專利名稱：豬細(xì)小病毒vp2親和肽及其編碼核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒VP2親和肽及其編碼核苷酸，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
卩遼菌體表面展不技術(shù)(phagedisplay random peptide library)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的利用噬菌體表達(dá)外源基因的一項(xiàng)分子生物學(xué)新技術(shù)。噬菌體展示技術(shù)所選用的噬菌體載體是絲狀噬菌體，包括Π，fd和M13噬菌體，其中M13噬菌體最為常用。這類單鏈環(huán)狀DNA病毒顆粒的噬菌體，編碼11種蛋白質(zhì)，pII1、pV1、pVI1、pVII1、pIX為其衣殼結(jié)構(gòu)蛋白，其中PVIII蛋白為主要衣殼蛋白，構(gòu)成噬菌體的管狀結(jié)構(gòu)，呈螺旋對稱排列，pill和PVII蛋白位于噬菌體外殼的尾端，是噬菌體吸附宿主菌的結(jié)構(gòu)。目前大多數(shù)基于VP2的研究主要集中在PPV診斷和免疫方面；關(guān)于VP2在PPV感染過程中的作用機(jī)理研究方面的資料較少。目前豬細(xì)小病毒病在我國感染十分嚴(yán)重，陽性率可達(dá)90%以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PPV VP2是構(gòu)成衣殼蛋白的主要成分，其編碼的多肽能自我裝配成類病毒粒子，具有很強(qiáng)的免疫原性，是防治細(xì)小病毒病的主要蛋白。基于傳統(tǒng)疫苗的一些弊端，人工設(shè)計(jì)合成多肽疫苗將成為可能。噬菌體展示技術(shù)在新型疫苗研制上具有獨(dú)特的優(yōu)勢，一是:噬菌體所展示的抗原表位能保持一定的空間構(gòu)象，能有效刺激幾天產(chǎn)生免疫應(yīng)答；二是:噬菌體本身既可以做為載體，又可作為良好的免疫佐劑，能增強(qiáng)免疫效果。同時(shí)，噬菌體展示肽庫技術(shù)對淘選PPV的抗原表位，研究豬細(xì)小病毒表面分子及其結(jié)合的受體，以及病毒侵入宿主細(xì)胞的分子機(jī)制，研制更有效的抗細(xì)小病毒的藥物具有重要意義。1985年，Smith第一次證實(shí)絲狀噬菌體fd基因組可以通過基因工程手段，將目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面。其基本原理為:選擇合適的噬菌體為載體，利用基因工程技術(shù)將 外源基因克隆到其載體上，同時(shí)將外源基因編碼的融合蛋白在噬菌體顆粒表面展示出來，被展示的多肽保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，有利于受體的識別和結(jié)合，從而組成含有多種短肽的庫。外源蛋白或多肽的基因型和表現(xiàn)型的對應(yīng)關(guān)系。噬菌體展示技術(shù)將基因表達(dá)與親和選擇相結(jié)合，其過程是將目的蛋白吸附于固相載體上，如酶標(biāo)板或顆粒物質(zhì)。原始肽庫噬菌體與靶分子短時(shí)間孵育，洗去未結(jié)合的噬菌體，然后用特定的洗脫液將與靶蛋白特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來。擴(kuò)增洗脫后的噬菌體，然后進(jìn)行下一輪淘選，經(jīng)過3 4循環(huán)的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，最終得到高度富集與靶蛋白結(jié)合的序列，然后通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定篩選，獲取真正的目的克隆，通過測定DNA序列，推導(dǎo)其氨基酸序列。最后合成多肽進(jìn)一步研究其生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過噬菌體展示肽庫技術(shù)淘選PPV的抗原表位，提供一種豬細(xì)小病毒VP2親和肽A和B及其編碼核苷酸。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
1、一種豬細(xì)小病毒VP2親和肽A，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。2、如上所述的一種豬細(xì)小病毒VP2親和肽A的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQID N0.2 所示。3、另外一種豬細(xì)小病毒VP2親和肽B，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。4、如上所述的一種豬細(xì)小病毒VP2親和肽B的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQID N0.4 所示。5、一種VP2序列的的擴(kuò)增引物VP2-3和VP2-4，核苷酸序列為:VP2-3:5’ -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3’ ；VP2-4: 5，-CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3，。本研究相對于現(xiàn)有技術(shù)，有如下有點(diǎn)及有益效果:利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫技術(shù)淘選出了與VP2蛋白特異性結(jié)合的多肽。人工合成此短肽，對防治豬細(xì)小病毒病提供了一定的理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。在此基礎(chǔ)上我們擬利用病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)分析并特性鑒定的多肽在細(xì)小病毒感染周期中的作用，為PPV感染和致病機(jī)理的研究提供重要理論依據(jù)，也為尋找PPV VP2抗原表位及病毒侵入細(xì)胞機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。本發(fā)明的多肽由于分子量較小，易穿透進(jìn)入組織，比大蛋白滲透能力更強(qiáng)；半衰期短，在組織中蓄積很少(減少其代謝物引起并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn))；結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且生產(chǎn)成本較低。


圖1是VP2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果；其中M是Marker，I是VP2 基因的擴(kuò)增片段，2是陰性對照；圖2是pET32a_VP2重組表達(dá)載體的PCR鑒定結(jié)果，I是VP2基因的擴(kuò)增片段；圖3是pET32a_VP2重組表達(dá)載體的雙酶切鑒定結(jié)果，I是BamH I和Sal I雙酶切
結(jié)果;圖4是VP2融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中M:低蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；1:空載體菌液；2:未誘導(dǎo)菌液；3 1:誘導(dǎo)I 5h的重組菌；8:超聲破碎后菌體沉淀；9:菌體上清；圖5是噬菌體結(jié)合克隆模板DNA的純化結(jié)果；其中M:DL8000DNA Marker ; I 10:分別對應(yīng)I 10噬菌體結(jié)合克隆模板DNA的純化；圖6是噬菌體PCR純化產(chǎn)物圖；其中M:DL8000DNA Marker ;1 10:分別對應(yīng)I 10噬菌體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖7是噬菌體結(jié)合克隆的ELISA檢測結(jié)果(0D490)；圖8是MTT法體外檢測多肽抑制效果，A為多肽對PPV抑制的MTT結(jié)果，B為多肽對PPV感染細(xì)胞的抑制率；圖9是間接免疫熒光體外檢測多肽抑制效果，ST細(xì)胞對照(A)，100TCID50PPV對照(B)，I 號肽 +PPV (C)，2 號肽 +PPV (D)，1+2 號肽 +PPV (E、F)；
具體實(shí)施例方式本發(fā)明設(shè)計(jì)一對引物，擴(kuò)增得到PPV VP2基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒VP2_pET32a經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在E.coli Rosetta中進(jìn)行高效表達(dá)。以VP2蛋白為靶分子，利用噬菌體隨即十二肽庫，對VP2重組蛋白進(jìn)行了五輪生物淘選，最終篩選出6種親和力的十二肽。將親和力最高和重復(fù)性最好的2個(gè)序列合成十二肽，通過MTT法和免疫熒光試驗(yàn)檢測合成肽體外抗病毒活性良好。本研究結(jié)果為尋找PPV受體奠定了基礎(chǔ)，為今后對PPV的防治及多肽疫苗的研制開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)施例一 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_VP2的構(gòu)建

(I) VP2序列的擴(kuò)增(a)根據(jù)細(xì)菌偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)引物VP2-3和VP2-4VP2-3:5’ -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3，(劃橫線處表示引入的酶切位點(diǎn)為BamHI)VP2-4:5’ -CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3’ (劃橫線處表示引入的酶切位點(diǎn)為 Sail)(b)進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增VP2基因以VP2-3和VP2-4為引物，以VP2-T-6為模板，以ExTaq聚合酶進(jìn)行PCR，VP2的PCR反應(yīng)條件:50iil體系中含有所述PCR反應(yīng)體系為50 ii L，包括5 ii LlOXEasyTaq Buffer、4u L dNTP、I u L VP2-3、I u L VP2_4、0.5u L VP2-T_6、0.5u L ExTaq聚合酶，加無菌水補(bǔ)至50 u L0將混合液在所述的PCR檢測的反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min ;94°C變性Imin ；56°C退火Imin ;72°C延伸2min ;反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72°C再延伸15min。得到VP2序列PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，在1740bp附近存在單一的目標(biāo)條帶，結(jié)果如圖1，表明實(shí)驗(yàn)獲得了與預(yù)期相符的特異DNA片段即VP2基因。(2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_VP2的構(gòu)建將膠純化回收后VP2PCR產(chǎn)物即進(jìn)行BamH I和SalI雙酶切，膠純化回收后，與經(jīng)同樣酶切回收的質(zhì)粒pET32a體外連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-VP2。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)JM109中，37°C培養(yǎng)過夜，Amp+篩選陽性克隆子。實(shí)施例二重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_VP2的PCR及酶切鑒定挑選陽性克隆子，抽提質(zhì)粒pET32a_VP2，以VP2-3和VP2-4為引物進(jìn)行PCR鑒定，并BamH I和Sal I雙酶切，產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，位置與預(yù)測一致。結(jié)果如圖2，表明VP2基因成功連接入pET32a載體中。實(shí)施例三誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET32a_VP2轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加入IPTG使終濃度為0.6mmol/L，37°C振蕩培養(yǎng)。處理試驗(yàn)樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果如圖4。實(shí)施例四噬菌體隨機(jī)十二肽庫對VP2蛋白親和配體的生物淘選及擴(kuò)增根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室成熟的噬菌體淘選技術(shù)，用噬菌體隨機(jī)十二肽庫，對靶分子VP2蛋白進(jìn)行5輪生物淘選。(I)第一輪生物淘選(a) VP2重組蛋白通過0.22 —次性濾器過濾除菌，并測定其濃度，用包被液(0.lmol/L NaHCO3 pH8.6)將VP2蛋白稀釋至IOOy g/mL。以下操作均無菌進(jìn)行，使用滅菌槍頭。(b)ELISA板于紫外燈下照射滅菌30min，每孔加入150iiL VP2蛋白稀釋液。4°C包被過夜。(c)甩掉包被液，倒扣于干凈的紙巾上拍打幾次，以除去殘余液體。每孔加入2001^封阻液，41:放置4h。(d) TBST (TBS+0.1 % [v/v] Tween-20)緩沖液洗板 6 次，每次旋轉(zhuǎn) ELISA 板使孔的底部及邊緣均被洗到，棄去緩沖液，干凈紙巾上拍甩幾次以除去殘余液體。洗滌過程操作要快，以避免板干燥。 (e) I U L噬菌體十二肽原始文庫加入99 ii L的TBS緩沖液，混勻，加入酶標(biāo)板孔中，室溫間隔慢搖40min,即慢搖IOmin,停止IOmin,依次進(jìn)行40min。(f)棄液，倒置于干凈的紙巾上拍打幾次除去殘液。0.1 % TBST洗滌10次，每次甩拍均換干凈的紙巾防止交叉污染。(g)加入洗脫液(0.2mol/L Glycine-HCl pH2.2) 100 u L，室溫慢搖 30min，然后將洗脫液移入無菌微量EP管中，加入中和液(lmol/L Tris-HCl pH9.1) 15 y L以中和洗脫液，即為噬菌體第一輪淘選洗脫物，4 0C保存。(h)測定第一輪淘選洗脫物的滴度。(2)第一輪淘選洗脫物的擴(kuò)增(a)取IOy L第一輪的噬菌體洗脫物，做KT1-KT5稀釋，測定第一輪洗脫的滴度。(b)E.coli ER2 738按1: 100比例接種Low-LB液體培養(yǎng)基(含1%。四環(huán)素)中，37 0C 200rpm 搖床培養(yǎng) 5h。(c)取第一輪洗脫物50 ii L和新活化的E.coli ER273820 u L加入到20mLLow_LB培養(yǎng)物中，37 °C搖床培養(yǎng)4.5h。(d)將培養(yǎng)物分裝IOmL離心管中，4°C、IOOOOrpm離心lOmin。取上清的上部80%轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積PEG8000/NaCl混勻。4°C噬菌體沉降過夜。(e)4°C、IOOOOrpm離心15min。棄去上清液,短暫離心,吸去殘留液體。(f)取ImL TBS重懸沉淀物，懸液移入微量EP管中，4°C、IOOOOrpm離心5min，除去殘余沉淀物。然后將上清轉(zhuǎn)入另一無菌微量EP管中，加入1/6體積的PEG8000/NaCl，4°C沉降 60min。(g) 4°C、IOOOOrpm離心IOmin,棄去上清,短暫離心，用微量移液器吸去殘余液體。用200 ii LTBS重懸沉淀物，4°C、IOOOOrpm離心lmin，除去殘留的不容物沉淀。上清轉(zhuǎn)入滅菌微量EP管中，即為擴(kuò)增產(chǎn)物。(h)取10 ii L擴(kuò)增物做10_8_10_12稀釋，LB/IPTG/Xgal平板測定第一輪淘選擴(kuò)增物的滴度。(3)第二、三輪生物淘選及洗脫物的擴(kuò)增同上(4)第四輪篩選除去pET_32a標(biāo)簽蛋白pET_32a標(biāo)簽蛋白為靶分子，包被ELISA板IOii g/100ii 1，噬菌體與pET_32a標(biāo)簽蛋白作用后，收獲上清即為第四輪淘選洗脫物，通過此過程除去與標(biāo)簽蛋白結(jié)合的噬菌體，得到只于VP2蛋白特異性結(jié)合的噬菌體(5)第五輪生物淘選
噬菌體第五輪淘選。靶蛋白的包被量為4yg/孔，此步得到的終產(chǎn)物即為第五輪的洗脫物，將其做10_2 10_8稀釋，在LB/IPTG/Xgal平板上測定第五輪洗脫物的滴度，4°C避光保存總數(shù)不到100個(gè)噬菌斑的平板。表I噬菌體淘洗產(chǎn)物滴度pfu測定
權(quán)利要求
1.一種豬細(xì)小病毒VP2親和肽A，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
2.一種編碼如權(quán)利要求1所述的一種豬細(xì)小病毒VP2親和肽A的核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
3.一種豬細(xì)小病毒VP2親和肽B，其特征在于:氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所/Jn o
4.一種編碼如權(quán)利要求3所述的一種豬細(xì)小病毒VP2親和肽B的核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.4所示。
5.一種VP2序列的的擴(kuò)增引物VP2-3和VP2-4，其特征在于，核苷酸序列為:VP2-3:5’ -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3’ ；VP2-4:5’ -CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒VP2親和肽A和B及其編碼核苷酸，豬細(xì)小病毒VP2親和肽A，氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。豬細(xì)小病毒VP2親和肽B，氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。還涉及到一對引物VP2-3和VP2-4的核苷酸序列。本發(fā)明的多肽由于分子量較小，易穿透進(jìn)入組織，比大蛋白滲透能力更強(qiáng)；半衰期短，在組織中蓄積很少；結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且生產(chǎn)成本較低。
文檔編號C12N15/35GK103145804SQ201310028148
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者任曉峰, 朱衛(wèi)娟, 斯琴高娃, 任玉東, 李廣興 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)