[0106]細(xì)胞株RNA抽提，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，吸取培養(yǎng)液，根據(jù)培養(yǎng)皿的面積加入相應(yīng)量的TRIzol試劑(lml TRIzol/lOcm2)裂解細(xì)胞，吹打幾次，將裂解下來(lái)的細(xì)胞收集至無(wú)RNA酶的EP管中，其余按照上述步驟4) -8)完成氯仿-異丙醇法分離純化RNA。
[0107](3) RNA的逆轉(zhuǎn)錄
[0108]用M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)逆轉(zhuǎn)錄，操作如下:
[0109]I)在無(wú)核酸酶的EP管中加入以下組分:
[0110]
【權(quán)利要求】
1.一種SRRP35基因或SRRP35蛋白的用途，其特征在于，用于制備檢測(cè)癌癥的試劑或試劑盒。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的試劑盒包括:對(duì)SRRP35蛋白或mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑以及相應(yīng)的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的試劑包括SRRP35特異性引物、特異性抗體、探針和/或芯片；和/或 所述的癌癥包括肝癌。
4.一種用于檢測(cè)癌癥的診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測(cè)SRRP35蛋白或mRNA的檢測(cè)試劑；以及標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)，所述標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)注明所述試劑盒用于檢測(cè)癌癥。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)中注明以下內(nèi)容: 當(dāng)檢測(cè)對(duì)象的SRRP35相對(duì)β -肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量與癌旁組織的SRRP35相對(duì)β -肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量之比≤1，則提示該檢測(cè)對(duì)象患癌癥的幾率高于普通人群。
6.一種SRRP35蛋白、SRRP35基因或其激動(dòng)劑的用途，其特征在于，被用于制備抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的藥物，或用于制備治療癌癥的藥物。
7.—種體外非治療性的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法，其特征在于，包括步驟:在SRRP35蛋白或其激動(dòng)劑存在下，培養(yǎng)癌細(xì)胞，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。
8.一種篩選治療癌癥的候選化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (a)測(cè)試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察所述測(cè)試組的細(xì)胞中SRRP35的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察對(duì)照組的所述細(xì)胞中SRRP35的表達(dá)量和/或活性； 其中，如果測(cè)試組中細(xì)胞的SRRP35的表達(dá)量和/或活性大于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)SRRP35的表達(dá)和/或活性有促進(jìn)作用的治療癌癥的候選化合物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟: (b)對(duì)于步驟(a)中獲得的候選化合物，進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的抑制作用。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)中包括步驟:測(cè)試組中，癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；在對(duì)照組中，在癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；其中，如果測(cè)試組中癌細(xì)胞的數(shù)量或生長(zhǎng)速度小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖有抑制作用的治療癌癥的候選化合物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103937871SQ201310025221
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月23日
【發(fā)明者】高勇, 李硯東 申請(qǐng)人:上海市東方醫(yī)院