專利名稱：霍亂弧菌hlyA基因的質(zhì)?？寺【暌约爸苽浞椒ê蛻?yīng)用的制作方法
霍亂弧菌h I yA基因的質(zhì)?？寺【暌约爸苽浞椒ê蛻?yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及霍亂弧菌全基因組DNA提取和hlyA基因的質(zhì)?？寺【?、其制備方法及非疾病診斷目的方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
霍亂是由霍亂弧菌(Vibrio cholerae)引起的烈性腸道傳染病，能引起霍亂流行的霍亂弧菌主要有兩種血清型，既01群和0139群，霍亂弧菌的強(qiáng)致病作用主要是由其分泌的霍亂腸毒素導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉所致，因此準(zhǔn)確、快速的檢測霍亂弧菌，特別是產(chǎn)毒霍亂弧菌， 對于預(yù)防霍亂弧菌感染具有重要意義。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，人們對細(xì)菌的侵襲素和毒力島等毒力基因認(rèn)識的不斷深入，細(xì)菌的檢測方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的一般表型特征鑒定深化為遺傳特征基因的鑒定?；魜y弧菌hlyA基因編碼具有溶血-溶細(xì)胞的蛋白，是弧菌屬高度保守的管家基因；霍亂弧菌rfb-ΟΙ基因和rfb-0139基因分別是01群霍亂弧菌和0139群霍亂弧菌菌體抗原編碼基因，ctxAB基因是分泌霍亂腸毒素的毒力標(biāo)志，具有高度保守性。
由于霍亂弧菌的相關(guān)毒力基因、管家基因和功能基因總是成簇的位于染色體上， 一般都在幾kb到幾十kb之間，難以用一般的PCR方法擴(kuò)增并克隆這些基因?；蚪M文庫 (genomic library)是上世紀(jì)70年代末發(fā)展起來的一種分離基因組基因的新技術(shù),它包含了基因組的全套遺傳信息(即全部基因)，人們可用相應(yīng)的基因探針從文庫中釣取出任一特定的基因片段加以研究。目前宏基因組學(xué)的應(yīng)用已成為研究已有基因和尋找新基因及其產(chǎn)物的一條新途徑，載體包括Cosmid、Fosmid和BAC等,平均插入片段大·于40Kb, Fosmid 載體是一種替代Cosmid載體構(gòu)建大片段文庫的新載體，與BAC文庫構(gòu)建相比,Fosmid文庫穩(wěn)定性、隨機(jī)性好、技術(shù)成熟、構(gòu)建更簡單快速。Fosmid載體由于插入了大腸埃希菌致育因子F一因子，所以它在宿主菌中以單拷貝形式存在，穩(wěn)定性·好。并且載體上有一個可誘導(dǎo)的 oriV高拷貝復(fù)制起始點，需要時可誘導(dǎo)達(dá)到高拷貝(50個左右)。另外，F(xiàn)osmid文庫隨機(jī)性好，保證了每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等。
為了防止“生物安全事故”而引發(fā)“公共衛(wèi)生事件”，國內(nèi)外均一致要求在PIII或 PII生物安全實驗室內(nèi)對霍亂弧菌可疑樣品進(jìn)行檢測，通過構(gòu)建霍亂弧菌Fosmid文庫的目的就是要把霍亂弧菌染色體的全部基因克隆到易于培養(yǎng)的大腸桿菌中，篩選出霍亂弧菌 hlyA基因、rfb-ΟΙ基因、rfb-0139基因和ctxAB基因單克隆菌株，霍亂弧菌克隆基因的宿主菌為大腸桿菌，不需要培養(yǎng)活的霍亂弧菌菌株，所以可以在PI生物安全實驗室進(jìn)行操作， 有利于生物安全防護(hù)；同時也是研究霍亂弧菌的致病機(jī)理、潛伏機(jī)制、血清學(xué)變異機(jī)理、基因疫苗的制備和基因結(jié)構(gòu)及功能等分子生物學(xué)特性的前提；而且有利于進(jìn)行霍亂弧菌的基因功能的研究和滿足地方基層實驗室應(yīng)對霍亂疫情和疫源地疫情檢測時快速檢測霍亂弧菌的需要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供霍亂弧菌(Vibrio cholerae)全基因組DNA提取方法和霍亂弧菌(Vibrio choleradhlyA基因的單克隆菌株，主要用于霍亂弧菌相應(yīng)基因檢測的陽性對照樣品，進(jìn)行質(zhì)量控制，也可用來考核檢驗人員的技術(shù)水平，以保證檢驗工作質(zhì)量；并且可以對不同的分析方法和不同的鑒定儀器進(jìn)行檢驗和校準(zhǔn)，使之具有準(zhǔn)確性、統(tǒng)一性、可比性和規(guī)范性。本發(fā)明的一方面在于提供一種霍亂弧菌(Vibrio cholerae) hlyA基因的質(zhì)?？寺【?，其以大腸桿菌PCC1F0S為載體，轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌的hlyA基因的質(zhì)粒克隆菌株，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC NO. 6999。本發(fā)明的另一方面在于提供一種霍亂弧菌hlyA基因檢測試劑盒，其包括上文所述的保藏編號為CGMCC NO. 6999的質(zhì)粒克隆菌株作為陽性對照，及上下游引物與探針SEQIDN0. 4 ；SEQ ID NO. 5 ；SEQ ID NO. 6。此外，試劑盒中還可以包括用于PCR擴(kuò)增的2XPCR Taqman GEx酶預(yù)混液等試劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)試劑盒所應(yīng)用的PCR反應(yīng)類型，確定所需的緩沖液或擴(kuò)增酶等試劑種類。本發(fā)明的再一方面在于提供一種非疾病診斷目的的，霍亂弧菌hlyA基因的多重PCR檢測方法，其利用上文所述霍亂弧菌hlyA基因檢測試劑盒，對樣品DNA進(jìn)行多重PCR方法檢測。對于上述技術(shù)方案中，優(yōu)選的情況下，所述的多重PCR方法檢測的條件為①反應(yīng)體系總體積為20ii L，其中
濃度為10 100 ng/mL的樣品DNA2 ^iL
10 上下游引物各0.4 ^iL
10 JiM 探針0.2 ^iL
2xPCR Taqman GEx 酶預(yù)混液10 nL
水余量②以上各組分混勻，5000r/min，離心IOs后，進(jìn)行多重PCR方法檢測950C /IOmin, I 個循環(huán)；95°C /15s，60°C /lmin，40 個循環(huán)。對于上述技術(shù)方案中，所述保藏編號為CGMCC NO. 6997、CGMCC NO. 6998、CGMCCN0. 6999,CGMCC NO. 7000的霍亂弧菌質(zhì)?？寺【甑臉?gòu)建方法為采用低熔點瓊脂糖包埋法提取霍亂弧菌總基因組DNA、構(gòu)建霍亂弧菌Fosmid文庫、提取甘油菌DNA和PCR方法篩選目的基因，具體包括如下步驟利用低熔點瓊脂糖包埋法，分別提取01和0139兩種血清型霍亂弧菌(N16961和M045)完整基因組，用隨機(jī)剪切法將基因組進(jìn)行片段化處理，脈沖電泳分離片段化的DNA并切膠回收38 48Kb之間的DNA片段，然后對回收的DNA片段進(jìn)行末端平滑化和磷酸化處理后，再與pCClFOS質(zhì)粒載體連接，經(jīng)包裝、轉(zhuǎn)染后構(gòu)建霍亂弧菌Fosmid文庫。從建好的文庫中取少量甘油菌進(jìn)行單克隆純培養(yǎng)和提取DNA，并用PCR方法篩選出霍亂弧菌的毒力基因ctxAB、管家基因hlyA和01及0139菌體抗原基因rfb，最終篩選出具有良好穩(wěn)定性的霍亂弧菌hlyA基因、rfb-01基因、rfb_0139基因和ctxAB基因的單克隆菌株，宿主菌為大腸桿菌pCClFOS 載體。
本發(fā)明中，所使用的引物和探針分別是申請?zhí)枮?01110281129.0中具有很高特異性的01群霍亂弧菌的rfb基因(SEQ ID NO. 13)的檢測引物和探針(SEQ ID NO. 1、2和3)，霍亂弧菌hlyA基因(SEQ ID NO. 14)的檢測引物和探針(SEQ ID NO. 4、5和6)以及0139群霍亂弧菌的rfb基因(SEQ ID NO. 15)的檢測引物和探針(SEQ ID NO. 7、8和9)和檢測方法；基于此，本發(fā)明進(jìn)一步公開了霍亂弧菌毒力基因ctxAB (SEQ ID NO. 16)的引物和探針序列(SEQ IDN0. 10、11 和 12)。


圖1不同OD值菌懸液提取的總基因組DNA脈沖電泳圖，其中M2:Low Range PFGEMarker ;1_3:N16961 0D4, 6，8 1/2 膠塊；4_6:M045 0D4, 6，8 1/2 膠塊。圖2Not I 酶切分析 Fosmid 文庫插入片段大小，DNA MWM XV Marker (200ng)；圖3普通電泳法檢測陽性質(zhì)?？寺【攴€(wěn)定性其中，Ml為 X-Hind III Marker (IOOng) ；1. SYFW296-29 (0 代);2. SYFW296-29(50 代);3. SYFW296-29 (100 代);4. SYFW296-49 (0 代);5. SYFW296-49 (50代)；6.SYFW296-49(100 代)；7. SYFW296-165-1(0 代)；8.SYFW296-165-1(50 代)；9. SYFW296-165-1 (100 代);10. SYFW296-192-1 (0 代);11. SYFW296-192-1 (50 代)；12. SYFW296-192-1 (100 代);13.SYFW296-195 (0 代);14. SYFW296-195 (50 代);15. SYFW296-195(100 代);使用篩選得到的四種目的基因陽性質(zhì)?？寺【?，它們是hlyA基因陽性單克隆菌SYFW296-29 和 SYFW296 -49、rfb_01 基因陽性單克隆菌SYFW296-165、rfb_0139 基因陽性單克隆菌SYFW296-192和ctxAB基因陽性單克隆菌SYFW296_195共五株菌.。陽性質(zhì)?？寺【攴謩e接種于3mL含氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中，37°C 200r/min下過夜培養(yǎng)，再從過夜培養(yǎng)的菌液中吸取5 ill接種于3mL含氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中，37 °C 200r/min下過夜培養(yǎng)。重復(fù)以上步驟培養(yǎng)至第5天。提取第I天(0代)、第3天(50代)、第5天(100代)的單克隆菌株DNA，進(jìn)行普通電泳確認(rèn)。其中，泳道Ml為\ -Hind III Marker，泳道I 6分別表示hlyA質(zhì)粒陽性克隆培養(yǎng)0代、培養(yǎng)50代和培養(yǎng)100代的單克隆菌株DNA ;泳道7 9分別表示rfb_01質(zhì)粒陽性克隆培養(yǎng)0代、培養(yǎng)50代和培養(yǎng)100代的單克隆菌株DNA ;泳道10 12分別表示rfb_0139質(zhì)粒陽性克隆培養(yǎng)0代、培養(yǎng)50代和培養(yǎng)100代的單克隆菌株DNA ;泳道13 15分別表示ctxAB質(zhì)粒陽性克隆培養(yǎng)0代、培養(yǎng)50代和培養(yǎng)100代的單克隆菌株DNA。圖4脈沖電泳法檢測陽性質(zhì)?？寺【攴€(wěn)定性其中，M2為 DNA MffM XV Marker (200ng),1. SYFW296-29 (0 代);2. SYFW296-29 (50 代);3. SYFW296-29 (100 代);4. SYFW296-49 (0 代);5. SYFW296-49 (50代)；6.SYFW296-49(100 代)；7.SYFW296-165-1(0 代)；8.SYFW296-165-1(50 代)；9. SYFW296-165-1 (100 代);10.SYFW296-192-1 (0 代);11.SYFW296-192-1 (50 代)；12. SYFW296-192-1 (100 代);13. SYFW296-195(0 代);14. SYFW296-195(50 代);15. SYFW296-195(100 代)；使用篩選得到的四種目的基因陽性質(zhì)?？寺【?，它們是hlyA基因陽性單克隆菌SYFW296-29 和 SYFW296-49、rfb_01 基因陽性單克隆菌SYFW296-165、rfb_0139 基因陽性單克隆菌SYFW296-192和ctxAB基因陽性單克隆菌SYFW296_195共五株菌。陽性質(zhì)?？寺【攴謩e接種于3mL含氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中，37°C 200r/min下過夜培養(yǎng)，再從過夜培養(yǎng)的菌液中吸取5 ill接種于3mL含氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中，37 °C 200r/min下過夜培養(yǎng)。重復(fù)以上步驟培養(yǎng)至第5天。提取第I天(0代)、第3天(50代)、第5天(100代)的單克隆菌株DNA，提取的DNA經(jīng)Not I酶切后跑脈沖場電泳。其中，泳道M2為DNA MWM XV Marker (200ng),泳道I 6分別表示hlyA質(zhì)粒陽性克隆培養(yǎng)0代、培養(yǎng)50代和培養(yǎng)100代的單克隆菌株DNA ;泳道7 9分別表示rfb_01質(zhì)粒陽性克隆培養(yǎng)0代、培養(yǎng)50代和培養(yǎng)100代的單克隆菌株DNA ;泳道10 12分別表示rfb-0139質(zhì)粒陽性克隆培養(yǎng)0代、培養(yǎng)50代和培養(yǎng)100代的單克隆菌株DNA ;泳道13 15分別表示ctxAB質(zhì)粒陽性克隆培養(yǎng)0代、培養(yǎng)50代和培養(yǎng)100代的單克隆菌株DNA。
具體實施例方式下面為本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明技術(shù)方案的建立及其應(yīng)用作進(jìn)一步的說明，下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明實施例中所使用的化學(xué)試劑或溶劑溶液，如無特殊說明，均可以由常規(guī)方法制備或者由商業(yè)途徑獲得。若無特殊說明，本發(fā)明所用生物樣品來自丹東出入境檢驗檢疫局微生物實驗室。細(xì)胞懸濁液(CSB)10ml IM Tris-HCl (pH8. 0)和 20ml 0. 5M EDTA (pH8.0)，用滅菌的超純水稀釋到IOOmL。文庫構(gòu)建使用Epicentre 公司的 copycontrol fosmid library production kit,載體為pCClFOS，宿主菌為大腸桿菌；低熔點瓊脂糖凝膠(SeaPlague GTG Agarose)購自美國Lonza公司；Xho1、Barn H1、A -Hind II1、蛋白酶 K、DNA MWM XV Marker、DNA 純化試劑盒和平端化加磷試劑盒均購自大連寶生物公司；N-甲基甘氨酸鈉鹽購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；PMSF (苯甲基磺酰氟)購自美國sigma公司；TSA(大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基)購自美國Oxoid公司；PFGE膠和一次性制膠模具均購自美國Bio-Rad (伯樂)公司；2YT(胰蛋白胨酵母提取物肉湯)購自美國Oxoid公司；質(zhì)粒DNA提取使用AxyPr印Easy-96質(zhì)粒DNA試劑盒購自美國Axygen Bioscience公司；引物和探針由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司合成； 2 X PCR Taqman GEx酶預(yù)混液購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；主要儀器有BioMerieux Vitek Colorimeter菌濃度測定儀、Bio-Rad公司的脈沖場電泳儀和成像儀、ABI7300實時熒光PCR儀和ABI PRISMTM3730XL DNA Analyzer。實施例1霍亂弧菌全基因組DNA的提 取DNA提取方法有很多，但只有采用低熔點瓊脂糖包埋法對DNA機(jī)械損傷最小，片斷最完整而且能一次大量提取，提取的DNA能長期保存不會被降解，所以本發(fā)明采用低熔點瓊脂糖包埋法提取的DNA最適合用于購建Fosmid基因組文庫。具體操作步驟如下從TSA培養(yǎng)基上刮取培養(yǎng)18h 24h的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)M045和N16961菌體(國家疾病預(yù)防控制中心惠贈)，分別均勻懸濁于2ml細(xì)胞懸濁液(CSB)中，用BioMerieux Vitek Colorimeter測定菌濃度分別為4、6、8三個OD值梯度,優(yōu)化最優(yōu)細(xì)胞懸濁液濃度。取400 ill細(xì)菌懸濁液于相應(yīng)的1. 5ml Eppendorf管中，并加入置于45°C水浴中的400 ill的2%的低熔點瓊脂糖，混勻后立即加入可制成膠塊的一次性模具中，放在4°C凝固30min，取出膠塊，置于10倍體積的ESP緩沖液(0. 4mol/L EDTA中含有終濃度為2%N_甲基甘氨酸鈉鹽和lmg/ml的蛋白酶K)中，50°C水浴中裂解48h左右，其間24h左右更換一次ESP緩沖液，裂解后觀察膠塊，呈透明狀時可以先切小塊凝膠跑普通電泳觀察裂解情況，如果電泳結(jié)果不理想繼續(xù)放在50°C中裂解，裂解結(jié)束后用等體積的含有0. lmmol/L PMSF的I X TE室溫溫浴2h，再用I X TE洗滌包埋塊兩次，將包埋塊保存于0. 5mol/L EDTA (pH8. 0)中，4 °C保存，此時，凝膠塊中包含純化的總基因組DNA。三個OD值梯度的菌體懸濁液經(jīng)包埋法提取基因組DNA后跑脈沖場電泳，上樣量均為1/2膠塊，上Low Range PFG Marker，其電泳圖如圖1。由圖1可知，對于兩種血清型的霍亂弧菌O1和0139，OD值為8的菌體懸濁液，裂解48h后提取的基因組DNA含量最大，因此選用這個OD值提取的DNA來構(gòu)建Fosmid文庫。實施例2Fosmid文庫的構(gòu)建(鑒定和末端測序)用隨即剪切法將基因組DNA進(jìn)行片段化處理，跑脈沖電泳后分離片段化的DNA，脈沖電泳條件為14°C，6V/cm ，脈沖I 10s，16h。電泳結(jié)束后切膠回收38 48kb之間的DNA片段，回收的DNA片段通過普通電泳和脈沖電泳確認(rèn),利用copycontrol Fosmid libraryproduction kit中的試劑補(bǔ)平粘性末端，再用平端化加磷試劑盒進(jìn)行磷酸化處理，將處理后的DNA片段連接到pCClFOS載體上，4°C過夜，根據(jù)試劑盒提供的方法將連接液進(jìn)行包裝、轉(zhuǎn)染、涂布平板。從由上述方法獲得的平板中隨機(jī)選取16個白色單菌落，培養(yǎng)提取Fosmid DNA，用NotI進(jìn)行酶切，因Not I可以識別8個堿基，按概率約40Kb左右會有酶切位點，但是也有可能插入片段中有不止一個酶切位點。從圖2(Not I酶切分析Fosmid文庫插入片段大小)可以看出，16個白色陽性菌落的酶切產(chǎn)物都有一條同樣大小的條帶，此條帶即代表pCClFOS載體，插入片段有一個酶切位點的片段35Kb 40Kb之間，有多個酶切位點的片段加和也在35Kb以上，F(xiàn)osmid最適插入長度在35Kb左右，所以酶切結(jié)果均符合要求。對以上16個克隆隨機(jī)挑選8個Fosmid DNA進(jìn)行雙末端測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST后，證實均為霍亂弧菌相關(guān)序列，說明文庫制備正確。分別挑取陽性白色菌落保存在96孔板上，以每孔一個單克隆進(jìn)行制作，37°C過夜培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的板用含有30%甘油的LB培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮并移至新96孔板中，-70°C下貯存獲得的甘油菌。實施例3從實施例2獲得的甘油菌中篩選陽性克隆菌株，操作方法如下取2 IOii L甘油菌加入含有氯霉素的終濃度為12. 5ng/ii L的IOOiiL LB中，37 0C 1800rpm振蕩過夜培養(yǎng)后，往培養(yǎng)液中添加500 y L2YT (含有氯霉素的終濃度為12. 5ng/u L) 1/1000 量的誘導(dǎo)劑(1000 X Induction)，37°C 1800rpm 振蕩培養(yǎng) 5h。使用試劑盒AxyPr印Easy-96質(zhì)粒DNA試劑盒進(jìn)行DNA提取，對提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行實時熒光多重PCR擴(kuò)增，篩選出hlyA基因、rfb-01基因、rfb-0139基因和ctxAB基因的單克隆菌株，具體PCR方法操作步驟如下1、各基因的PCR檢測使用以下引物和探針rfb-01 :正向引物5，-GCCCGTTTTGCATTATGGAT-3，(SEQ ID NO.1)反向引物5，-CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3’(SEQ ID NO. 2)探針5，F(xiàn)AM-TGATCCGACAAGCCCAAATGCCACTA(Eclipse)-3，(SEQID NO. 3)hlyA:正向引物5，-GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3，；(SEQ ID NO. 4)反向引物5，-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3’(SEQ ID NO. 5)
探針5，NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)-3，(SEQID NO. 6)rfb-0139 :正向引物5’ -AGTTACCTGTTATGTACGATGAACC-3’ (SEQ ID NO. 7)反向引物5’-CCATCACCAGACAAGCATACAG-3’ (SEQ ID NO. 8)探針5，VIC-TGCTGACGCCTCTCAAGTGCCTACG(Eclipse)-3，(SEQID NO. 9)ctxAB :正向引物5’ -CTCATCCAGATGAACAAGAAGTTTCTG-3’ (SEQ ID NO. 10)反向引物5’-CTATCTCTGTAGCCCCTATTACGATGT-3’ (SEQ ID NO. 11)探針5，F(xiàn)AM-AAGCCCCCAAAATGA(MGB)-3，(SEQID NO. 12)2、多重PCR反應(yīng)體系總體積20ul，包括步驟③制得的模板DNA溶液2iiL，2XPCR Taqman GEx酶預(yù)混液IOii L，rfb-01基因和ctxAB基因上下游引物各0. 8 ii L、探針0. 4 ii L，hlyA基因和rfb-0139基因上下游引物各0. L、探針0. 2 y L，根據(jù)實驗需要選擇不同引物對和探針進(jìn)行擴(kuò)增實驗，補(bǔ)充滅菌超純水至總體積為20ii L ;其中引物和探針的濃度均為10iiM。以上各組分加入至0. 2mL PCR反應(yīng)管中，混勻，5000r/min，離心IOs ；上述反應(yīng)體系按下述條件進(jìn)行PCR檢測950C /IOmin, I 個循環(huán)；95°C /15s,60°C /lmin, 40 個循環(huán)；每次循環(huán)的退火時收集熒光，檢測結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值判定結(jié)果。Ct值彡40，可判斷該基因篩選結(jié)果為陰性；Ct值< 40，可判斷該基因篩選結(jié)果為陽性。實施例4一.陽性單克隆菌株穩(wěn)定性檢測使用實施例3中篩選得到的四種目的基因陽性質(zhì)?？寺【?，它們是hlyA基因陽性單克隆菌SYFW296-29和SYFW296-49、rfb-01基因陽性單克隆菌SYFW296_165、rfb-0139基因陽性單克隆菌SYFW296-192和ctxAB基因陽性單克隆菌SYFW296_195共五株菌，分別接種于3mL含氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中，37°C 200r/min下過夜培養(yǎng)。分別從過夜培養(yǎng)的菌液中吸取5iU接種于3mL含氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中，37°C 200r/min下過夜培養(yǎng)，重復(fù)以上步驟培養(yǎng)至第5天。提取第I天(0代)、第3天(50代)、第5天(100代)的單克隆菌株DNA，進(jìn)行普通電泳確認(rèn)，經(jīng)Not I酶切后進(jìn)行瓊脂糖脈沖電泳，檢測克隆穩(wěn)定性。提取的陽性單克隆菌株DNA普通電泳結(jié)果見圖3 (提取的Fosmid DNA普通電泳)；圖中所示結(jié)果可知圖譜無明顯差異，沒有發(fā)現(xiàn)插入片段的丟失或重排，說明所構(gòu)建的陽性質(zhì)粒克隆菌株是穩(wěn)定的。陽性單克隆菌株DNA經(jīng)Not I酶切，酶切產(chǎn)物脈沖場電泳結(jié)果見圖4 (提取的Fosmid DNA Not I酶切脈沖場電泳)。圖中所示結(jié)果可知圖譜無明顯差異，沒有發(fā)現(xiàn)插入片段的丟失或重排，說明所構(gòu)建的陽性質(zhì)?？寺【晔欠€(wěn)定的。二.菌種保藏將篩選的陽性質(zhì)?？寺【暧?012年12月17日，分別保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，具體信息如下大腸桿菌pCClFOS載體，轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌的rfb-0139基因的質(zhì)粒克隆菌株SYFW296-192，即轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌rfb-0139基因克隆質(zhì)粒的大腸桿菌，命名為VC-rfb-0139，保藏號為CGMCC NO. 6997 ；大腸桿菌pCClFOS載體，轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌的rfb-01基因的質(zhì)?？寺【闟YFW296-165，即轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌rfb-01基因克隆質(zhì)粒的大腸桿菌，命名為VC_rfb_01，保藏號為CGMCCN0. 6998 ；

大腸桿菌pCClFOS載體，轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌hlyA基因的質(zhì)?？寺【闟YFW296-29，即轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌hlyA基因克隆質(zhì)粒的大腸桿菌，命名為VC-hlyA，保藏號為=CGMCCNO. 6999 ；大腸桿菌pCClFOS載體，轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌的ctxAB基因的質(zhì)?？寺【闟YFW296-195，即轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌ctxAB基因克隆質(zhì)粒的大腸桿菌，命名為VC_ctxAB。保藏號為CGMCCN0. 7000。實施例5一.實驗分組分別利用實施例4所述方法制備獲得的轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌的rfb-0139 (CGMCCNO. 6997)、rfb-01 (CGMCC NO. 6998)、hlyA (CGMCC NO. 6999)、ctxAB (CGMCC NO. 7000)基因的質(zhì)?？寺【辏鱿率鰧嶒?。將待檢測樣品分別標(biāo)記已知含有霍亂弧菌N16961和M045的陽性對照樣品標(biāo)記為PC ；樣品水標(biāo)記為NC ；霍亂弧菌的rfb-0139基因的質(zhì)?？寺【陜龈删鶦GMCC NO. 6997 :標(biāo)記為A ；霍亂弧菌的rfb-01基因的質(zhì)?？寺【陜龈删鶦GMCC NO. 6998 :標(biāo)記為B ；霍亂弧菌的hlyA基因的質(zhì)?？寺【陜龈删鶦GMCC NO. 6999 :標(biāo)記為C ；霍亂弧菌的ctxAB基因的質(zhì)?？寺【陜龈删鶦GMCC NO. 7000 :標(biāo)記為D ；將分別標(biāo)記的待檢測樣品作為盲樣，分給檢驗員檢測，檢測方法和結(jié)果如下檢驗員1:利用引物和探針SEQ ID NO. 1、2和3，做如下實驗。檢驗員2 :利用引物和探針SEQ ID NO. 4、5和6，做如下實驗。檢驗員3 :利用引物和探針SEQ ID NO. 7、8和9，做如下實驗。檢驗員4 :利用引物和探針SEQ ID NO. 10、11和12，做如下實驗。二.檢驗方法
對上述待檢的樣品，分別提取DNA，方法如下①稱取300mg已制備好的樣品于2mL離心管中，加入1. 5mL CTAB緩沖液和10 y L濃度為20mg/ iiL蛋白酶K,65°C 30min振蕩混勻；12000r/min離心5min,吸取上清液至一新離心管中，加400 y L的體積比為24 1的三氯甲烷異戊醇，充分混勻；②12000r/min離心5min，吸取上清液至一新離心管中，加入0. 8倍體積異丙醇，室溫下沉淀I 2h ;③12000r/min離心IOmin,棄上清液；70%乙醇洗漆一次，晾干；加入50iiL TE,溶
解DNA沉淀；④DNA濃度和純度的測定取步驟③獲得的DNA溶液加水稀釋，至濃度為10 U g/mL 100 u g/mL, A260/A280 比值在1. 7 1. 9 之間，備用。三.檢驗結(jié)果利用實施例3中所述的實時PCR篩選方法，分別對提取DNA的樣品進(jìn)行檢測，每個樣品4次重復(fù)，其結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種霍亂弧菌hlyA基因的質(zhì)?？寺【?，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC NO. 6999。
2.一種霍亂弧菌hlyA基因檢測試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的保藏編號為CGMCC NO. 6999的質(zhì)?？寺【辏吧舷掠我锱c探針SEQ ID NO. 4 ；SEQ ID NO. 5 ；SEQ ID NO. 6。
3.一種非疾病診斷目的的霍亂弧菌hlyA基因的多重PCR檢測方法，其特征在于利用權(quán)利要求2所述霍亂弧菌hlyA基因檢測試劑盒，對樣品DNA進(jìn)行多重PCR方法檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的非疾病診斷目的的霍亂弧菌hlyA基因的多重PCR檢測方法， 其特征在于所述的多重PCR方法檢測的條件為①反應(yīng)體系總體積為20μ L，其中濃度為IO 100 gg/mL的樣品DNA 10 μΜ丄下游引物 ΙΟμΜ探針2xPCR Taqman GEx 酶預(yù)混液水·0.2 μL IOpL②以上各組分混勻，5000r/min，離心IOs后，進(jìn)行多重PCR方法檢測 950C /10min，l 個循環(huán)；95°C /15s，60°C /lmin，40 個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種霍亂弧菌hlyA基因的質(zhì)粒克隆菌株、其制備方法，及其在非疾病診斷目的方面的應(yīng)用,其以大腸桿菌pCC1FOS為載體，轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌的hlyA基因的質(zhì)粒克隆菌株，保藏編號為CGMCC NO.6999。主要用于霍亂弧菌相應(yīng)基因檢測的陽性對照樣品，進(jìn)行質(zhì)量控制，也可用來考核檢驗人員的技術(shù)水平，以保證檢驗工作質(zhì)量；并且可以對不同的分析方法和不同的鑒定儀器進(jìn)行檢驗和校準(zhǔn)，使之具有準(zhǔn)確性、統(tǒng)一性、可比性和規(guī)范性。具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/19GK103060254SQ201310027908
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月24日
發(fā)明者王殿夫, 麻麗丹, 王海燕, 崔妍 申請人:王殿夫, 麻麗丹, 王海燕, 崔妍