專利名稱：鱉甲dna檢測(cè)試劑盒及鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥材鑒定技術(shù)，具體地說(shuō)是一種鱉甲DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法。
背景技術(shù)：
鳘甲為鳘科的動(dòng)物鳘(Trionyx sinensis Wiegamann)的背甲，又名:別甲、團(tuán)甲殼、上甲、王八蓋子、鱉殼、鱉蓋子、水魚(yú)殼等。其原動(dòng)物為中華鱉，俗稱團(tuán)魚(yú)、甲魚(yú)、王八等，屬于爬行綱(Repitlia);龜鳘目(Testudinata);鳘科(Tironychidae);鳘屬(Peodiscus)。在我國(guó)除西藏、青海及新疆以外其他地區(qū)均有分布，以長(zhǎng)江流域和華南地區(qū)最為多見(jiàn)。我國(guó)中華鱉養(yǎng)殖產(chǎn)量居世界之首，但20世紀(jì)90年代以來(lái)，大量境外走私鱉涌入多我國(guó)，加上各養(yǎng)殖場(chǎng)相互之間引種、倒種極不規(guī)范，不注重培育品種，嚴(yán)重危害了中華鱉的種質(zhì)資源，種質(zhì)是產(chǎn)業(yè)的源頭，影響到鱉甲的資源，影響到鱉甲的用藥。鱉甲性味咸、微寒，歸肝、腎經(jīng)。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。鱉甲中含有多種成分，主要含有動(dòng)物膠，角蛋白，碘質(zhì)，維生素D，磷酸鈣，鱉甲多糖，多種氨基酸和多種微量元素等。豐富的成分使鱉甲的藥用價(jià)值很高。具有滋陰潛陽(yáng)，退熱除蒸，軟堅(jiān)散結(jié)等功能，用于陰虛發(fā)熱，骨蒸勞熱，陰虛陽(yáng)亢，頭暈?zāi)垦?，虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)，手足瘈瘋，經(jīng)閉，癥瘕，久瘧瘧母。為常用中藥之一，在臨床應(yīng)用廣泛，除臨床的配方使用外，尚在復(fù)方鱉甲軟肝片、人參鱉甲煎丸、參桂鹿茸丸等數(shù)種中成藥中應(yīng)用?！吨袊?guó)藥典》(2010年，一部)中的鑒別方法為:性狀鑒別和浸出物鑒別。文獻(xiàn)中尚有顯微鑒別、理化鑒別、光譜鑒別、色譜鑒別、生化鑒別等，但這些方法尚不能對(duì)鱉甲進(jìn)行快速、有效的鑒別。分子遺傳標(biāo)記技術(shù)開(kāi)始與中藥領(lǐng)域滲透，并快速融合、發(fā)展，其中DNA指紋圖譜在中藥材(除礦物藥外)的鑒定方面具有專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，從分子水平解決了以前中藥鑒定中宏觀鑒定水平上的不完善?，F(xiàn)代分子生物學(xué)在中藥的質(zhì)量控制領(lǐng)域逐步擴(kuò)大，方法逐漸完善，大大加快了中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程。線粒體是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種細(xì)胞器，線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是一共價(jià)閉合的雙鏈環(huán)狀的遺傳物質(zhì)，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于分離、拷貝數(shù)高、突變率高、進(jìn)化速度快、母性遺傳、無(wú)組織特異性、高保守性等特點(diǎn)。其中細(xì)胞色素b (cytochrome b, cyt b)基因和細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基 I (cytochrome c oxidase subunit
I,CO I)基因存在于所有動(dòng)物中，進(jìn)化速度適中，較短的一個(gè)片段就能包含從種內(nèi)到種間信息，且其DNA序列很少存在插入和缺失，能夠保證足夠交異，是分析種內(nèi)和近緣種間遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系的適當(dāng)?shù)腄NA片段，可應(yīng)用于生物的分類、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性的研究。這兩個(gè)片段的基因可被作為動(dòng)物中物種鑒定標(biāo)記進(jìn)行研究，因此，以線粒體DNA分子特征為遺傳標(biāo)記的中藥鑒定更為準(zhǔn)確、可靠。我們依托吉林省科技 廳(2008年I月立項(xiàng))和吉林省教育廳資助課題(2010年I月立項(xiàng)):《中藥DNA指紋檢測(cè)試劑盒的研究與開(kāi)發(fā)》(2012年5月吉林省科技廳鑒定成果)，基于線粒體DNA建立動(dòng)物中藥材的DNA指紋特征，成功開(kāi)發(fā)出紹心、鹿鞭和鹿茸三種中藥材DNA鑒定試劑盒。
貂心屬細(xì)貴藥材，是國(guó)家藥監(jiān)局局標(biāo)準(zhǔn)(原衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn))利心丸中的主藥。目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)貂心的法定鑒別方法，對(duì)貂心的成分研究及鑒別國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中也未見(jiàn)報(bào)道，常用中藥材鑒別方法無(wú)法區(qū)別貂心與易混動(dòng)物的心臟，故給貂心及其制劑的質(zhì)量控制帶來(lái)了很大困難。課題組在發(fā)現(xiàn)貂心線粒體DNA的全部基因組前提下，利用貂心mtDNA獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用DNA擴(kuò)增技術(shù)及測(cè)序技術(shù)研究貂心線粒體DNA的基因組部分序列，設(shè)計(jì)的寡核苷酸片段可特異鑒定雞心、鴨心、鵝心和兔心，成功發(fā)明了一種簡(jiǎn)便、快速、特異的鑒定貂心專利技術(shù)(貂心DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法，發(fā)明專利:ZL200810051643.3 ;2011.4授權(quán))。相關(guān)成果發(fā)表在吉林大學(xué)學(xué)報(bào)《貂組織線粒體DNA及細(xì)胞色素b鑒定及特征》[2008，34(5):790-793]，中國(guó)藥學(xué)雜志《水貂心肌線粒體mtDNA鑒定及RFLP特征》[2012,4(3):182-185]。在此基礎(chǔ)上，課題組應(yīng)用分子生物學(xué)與中藥鑒定的相融合的理論對(duì)鱉甲的鑒定技術(shù)進(jìn)行研究，主要應(yīng)用線粒體DNA的cyt b高保守性及特異性對(duì)鱉甲進(jìn)行鑒定。采用鹽析法方法從鱉甲中提取線粒體DNA，利用Genbank中的相關(guān)信息，根據(jù)中華鱉與其他相關(guān)動(dòng)物的線粒體DNA序列的差異,選取cyt b基因序列,應(yīng)用primer premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)鱉甲一對(duì)特異性引物，進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增，此方法可從分子水平對(duì)鱉甲鑒定提供依據(jù)。相關(guān)成果發(fā)表在中國(guó)藥學(xué)雜志《中藥材龜甲細(xì)胞色素b特異性鑒定研究》[2012，4(3):182-185]。國(guó)內(nèi)杜胃$等人通過(guò)對(duì)細(xì)胞色素C氧化酶亞基I (cytochrome c oxidase subunitI，CO I)基因序列對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，中華鱉CO I基因序列種內(nèi)變異很小，種間存在較多的變異位點(diǎn)，可以作為DNA條形碼技術(shù)鑒別鱉甲杜鵑，崔麗娜，張輝，等:鱉甲及其偽品的DNA分子鑒定.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，13(2) =429-434.。實(shí)驗(yàn)證明了中華鱉CO I基因可以作為鑒別靶位。但是，DNA條形碼技術(shù)要求至少選擇兩個(gè)基因位點(diǎn)，單獨(dú)選擇一個(gè)位點(diǎn)不能避免突變導(dǎo)致的變異。劉忠權(quán)等人利用位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)，配合測(cè)序技術(shù)鑒別鱉甲及其同科動(dòng)物劉重權(quán)，等.中藥材鱉甲的位點(diǎn)特異性PCR鑒定研究.中藥材，2001，32(8) =736-739.;吳平，等.用聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)鑒定中藥材鱉甲.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，29 (I):28-30.。實(shí)驗(yàn)證明了中華鱉一些基因位點(diǎn)可以通過(guò)特異性PCR和測(cè)序技術(shù)進(jìn)行鑒別。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明專利基于同時(shí)選擇兩個(gè)特異位點(diǎn)用于中華鱉鑒別。從中華鱉CO I基因和cyt b基因中，采用高通量技術(shù)分析兩個(gè)基因具有鑒別序列片段作為鑒別點(diǎn)。建立多重引物PCR(又稱復(fù)合PCR)反應(yīng)體系。多重PCR具有高效性特點(diǎn)，即在同一 PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種目的基因，或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的基因進(jìn)行分型，特別是用一個(gè)樣本就可檢測(cè)多種項(xiàng)目。由于鱉甲型別較多，種間存在較多的變異位點(diǎn)，多重PCR可提高其檢出率并同時(shí)鑒定其型別及突變等。此外，多重PCR具有經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性特性，多種目的基因在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，將大大的節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開(kāi)支。對(duì)中藥材鑒定具有節(jié)約樣本等優(yōu)勢(shì)，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本和提高效率的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明專利采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)中華鱉鱉甲線粒體DNA基因組進(jìn)行篩選，利用Genbank中的相關(guān)信息，根據(jù)中華鱉與其他相關(guān)動(dòng)物的線粒體DNA序列的差異，選取COX I和cyt b基因序列,應(yīng)用primer premier5.0設(shè)計(jì)軟件,設(shè)計(jì)可有效地區(qū)分鳘甲和偽品的特異性DNA序列，利用多重PCR技術(shù)在一個(gè)反應(yīng)體系中加入二對(duì)特異性引物，針對(duì)一個(gè)模板可擴(kuò)增二個(gè)具有差異的目的片段。提供一種能夠準(zhǔn)確鑒別鱉甲和偽品特異性分子標(biāo)志，使用方便的鱉甲和偽品多重PCR檢測(cè)試劑盒，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本和提高效率的特點(diǎn)，并提供其簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)結(jié)果可靠的鑒定方法。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種鑒別鱉甲和偽品多重PCR檢測(cè)試劑盒，其特征是，它包含:1.樣本前處理液及脫鈣液每樣品取2g，刷洗干凈后用前處理液(主要含有去離子水)沖洗干凈，室溫干燥，用紫外燈照射30min以上。使用研缽將樣品研碎至2 3mm左右，置于離心管中，每份按質(zhì)量體積比1: 20加入相應(yīng)體積脫鈣液(主要含有0.5mol/L pH8.0EDTA)，56C水浴48h 60h,轉(zhuǎn)速100r/min。每12h更換一次新鮮的脫I丐液。脫I丐后8000r/min離心5min棄上清，沉淀待用。2.線粒體DNA提取體系(I)裂解液向經(jīng)過(guò)前處理的樣品中加入5ml裂解液[lOmmol/L Tris-HCl (pH8.0)，10m mol/L EDTA(ρΗ8.0)，100m mol/L NaCl，2% SDS，40 μ g/ml 蛋白酶K，0.039mol/L DTT]，置于水浴鍋中，56°C水浴過(guò)夜，轉(zhuǎn)速100r/min。(2)沉淀液直接向裂解后的樣品中加入2ml沉淀液(主要含有NaAC)，充分混勻，6，000r/min4°C離心IOmin,吸取上清,棄沉淀。向上清中加入等體積的預(yù)冷的異丙醇,混勻后，低溫放置20 30min, 12, 000r/mi`n4°C離心20min,棄上清，留沉淀。(3)洗滌液使用洗滌液(主要含有70%乙醇)洗滌沉淀兩到三次，干燥沉淀，溶于滅菌雙蒸水中，_80°C保存?zhèn)溆谩?.PCR反應(yīng)體系(a)鑒定反應(yīng)體系總體系為IOOyL,其中含有緩沖液10yL，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待測(cè)樣品DNA2 5 μ L，余為雙蒸餾水；(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系總體系為100 μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，中華鱉鱉甲DNA2 5yL，余為雙蒸餾水；(c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系總體系為IOOyL,含有緩沖液10yL，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，偽品DNA2 5 μ L,余為雙蒸懼水；(d)設(shè)計(jì)反應(yīng)程序分別將鑒別鱉甲和偽品PCR檢測(cè)試劑盒的(a)鑒定反應(yīng)體系、
(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系和(c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系的總體系各IOOyL加入反應(yīng)管中，置于PCR反應(yīng)儀(市場(chǎng)有售，任意型號(hào))中按下列程序進(jìn)行:94°C預(yù)變性3min 7min，94°C 30s，退火溫度 56°C Imin 30s, 72°C Imin 30s, 40 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min 8min, 4°C。4.結(jié)果觀察體系制備用1.5瓊脂糖凝膠(市場(chǎng)有售，可購(gòu)買)，電泳，分子量100 1500bp的DNAMarker (標(biāo)準(zhǔn)分子量，市場(chǎng)有售)作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)(市場(chǎng)有售，可購(gòu)買)觀察和分析結(jié)果。鱉甲DNA鑒定方法，其特征是，它包含以下步驟:1.檢測(cè)樣本前處理每個(gè)樣品取2g，刷洗干凈后用前處理液沖洗干凈，室溫干燥，用紫外燈照射30min以上。使用研缽將樣品研碎至2 3mm左右，置于離心管中，每份按質(zhì)量體積比1: 20加入相應(yīng)體積脫鈣液，56°C水浴48h 60h，轉(zhuǎn)速100r/min。每12h更換一次新鮮的脫鈣液。脫隹丐后8000r/min離心5min棄上清,沉淀待用。2.線粒體DNA提取(I)樣本裂解向經(jīng)過(guò)前處理的樣品中加入5ml裂解液，置于水浴鍋中，56°C水浴過(guò)夜，轉(zhuǎn)速 100r/min。(2)沉淀直接向裂解后的樣品中加入2ml沉淀液，充分混勻，6，000r/min4°C離心lOmin，吸取上清，棄沉淀。向上清中加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，混勻后，低溫放置20 30min, 12, 000r/min4°C離心 20min,棄上清，留沉淀。(3)洗滌使用洗滌液洗滌沉淀兩到三次，干燥沉淀，溶于滅菌雙蒸水中，-80°C保存，作為檢測(cè)DNA模板。 3.PCR引物設(shè)計(jì)與合成(I)設(shè)計(jì)鱉甲線粒體DNA 二對(duì)特異寡核苷酸引物，含有鱉甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl (COX I)5' ATACATCCGATACAACAGC 3'5' GATAAATGGGAGATAAGTG 3'Primer2 (cyt b)5' ATCATCCGATCAATAACAG 3'5, AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3,(2)人工合成鱉甲線粒體DNA 二對(duì)特異寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成儀。(委托上海生工完成)4.建立PCR反應(yīng)(a)鑒定反應(yīng)總體系為100 μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM引物I和引物2各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待測(cè)樣品DNA2 5 μ L，余為雙蒸餾水。(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)總體系為IOOyL,其中含有緩沖液10yL，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，中華鱉鱉甲DNA2 5 μ L，余為雙蒸餾水。(C)陰性對(duì)照反應(yīng)總體系為100 μ L，含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，偽品DNA2 5 μ L,余為雙蒸懼水。(d)設(shè)計(jì)反應(yīng)程序分別將鑒別鱉甲和偽品PCR檢測(cè)試劑盒的(a)鑒定反應(yīng)體系、(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系和(c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系的總體系各IOOyL加入反應(yīng)管中，置于PCR反應(yīng)儀(市場(chǎng)有售，任意型號(hào))中按下列程序進(jìn)行:94°C預(yù)變性3min 7min，94°C 30s，退火溫度 56°C Imin 30s, 72°C Imin 30s, 40 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min 8min, 4°C。5.結(jié)果判定產(chǎn)物用1.5-1.8%瓊脂糖凝膠(市場(chǎng)有售)電泳，分子量IOObp 1500bp的DNAMarker (標(biāo)準(zhǔn)分子量，市場(chǎng)有售)作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)(市場(chǎng)有售，可購(gòu)買)觀察和分析結(jié)果。同時(shí)出現(xiàn)IOOObp和500bp條帶為正品鱉甲，只出現(xiàn)一條或不出現(xiàn)均為偽品鱉甲(圖1)。本發(fā)明的鑒別鱉甲和偽品鑒定試劑盒是利用鑒別鱉甲和偽品線粒體DNA與細(xì)胞色素b和c具有的種屬特異性位點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確同時(shí)區(qū)別鑒別鱉甲和偽品的特異性；建立的多重PCR鑒定方法具有簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為鱉甲試劑盒檢測(cè)結(jié)果示意圖。其中:1.為正品鱉甲結(jié)果，同時(shí)擴(kuò)增出IOOObp和500bp ；2.為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)擴(kuò)增出IOOObp和500bp ；3.為標(biāo)準(zhǔn)分子量；4.為陰性結(jié)果，不出現(xiàn)或只出現(xiàn)I條擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2實(shí)施例一鱉甲試劑盒檢測(cè)結(jié)果示意圖。其中:1.為正品鱉甲結(jié)果，同時(shí)擴(kuò)增出IOOObp和500bp ；2.為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)擴(kuò)增出IOOObp和500bp ;3 .為標(biāo)準(zhǔn)分子量；4.為陰性結(jié)果，不出現(xiàn)或只出現(xiàn)I條擴(kuò)增產(chǎn)物。5.為陰性對(duì)照。圖3實(shí)施例二對(duì)市售鱉甲藥材進(jìn)行鑒定結(jié)果示意圖。其中:1.為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增出IOOObp和500bp ；2.為正品鱉甲結(jié)果，擴(kuò)增出IOOObp和500bp ；3:緬甸陸龜甲；4:凹甲陸龜甲；5:黃額閉殼龜甲；6:黃喉擬水龜甲；7:三線閉殼龜甲；8.為標(biāo)準(zhǔn)分子量；9.為陰性結(jié)果
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，下面實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而并非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例一1.檢測(cè)樣本前處理檢測(cè)樣品(兩種，I為鱉甲正品，2為花龜，鱉甲偽品，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供并鑒定)，每份取2g，刷洗干凈后用前處理液沖洗干凈，室溫干燥，用紫外燈照射30min以上。使用研缽將樣品研碎至2 3mm左右，置于離心管中，每份按質(zhì)量體積比1: 20加入相應(yīng)體積脫鈣液，56°C水浴48hh，轉(zhuǎn)速100r/min。每12h更換一次新鮮的脫鈣液。脫隹丐后8000r/min離心5min棄上清,沉淀待用。2.線粒體DNA提取(I)樣本裂解向經(jīng)過(guò)前處理的樣品中加入5ml裂解液，置于水浴鍋中，56°C水浴過(guò)夜，轉(zhuǎn)速 100r/min。(2)沉淀直接向裂解后的樣品中加入2ml沉淀液，充分混勻，6，000r/min4°C離心IOmin,吸取上清,棄沉淀。向上清中加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，混勻后，低溫放置30min,12，000r/min4°C離心20min,棄上清，留沉淀。(3)洗滌使用洗滌液洗滌沉淀兩到三次，干燥沉淀，溶于滅菌雙蒸水中，-80°C保存，作為檢測(cè)DNA模板。3.PCR引物設(shè)計(jì)與合成(I)設(shè)計(jì)鱉甲線粒體DNA 二對(duì)特異寡核苷酸引物，含有鱉甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl (COX I)5' ATACATCCGATACAACAGC 3'5' GATAAATGGGAGATAAGTG 3'Primer2 (cyt b)5' ATCATCCGATCAATAACAG 3'5, AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3,(2)人工合成·鱉甲線粒體DNA 二對(duì)特異寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成儀。(委托上海生工完成)4.建立PCR反應(yīng)(a)鑒定反應(yīng)總體系為100 μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 μ L，0.1mM引物I和引物2各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，待測(cè)樣品DNA2 μ L，余為雙蒸餾水。(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)總體系為IOOyL,其中含有緩沖液10yL，12.5mM dNTP4 μ L,
0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，中華鱉鱉甲DNA2 μ L，余為雙蒸餾水。(C)陰性對(duì)照反應(yīng)總體系為100 μ L，含有緩沖液10 μ L, 12.5mM dNTP4y L,0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，偽品DNA2 μ L，余為雙蒸餾水。(d)設(shè)計(jì)反應(yīng)程序分別將鑒別鱉甲和偽品PCR檢測(cè)試劑盒的(a)鑒定反應(yīng)體系、
(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系和(c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系的總體系各IOOyL加入反應(yīng)管中，置于PCR反應(yīng)儀(市場(chǎng)有售，任意型號(hào))中按下列程序進(jìn)行:941:預(yù)變性51^11，941: 30s，退火溫度 56。。30s, 720C lmin，40 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min，4°C。5.結(jié)果判定PCR產(chǎn)物用1.5瓊脂糖凝膠電泳，標(biāo)準(zhǔn)分子量IOObp 1500bp的DNA Marker作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析結(jié)果(圖2)。實(shí)施例2對(duì)市售鱉甲藥材進(jìn)行鑒定1.材料市售鱉甲樣品5種，鱉甲正品I種(由吉林市藥品檢定所提供并鑒定)2.方法2.1檢測(cè)樣本前處理每份檢測(cè)樣品取2g，刷洗干凈后用前處理液沖洗干凈，室溫干燥，用紫外燈照射30min以上。使用研缽將樣品研碎至2 3mm左右，置于離心管中，每份按質(zhì)量體積比1: 20加入相應(yīng)體積脫鈣液，56°C水浴48hh，轉(zhuǎn)速100r/min。每12h更換一次新鮮的脫韓液。脫韓后8000r/min離心5min棄上清,沉淀待用。2.2線粒體DNA提取(I)樣本裂解向經(jīng)過(guò)前處理的樣品中加入5ml裂解液，置于水浴鍋中，56°C水浴過(guò)夜，轉(zhuǎn)速 100r/min。
(2)沉淀直接向裂解后的樣品中加入2ml沉淀液,充分混勻,6，000r/min4°C離心IOmin,吸取上清,棄沉淀。向上清中加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，混勻后，低溫放置30min,12，000r/min4°C離心20min,棄上清，留沉淀。(3)洗滌使用洗滌液洗滌沉淀兩到三次，干燥沉淀，溶于滅菌雙蒸水中，-80°C保存，作為檢測(cè)DNA模板。2.3PCR引物設(shè)計(jì)與合成(I)設(shè)計(jì)鱉甲線粒體DNA 二對(duì)特異寡核苷酸引物，含有鱉甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl (COX I)5' ATACATCCGATACAACAGC 3'5' GATAAATGGGAGATAAGTG 3'Primer2 (cyt b)5' ATCATCCGATCAATAACAG 3'5, AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3,(2)人工合成鱉甲線粒體DNA二對(duì)特異寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成儀(委托上海生工完成)。2.4建立PCR反應(yīng)(a)鑒定反應(yīng):總體系為100 μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 μ L，0.1mM引物I和引物2各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，待測(cè)樣品DNA2 μ L，余為雙蒸餾水。(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng):總體系為100 μ L，其中含有緩沖液IOyL, 12.5mM dNTP4 μ L,0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，中華鱉鱉甲DNA2 μ L，余為雙蒸餾水。(C)陰性對(duì)照反應(yīng):總體系為100 μ L，含有緩沖液10 μ L, 12.5mM dNTP4y L,0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，偽品DNA2 μ L，余為雙蒸餾水。(d)設(shè)計(jì)反應(yīng)程序分別將鑒別鱉甲和偽品PCR檢測(cè)試劑盒的(a)鑒定反應(yīng)體系、
(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系和(c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系的總體系各IOOyL加入反應(yīng)管中，置于PCR反應(yīng)儀(市場(chǎng)有售，任意型號(hào))中按下列程序進(jìn)行:941:預(yù)變性51^11，941: 30s，退火溫度 560C 30s, 720C lmin，40 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min，4°C。3.結(jié)果判定

PCR產(chǎn)物用1.5瓊脂糖凝膠電泳，標(biāo)準(zhǔn)分子量IOObp 1500bp的DNA Marker作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析結(jié)果(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種鱉甲DNA檢測(cè)試劑盒，其特征是，它包含樣本前處理液及脫鈣液、線粒體DNA提取體系、PCR反應(yīng)體系、結(jié)果觀察體系。
(1)樣本前處理液及脫鈣液 (a)前處理液:去離子水。(b)脫鈣液:0.5mol/L ρΗ8.0EDTA0 (2)線粒體DNA提取體系(a)裂解液:10mmol/L Tris-HCl (ρΗ8.0)，IOm mol/L EDTA(ρΗ8.0)，100m mol/L NaCl，2% SDS,40y g/ml 蛋白酶 K，0.039mol/L DTT。
(b)沉淀液:飽和NaAC。
(c)洗滌液:70%乙醇。
(3)PCR反應(yīng)體系 (a)鑒定反應(yīng)體系:總體系為100μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待測(cè)樣品DNA2 5 μ L,余為雙蒸懼水； (b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系:總體系為IOOyL,其中含有緩沖液10yL，12.5mMdNTP4 10μ L,0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，中華鱉鱉甲DNA2 5 μ L，余為雙蒸餾水； (c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系:總體系為100μ L，含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，偽品DNA2 5 μ L,余為雙蒸懼水； (4)結(jié)果觀察體系 (a)瓊脂糖凝膠:1.5 %瓊脂糖。
(b)標(biāo)準(zhǔn)分子量:100bp 1500bp的DNAMarker (可以選用其它種類的標(biāo)準(zhǔn)分子量，要求最大的不能超過(guò)2000bp，要含有IOOObp和500bp)。
2.鱉甲DNA鑒定方法，其特征是，它包含檢測(cè)樣本前處理、線粒體DNA提取、PCR引物設(shè)計(jì)與合成、建立PCR反應(yīng)、結(jié)果判定五個(gè)步驟。
(1)檢測(cè)樣本前處理 每個(gè)樣品取2g，刷洗干凈后用前處理液沖洗干凈，室溫干燥，用紫外燈照射30min以上。使用研缽將樣品研碎至2 3mm左右，置于離心管中，每份按質(zhì)量體積比1: 20加入相應(yīng)體積脫鈣液，56°C水浴48h 60h，轉(zhuǎn)速100r/min。每12h更換一次新鮮的脫鈣液。脫隹丐后8000r/min離心5min棄上清,沉淀待用。
(2)線粒體DNA提取 (a)樣本裂解向經(jīng)過(guò)前處理的樣品中加入5ml裂解液，置于水浴鍋中，56°C水浴過(guò)夜，轉(zhuǎn)速 100r/min。
(b)沉淀直接向裂解后的樣品中加入2ml沉淀液，充分混勻,6，000r/min4°C離心lOmin，吸取上清， 棄沉淀。向上清中加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，混勻后，低溫放置20 30min, 12, 000r/min4°C離心 20min,棄上清，留沉淀。
(c)洗滌使用洗滌液洗滌沉淀兩到三次，干燥沉淀，溶于滅菌雙蒸水中，-80°C保存，作為檢測(cè)DNA模板。(3)PCR引物設(shè)計(jì)與合成 (a)設(shè)計(jì)鳘甲線粒體DNA二對(duì)特異寡核苷酸引物,含有鳘甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl(COX I)5' ATACATCCGATACAACAGC 3'5' GATAAATGGGAGATAAGTG 3'Primer2(cyt b)5' ATCATCCGATCAATAACAG 3'5' AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3' (b)人工合成鱉甲線粒體DNA二對(duì)特異寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成儀(委托上海生工完成)。
(4)建立PCR反應(yīng) (a)鑒定反應(yīng)總體系為100μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM弓丨物I和引物2各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待測(cè)樣品DNA2 5 μ L，余為雙蒸餾水。
(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)總體系為100μ L，其中含有緩沖液IOyL, 12.5mM dNTP4 10 μ L，,0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，中華鱉鱉甲DNA2 5 μ L，余為雙蒸餾水。
(c)陰性對(duì)照反應(yīng)總體系為100μ L，含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，偽品DNA2 ,5 μ L,余為雙蒸懼水。
(d)設(shè)計(jì)反應(yīng)程序分別將鑒別鱉甲和偽品PCR檢測(cè)試劑盒的(a)鑒定反應(yīng)體系、(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系和(c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系的總體系各100 μ L加入反應(yīng)管中，置于PCR反應(yīng)儀(市場(chǎng)有售，任意型號(hào))中按下列程序進(jìn)行:94°C預(yù)變性5min，94°C 30s，退火溫度560C 30s, 720C lmin，40 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min，4°C。
(5)結(jié)果判定 產(chǎn)物用1.5瓊脂糖凝膠電泳，分子量IOObp 1500bp的DNA Marker (標(biāo)準(zhǔn)分子量，市場(chǎng)有售)作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)(市場(chǎng)有售，可購(gòu)買)觀察和分析結(jié)果。同時(shí)出現(xiàn)IOOObp和500bp條帶為正品鱉甲，只出現(xiàn)一條或不出現(xiàn)均為偽品鱉甲。
3.如權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的一種鱉甲DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法，其特征是，所述鱉甲DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法為中華鱉鱉甲。
4.如權(quán)利要求2所述的鱉甲DNA檢測(cè)試劑盒的鑒定方法，其特征是，結(jié)果鑒定是利用比較樣品PCR擴(kuò)增片段DNA大小與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量的相同，根據(jù)出現(xiàn)判定標(biāo)準(zhǔn)完全一致對(duì)鱉甲樣品進(jìn)行真?zhèn)舞b定。
5.一種權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的一種鱉甲DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法，可應(yīng)用于鱉甲樣品的真?zhèn)舞b定。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種鱉甲DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法。一種鱉甲DNA檢測(cè)試劑盒包括樣本前處理液及脫鈣液，線粒體DNA提取體系，PCR反應(yīng)體系，結(jié)果觀察體系四部分組成。一種鱉甲DNA鑒定方法，包括檢測(cè)樣本前處理，線粒體DNA提取，PCR引物設(shè)計(jì)與合成，建立PCR反應(yīng)，結(jié)果判定五步。判斷標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)出現(xiàn)1000bp和500bp條帶為正品鱉甲，只出現(xiàn)一條或不出現(xiàn)均為偽品鱉甲本發(fā)明建立的多重PCR鑒定方法具有簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確同時(shí)區(qū)別鑒別鱉甲和偽品的特異性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103074433SQ201310027918
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者李明成, 苑廣信, 張麗華, 夏薇, 王冰梅 申請(qǐng)人:吉林市雷博科技有限公司