專利名稱：一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物秸桿廢棄物一直是我國長期存在的資源環(huán)境問題，東北地區(qū)的秸桿資源密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于我國總秸桿資源密度值，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中，東北地區(qū)的秸桿主要用于燒火做飯取暖、秸桿養(yǎng)畜積肥，但隨著傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)向現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的轉(zhuǎn)變、農(nóng)村能源和飼料結(jié)構(gòu)化的調(diào)整以及社會經(jīng)濟的突飛發(fā)展，農(nóng)業(yè)廢棄秸桿呈了污染空氣、水源和土壤板結(jié)的污染源，各國的研究學(xué)者為秸桿的利用開辟了新途徑和新方法，使傳統(tǒng)秸桿的利用途徑發(fā)生了歷史性的變化。目前剩余秸桿的處理方法主要包括化學(xué)法、物理法和生物法，相比較而言，微生物處理法具有化學(xué)法和物理法不可取代的優(yōu)勢，其處理費用低、操作簡單、環(huán)境污染小，更容易被廣大農(nóng)民接受。微生物能根據(jù)不同的底物污染物產(chǎn)生不同的酶，參與底物的降解反應(yīng)，從而達(dá)到處理廢棄污染物的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌(Pesudomonasmendocina)菌株。門多薩假單抱菌(Pesudomonas mendocina)菌株，保藏編號為CGMCC N0.6711 它的16SrDNA的基因序列，如序列表SEQ ID N0.1所不。本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)纖維素酶的方法，將上述的門多薩假單孢菌(Pesudomonas mendoci na)菌株,在CMC+可溶性淀粉 0.3%、蛋白腺 + 酵母粉 l%、NaCl 0.5%、pH 7.4 7.8的培養(yǎng)基中，溫度30°C，培養(yǎng)，按常規(guī)方法提取纖維素酶。本發(fā)明借助生物技術(shù)的手段，從東北地區(qū)的樹林中雜草地土樣以及腐殖的樹葉、腐爛秸桿、放牛場中腐敗的牛糞、天然堆慪肥料采集樣品，經(jīng)過菌種富集、分離純化得到了一株高效降解纖維素的細(xì)菌；經(jīng)鑒定為門多薩假單孢菌；將門多薩假單孢菌接入含有200mgCMC的培養(yǎng)基中，在120rpm、30°C的條件下?lián)u床培養(yǎng)7d，酶活性達(dá)97IU ;本發(fā)明門多薩假單孢菌產(chǎn)生的纖維素酶對纖維素具有很強的降解作用。與現(xiàn)有的纖維素降解菌株相比，門多薩假單孢菌是從東北地區(qū)的自然環(huán)境中篩選獲得的，屬于環(huán)境中的土著菌，對外界環(huán)境的耐受性更強，且不會污染環(huán)境。在農(nóng)作物秸桿堆肥中具有較高的實用價值。


圖1為本發(fā)明門多薩假單孢菌的單菌落圖片；
圖2為門多薩假單孢菌的革蘭氏染色顯微鏡圖片；
圖3為通過門多薩假單孢菌和相近菌株16SrDNA的基因序列進(jìn)行同源性Blast比對時構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖片。
具體實施例方式實施例1纖維素降解菌株篩選
(1)從東北地區(qū)的樹林中雜草地土樣以及腐殖的樹葉、腐爛秸桿、放牛場中腐敗的牛糞、天然堆慪肥料采集樣品；將新鮮樣品用生理鹽水富集；
(2)將富集后的混合菌液靜置0.5h，取上清作KT1-KT7的稀釋度，每個梯度在選擇性培養(yǎng)基(選擇性培養(yǎng)基為:羧甲基纖維素(CMOlOg/ L, ( NH4) 2S04 4g/ L, KH2PO4 2g/L, MgSO4.7H20 0.5 g/ L,蛋白胨 I g/ L,瓊脂 18 g/ L, pH 6.5 7.0 中涂布，30°C下恒溫培養(yǎng)72h，剛果紅染色篩選出透明圈較大的單一菌落，編號，再多次劃線培養(yǎng)，多次純化以得到純種菌株，將分離后的菌種接到斜面上，4°C保存進(jìn)行后續(xù)實驗。獲得了多株纖維素降解菌，其中在放牛場的腐敗牛糞中采集的，編號為N”-1株，于2012年10月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.6711，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101。對N”-l菌株進(jìn)行革蘭氏染色和顯微鏡觀察。觀察菌株的菌落形態(tài)，菌落呈白色，表面呈現(xiàn)半濕潤狀態(tài)，菌落大而扁平、呈花形形狀、邊緣呈鋸齒狀，生長迅速，革蘭氏染色后用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株為桿菌，呈陰性，見圖1、2。實施例2 N”-1菌株的生理生化鑒定
參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對門多薩假單孢菌N”-1株進(jìn)行生理生化鑒定，其鑒定結(jié)果見表1，菌株的接觸酶、V-P、M.R、反硝化等反應(yīng)呈陰性，能使淀粉水解、使明膠液化、精氨酸雙水解，能利用丙二酸、檸檬酸，屬于葡萄糖發(fā)酵型菌株、最聞耐鹽性為7%。

表I N’’-1的生理生化測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌菌株，它的保藏編號為CGMCC N0.6711。
2.權(quán)利要求1所述的一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌菌株，它的16SrDNA的基因序列，如序列表SEQ ID N0.1所示。
3.—種生產(chǎn)纖維素酶的方法，它包括:將權(quán)利要求1所述的一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌菌株，在CMC+可溶性淀粉0.3%、蛋白胨+酵母粉1%、NaCl 0.5%、pH 7.4 7.8的培養(yǎng)基中， 溫度30°C，培養(yǎng)，按常規(guī)方法提取纖維素酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌，是借助生物技術(shù)的手段，從東北地區(qū)的樹林中雜草地土樣以及腐殖的樹葉、腐爛秸稈、放牛場中腐敗的牛糞、天然堆漚肥料采集樣品，經(jīng)過菌種富集、分離純化得到的；經(jīng)鑒定為門多薩假單孢桿菌；將門多薩假單孢桿菌接入含有200mgCMC的培養(yǎng)基中，在120rpm、30℃的條件下?lián)u床培養(yǎng)7d，酶活性達(dá)97IU；本發(fā)明門多薩假單孢桿菌產(chǎn)生的纖維素酶對纖維素具有很強的降解作用。與現(xiàn)有的纖維素降解菌株相比，門多薩假單孢桿菌是從東北地區(qū)的自然環(huán)境中篩選獲得的，屬于環(huán)境中的土著菌，對外界環(huán)境的耐受性更強，且不會污染環(huán)境。在農(nóng)作物秸稈堆肥中具有較高的實用價值。
文檔編號C12R1/38GK103114057SQ20131002657
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月19日
發(fā)明者王丕武, 張建峰, 侯紅燕, 王剛, 龐思娜, 王靜, 付永平, 曲靜, 劉德生, 劉智穎 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)