專利名稱：一種篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌無標(biāo)記基因敲除菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于同源重組原理的無標(biāo)記基因敲除方法和基于￠-半乳糖苷酶活性的雙交換子菌落篩選方法，尤其涉及一種高效篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌(A.thiooxidans)無標(biāo)記基因敲除菌株的方法。
背景技術(shù)：
嗜酸性氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillusthiooxidans,簡稱A.thiooxidans)是一種極端嗜酸性、革蘭氏陰性、專性化能自養(yǎng)細(xì)菌，能利用各種還原性或部分還原性無機(jī)硫化物(RISCs)獲得生長繁殖所需的能量，通過卡爾文循環(huán)固定空氣中的CO2作為主要碳源。在細(xì)菌冶金、煤的脫硫等方面發(fā)揮了重要作用，作為一種重要的浸礦微生物，與嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(A.ferrooxidans)聯(lián)合浸礦能顯著提高后者對硫化礦的浸出效率。但是由于A.thiooxidans的營養(yǎng)類型為專性化能自養(yǎng)菌，具有生長緩慢、代時長和細(xì)胞得率低的特點，且對礦物中所含的某些重金屬離子缺乏抗性，不僅限制了 A.thiooxidans的基礎(chǔ)研究，而且限制了 A.thiooxidans的實際應(yīng)用。為了深入研究A.thiooxidans的基因功能、代謝途徑及其各種抗逆機(jī)制，構(gòu)建高效浸礦工程菌，提高A.thiooxidans的應(yīng)用效能，必須使用分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行遺傳改造，因此，構(gòu)建能對A.thiooxidans進(jìn)行穩(wěn)定遺傳改造的體系是當(dāng)下亟待解決的問題。發(fā)明人的實驗室在國際上率先在A.thiooxidans中建立了基于接合轉(zhuǎn)移原理的遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將具有接合轉(zhuǎn)移功能的廣泛宿主范圍質(zhì)粒從大腸桿菌中轉(zhuǎn)入A.thiooxidans中(Jin SM, YanWM and Wang ZN,Appl.Environ.Microbiol., 1992, Vol.58.N0.1, 429-430),并成功實現(xiàn)了外源基因在A.thiooxidans中的異源表達(dá),提高了 A.thiooxidans外源有機(jī)質(zhì)的利用能力(Tian, KL, Lin JQ, Liu XM, Liu Y，Zhang CK and Yan WM, Biotechnol.Lett., 2003, Vol.25, N0.10, 749-754)。但是以質(zhì)粒形式攜帶外源基因在A.thiooxidans中進(jìn)行表達(dá)的遺傳改 造方法存在以下不足:穩(wěn)定性差，必需使用抗生素保證質(zhì)粒穩(wěn)定存在于A.thiooxidans中；質(zhì)粒上攜帶的外源基因有限,不能對同一種菌多個遺傳性狀進(jìn)行改造。無標(biāo)記基因敲除一這一染色體水平穩(wěn)定的遺傳操作技術(shù)不僅能解決上述問題，還將為A.thiooxidans的遺傳改造提供一種新方法?；蚯贸夹g(shù)是深入研究基因的功能、生長代謝途徑關(guān)鍵酶和穩(wěn)定改良生物遺傳性狀的重要遺傳操作手段。發(fā)明人在嗜酸性硫桿菌屬的嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Wang H，Liu X, Liu S，Yu Y，Lin J, Lin J, Pang X, Zhao J, Appl.Environ.Microbiol.,2012，Vol.78，N0.6，1826-1835，劉相梅，王慧妍，于洋洋，劉雙雙，林建群，林建強(qiáng)，龐昕，極端嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的無標(biāo)記基因敲除方法，國家發(fā)明專利，專利號ZL201110188474.X，授權(quán)公告日2013，01，09)以及發(fā)明人的實驗室在嗜酸性硫桿菌屬的嗜酸性喜溫硫桿菌(林建群，吳燕，張成家，林建強(qiáng)，嗜酸性喜溫硫桿菌的基因無痕敲除和整合方法，國家發(fā)明專利，申請?zhí)?01210089108.3，申請公布日2012，07, 25)中已經(jīng)建立了基于同源重組原理的無標(biāo)記基因敲除方法，使用該方法敲除靶基因后，染色體上不存在抗生素抗性基因的殘留，可適合基因組中多基因敲除和置換的研究。但是，在嗜酸性硫桿菌屬的嗜酸性氧化硫硫桿菌中還沒有無標(biāo)記基因敲除技術(shù)的報道，阻礙了該菌的遺傳改造和應(yīng)用研究，而且在嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌和嗜酸性喜溫硫桿菌已有的無標(biāo)記基因敲除技術(shù)中，雙交換子失去了抗生素抗性基因，由于缺少選擇壓力以及同源重組頻率低，存在雙交換子篩選非常困難的問題，成為整個敲除流程中的瓶頸，需要通過分離純化獲得大量的單菌落，并對每個單菌落逐一進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測篩選和驗證，不僅耗時、耗力、效率低，還增加了實驗的成本。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上嗜酸性氧化硫硫桿菌中尚未建立無標(biāo)記基因敲除技術(shù)以及嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌和嗜酸性喜溫硫桿菌已有的無標(biāo)記基因敲除技術(shù)中存在篩選效率低和工作量大的問題，本發(fā)明提供了一種高效篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌(A.thiooxidans)無標(biāo)記基因敲除菌株的方法。本發(fā)明所述篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌(A.thiooxidans)無標(biāo)記基因敲除菌株方法的技術(shù)方案是:構(gòu)建含有大腸桿菌￠-半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI特異識別作用位點、oriColEl復(fù)制原點、能進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的敲除質(zhì)粒骨架，分別選擇目標(biāo)敲除基因上、下游長度為0.5 2.0kb的同源序列作為上、下游同源臂，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，按照在基因組上的方向分別克隆到敲除質(zhì)粒骨架的多克隆位點中，構(gòu)建目標(biāo)基因的敲除質(zhì)粒，將目標(biāo)基因的敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化具有接合轉(zhuǎn)移功能的E.coliS17-1 A pir作為供體菌,通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入A.thiooxidans受體菌中，在含卡那霉素的平板上獲得發(fā)生第一次同源重組使質(zhì)粒整合到受體菌染色體上的A.thiooxidans單交換子，通過以X-gal作為底物，對單交換子進(jìn)行藍(lán)色菌落驗證，進(jìn)一步設(shè)計引物對藍(lán)色菌落的單交換子進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證，構(gòu)建含有酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI基因、鏈霉素抗性基因以及接合轉(zhuǎn)移功能的廣泛宿主范圍特性的質(zhì)粒作為誘導(dǎo)質(zhì)粒，將誘導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化具有接合轉(zhuǎn)移功能的E.coli S17-1 A pir作為供體菌，通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入A.thiooxidans單交換子·中,在含鏈霉素的平板上獲得導(dǎo)入誘導(dǎo)質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移子,1-SceI基因的表達(dá)產(chǎn)物1-SceI核酸內(nèi)切酶能夠切斷染色體上的1-SceI位點，誘導(dǎo)第二次同源重組，以X-gal作為底物，對獲得的接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行白色菌落初篩，進(jìn)一步設(shè)計引物對白色菌落的雙交換子進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，篩選和驗證發(fā)生了雙交換的突變株，對驗證的目標(biāo)基因敲除突變株在不添加抗生素的無選擇壓力條件下轉(zhuǎn)接3 5次連續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失的A.thiooxidans目標(biāo)基因敲除突變株。上述敲除質(zhì)粒骨架攜帶大腸桿菌P -半乳糖苷酶基因lacZ，用于雙交換子的高效篩選；攜帶酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI特異識別作用位點，用于誘發(fā)第二次同源重組；攜帶多克隆位點MCS，便于同源臂的插入；攜帶接合轉(zhuǎn)移所需的元件oriT區(qū)，使得質(zhì)粒能夠通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入A.thiooxidans細(xì)胞中；攜帶酸性條件下對A.thiooxidans穩(wěn)定有效的卡那霉素抗性基因，用于單交換子篩選；攜帶oriColEl復(fù)制原點，能在大腸桿菌中復(fù)制、而不能在A.thiooxidans 中復(fù)制。上述目標(biāo)基因的敲除質(zhì)粒是通過將要敲除目標(biāo)基因上、下游長度為0.5 2.0kb的上、下游同源臂，按照在基因組上的方向分別克隆至敲除質(zhì)粒骨架的多克隆位點MCS中獲得。上述目標(biāo)基因的敲除質(zhì)粒是通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入具有接合轉(zhuǎn)移功能的大腸桿菌E.coliS17-l A pir作為供體菌,通過接合轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)入A.thiooxidans受體菌中。上述含目標(biāo)基因敲除質(zhì)粒的供體菌與A.thiooxidans受體菌接合培養(yǎng)條件選28 32°C,5 9天,篩選發(fā)生了第一次同源重組的A.thiooxidans單交換子選含80 150ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固體培養(yǎng)基平板，28 32°C培養(yǎng)10 15天。上述驗證A.thiooxidans單交換子的方法是向卡那霉素抗性平板上的單菌落表面滴加0.5 1.5uL濃度為5 20mg/mL的無菌X-gal溶液，28 35°C鮮育20 40min ；挑取藍(lán)色菌落至10 20uL無菌水中，取0.5 1.5uL菌液作模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證。上述誘導(dǎo)質(zhì)粒 攜帶酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI基因，能在A.thiooxidans中表達(dá)出有活性的1-SceI,用于切割A(yù).thiooxidans單交換子染色體上的1-SceI特異識別作用位點，誘發(fā)第二次同源重組；攜帶廣泛宿主范圍特性的復(fù)制原點，能在大腸桿菌和A.thiooxidans中高拷貝自主穩(wěn)定復(fù)制，增加1-SceI酶的表達(dá)量，提高第二次同源重組的頻率；攜帶接合轉(zhuǎn)移必需的oriT區(qū)，能通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入A.thiooxidans中；攜帶在酸性條件下對A.thiooxidan穩(wěn)定有效的鏈霉素抗性基因，便于導(dǎo)入誘導(dǎo)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移子的篩選。上述誘導(dǎo)質(zhì)粒是通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入具有接合轉(zhuǎn)移功能的大腸桿菌E.coliS17-1 A pir作為供體菌,通過接合轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)入A.thiooxidans單交換子中。上述含誘導(dǎo)質(zhì)粒的供體菌與A.thiooxidans單交換子受體菌接合培養(yǎng)條件選28 32°C, 48 72h,篩選導(dǎo)入誘導(dǎo)質(zhì)粒的A.thiooxidans接合轉(zhuǎn)移子選含80 150ug/mL鏈霉素的Starkey-Na2S2O3固體培養(yǎng)基平板，28 32°C培養(yǎng)10 15天。上述初篩A.thiooxidans雙交換子的方法是挑取鏈霉素平板上的接合轉(zhuǎn)移子單菌落至20mL含250 400ug/mL鏈霉素的Starkey-S0液體培養(yǎng)基中，28 32°C培養(yǎng)5 7天，按5 10%的接種量轉(zhuǎn)接20mL上述液體培養(yǎng)基中，28 32°C培養(yǎng)5 7天，取菌液稀釋后涂布已涂布80 150uL的5 20mg/mL X-gal的含80 150ug/mL鏈霉素的Starkey-Na2S2O3培養(yǎng)基平板，28 32°C培養(yǎng)10 15天，獲得發(fā)生第二次同源重組的白色雙交換子。上述篩選和驗證A.thiooxidans目標(biāo)基因敲除突變株的方法是挑取鏈霉素平板上的白色雙交換子單菌落至10 20uL無菌水中，取0.5 1.5uL菌液作模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，從中篩選和驗證發(fā)生了雙交換的突變株。上述獲得誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失的A.thiooxidans目標(biāo)基因敲除突變株的方法是將驗證的目標(biāo)基因敲除突變株稀釋后涂布Starkey-Na2S2O3培養(yǎng)基平板，28 32°C培養(yǎng)10 15天，挑取平板上的單菌落接種到20mL Starkey-S0液體培養(yǎng)基中，28 32°C培養(yǎng)5 7天；再繼續(xù)如上轉(zhuǎn)接3 5次連續(xù)傳代培養(yǎng)，挑取單菌落至10 20uL無菌水中，取0.5 1.5uL菌液作模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證質(zhì)粒丟失。上述Starkey-Na2S2O3 無機(jī)鹽溶液配方為:(NH4) 2S046.0g/L, KH2P026.0g/L, MgSO4 7H201.0g/L, CaCl2 2H200.5g/L，pH4.8，121°C滅菌 20min。
上述Starkey-Na2S2O3 固體培養(yǎng)基配方為:A 液:(NH4)2SO40.6g，KH2PO20.6g，MgSO4
7H201.0g, CaCl2 2H200.05g，蒸餾水 IOOmL, pH4.8，121°C 滅菌 20min ；B 液:瓊脂粉 2g,
蒸餾水 IOOmL, 121°C滅菌 20min ；C 液:Na2S2032.0，F(xiàn)eSO4 7H200.006g 溶解至 IOmL 蒸餾水中，過濾除菌;A液和B液高壓滅菌后冷卻至80V混合，再加入C液混合，制備固體平板。上述Starkey-Na2S2O3固體接合培養(yǎng)基配方為:在上述Starkey-Na2S2O3固體培養(yǎng)基配方A液中加入0.05%酵母粉。上述Starkey-S0 液體培養(yǎng)基配方為:(NH4) 2S042.0g/L, KH2P023.0g/L, MgSO4 7H200.5g/L, CaCl2 2H200.25g/L, FeSO4 7H200.01g/L，濃 H2SO4 調(diào)節(jié)至 pH2.5，121°C 滅菌20min ;硫粉放入試劑瓶中密閉，煮沸3h滅菌，接種后按10g/L加入培養(yǎng)基中。上述篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌無標(biāo)記基因敲除菌株的方法中:所述敲除質(zhì)粒骨架優(yōu)選插入大腸桿菌3 -半乳糖苷酶基因lacZ、oriColEl復(fù)制原點的大腸桿菌質(zhì)粒pKIT。所述目標(biāo)基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建優(yōu)選將目標(biāo)基因上、下游長度為0.9 1.1kb的上、下游同源臂，按照在基因組上的方向分別克隆至敲除質(zhì)粒骨架的多克隆位點MCS中。所述含目標(biāo)基因敲除質(zhì)粒的供體菌與A.thiooxidans受體菌接合培養(yǎng)條件優(yōu)選30°C, 7天,篩選發(fā)生了第一次同源重組的A.thiooxidans單交換子優(yōu)選含100ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固體培養(yǎng)基平板,30°C培養(yǎng)12天，A.thiooxidans單交換子的復(fù)蘇條件優(yōu)選含300 u g/mL卡那霉素的Starkey-S°液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)6天。所述以X-gal作為底物,對A.thiooxidans單交換子進(jìn)行藍(lán)色菌落驗證優(yōu)選向卡那霉素抗性平板上的單菌落表面滴加1.0uL的12mg/mL的無菌X-gal溶液，30°C孵育30mino所述誘導(dǎo)質(zhì)粒優(yōu)選插入1-SceI基因的廣泛宿主范圍特性質(zhì)粒PJRD215。所述含誘導(dǎo)質(zhì)粒的供體菌與受體菌A.thiooxidans單交換子的接合培養(yǎng)條件優(yōu)選30°C,60h,篩選導(dǎo)入誘導(dǎo)質(zhì)粒的A.thiooxidanss接合轉(zhuǎn)移子優(yōu)選含IOOy g/mL鏈霉素的Starkey-Na2S2O3固體培養(yǎng)基平板,30°C培養(yǎng)12天。所述以X-gal作為底物，對獲得的接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行白色菌落初篩優(yōu)選挑取鏈霉素平板上的接合轉(zhuǎn)移子單菌落至20mL含300ug/mL鏈霉素的Starkey_S°液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)6天，按7%的接種量轉(zhuǎn)接20mL上述液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)6天，取菌液稀釋后涂布已涂布IOOuL的12mg/mL X-gal的含100ug/mL鏈霉素的Starkey-Na2S2O3培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)12天，獲得發(fā)生第二次同源重組的白色雙交換子。所述獲得誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失的A.thiooxidans目標(biāo)基因敲除突變株優(yōu)選通過不加鏈霉素的Starkey-S°液體培養(yǎng)30°C培養(yǎng)6天和Starkey-Na2S2O3固體平板30°C培養(yǎng)12天，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次傳代培養(yǎng),獲得誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失的A.thiooxidans目標(biāo)基因敲除突變株。本發(fā)明針對A.thiooxidans中尚未建立無標(biāo)記基因敲除技術(shù)以及嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌和嗜酸性喜溫硫桿菌已有的無標(biāo)記基因敲除技術(shù)中存在篩選效率低和工作量大的問題，提出了一種A.thiooxidans無標(biāo)記基因敲除方法和利用P -半乳糖苷酶藍(lán)白篩選高效篩選A.thiooxidans無標(biāo)記基因敲除菌株的方法。本發(fā)明在國際上率先將無標(biāo)記基因敲除技術(shù)應(yīng)用于A.th iooxidans,尤其率先將基于P -半乳糖苷酶活性的菌落篩選方法應(yīng)用于A.thiooxidans無標(biāo)記基因敲除方法中，實現(xiàn)了通過菌落顏色簡便、快捷篩選雙交換子的目的，克服了嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌和嗜酸性喜溫硫桿菌已有的無標(biāo)記基因敲除流程中因缺少選擇壓力造成的雙交換子篩選困難這一瓶頸，從而大大縮短了雙交換子篩選的時間、提高了雙交換子篩選的效率、減少了篩選的成本。本發(fā)明建立的無標(biāo)記基因敲除技術(shù)第一次同源重組的頻率為2.46±1.21 X IO-7 ;轉(zhuǎn)接2次后發(fā)生第二次同源重組的頻率為
1.21±0.3X10'本發(fā)明能快速、穩(wěn)定、高效地敲除A.thiooxidans的基因，尤其能利用P -半乳糖苷酶藍(lán)白篩選高效篩選A.thiooxidans基因敲除突變菌株，為A.thiooxidans中未知基因功能的研究和代謝途徑中關(guān)鍵酶作用機(jī)制的探索提供了便利，由于所得突變株不攜帶任何抗生素抗性基因，可適合該菌株多基因的敲除和遺傳改造研究，為今后深入研究A.thiooxidans,構(gòu)建高效浸礦A.thiooxidans基因工程菌安全地用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了新途徑。


圖1為用于基因敲除的敲除質(zhì)粒骨架pZK19的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為A.thiooxidans多銅氧化酶基因(cueO)敲除流程圖。圖3為含有酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI基因的誘導(dǎo)質(zhì)粒pJRD215-1-SceI的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為利用P -半乳糖苷酶活性的菌落篩選方法篩選獲得白色A.thiooxidans雙交換子。圖5為A.thiooxidans cueO基因敲除菌株的PCR驗證圖。

圖中:M，Tans2K PlusII DNA Marker,從上到下大小依次為 8，000bp、5, 000bp、3，000bp、2, 000bp、1，000bp、750bp、500bp ；ff,野生型 A.thiooxidans 基因組 DNA 為模板，擴(kuò)增片段大小為3.86kb ；S, A.thiooxidans cueO基因敲除單交換子基因組DNA為模板，擴(kuò)增片段大小為2.7kb ;D，A.thiooxidans cueO基因敲除菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增片段大小為
I1.4kb ;引物是 CueOoutF 和 CueOoutR0圖6為A.thiooxidans cueR基因敲除流程圖。圖7為A.thiooxidans copA基因敲除流程圖。
具體實施例方式一般性說明:本發(fā)明所用極端嗜酸性氧化硫硫桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株A.thiooxidans ATCC19377購自ATCC(美國典型微生物菌種保藏中心)。所述質(zhì)粒pKIT來源見Wang H，LiuX, Liu S，Yu Y，Lin J, Lin J, Pang X, Zhao J.Appl.Environ.Microbiol.,2012，Vol.78，N0.6，1826-1835。所述質(zhì)粒 pUC19RP12 的來源見 Gyorgy Posfai, VitaliyKolisnychenko,Zsuzsa Bereczki, Frederick R Blattner.Nucleic AcidsResearch, 1999, 27:4409 4415。所述質(zhì)粒 pJRD215 來源見 Davison J, HeusterspreuteM, Chevalier M, Ha-Thi V, Brunei F.Gene, 1987，Vol.51，N0.2-3, 275-280。所述質(zhì)粒pUC19購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。所述大腸桿菌菌株JM109和K12購自TaKaRa公司。所述大腸桿菌菌株S17-1 X pir購自濟(jì)南鑫興生物科技有限公司。所用瓊脂糖凝膠回收試劑盒Gel Extraction Kit、質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I和細(xì)菌基因組提取試劑盒Bacterial DNA Kit均購自O(shè)mega生物技術(shù)有限公司。所用DNA聚合酶rTaq DNAPolymerase 和 PrimerSTAR HS DNA Polymerase 購自 TAKARA 公司，TranStart FastPfu DNAPolymerase和TranFast Taq DNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。所用限制性核酸內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自TAKARA公司。所用X-gal購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。Tans2K PlusII Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。實施例1:極端嗜酸性氧化硫硫桿菌多銅氧化酶基因(cueO)的無標(biāo)記敲除1.敲除質(zhì)粒骨架PZK19的構(gòu)建( I)質(zhì)粒pK19的構(gòu)建根據(jù)質(zhì)粒pUC19的序列信息設(shè)計引物擴(kuò)增其復(fù)制原點oriColEl部分:19F: 5, -CAGCGAGCTCGGGATAACGCAGGAAAGA-3'19R: 5' -CAAAGGGCCCTAATAGACTGGATGGAGGCG-3'引物19F的5’端加入Sac I酶切位點，引物19R的5’端加入Apa I酶切位點。兩引物以質(zhì)粒PUC19為模板，通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增獲得帶有PUC19oriColEl的片段。PCR 反應(yīng)體系(25uL)組成如下:5 X PrimerSTAR Buffer (Mg2+plus) 5uL ；dNTPMixture (各 2.5mM)2uL ;引物 19F(IOuM) 0.25uL ;引物 19R(IOuM) 0.25uL ;質(zhì)粒 pUC19 模板0.25uL ；PrimerSTAR HS DNA Polymerase (2.5U/uL) 0.25uL ;水 17uL。PCR 反應(yīng)條件:98°C預(yù)變性 3min，98°C變性 10s，57°C退火 10s，72°C延伸 IminlOs，30個循環(huán)后72°C延伸5min，4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1.llkb。根據(jù)質(zhì)粒pKIT的序列信息設(shè)計引物擴(kuò)增其多克隆位點MCS、接合轉(zhuǎn)移元件oriT、卡那霉素抗性基因Knf及酵母核酸`內(nèi)切酶1-SceI特異識別作用位點部分:KITF:5' -ATACGAGCTCCACCGCGGTG-3'KITR:5' -CGCGGGGCCCCGATCTCAAGAAGATCATC-3'引物KITF5’端加入Sac I酶切位點，引物KITR5’端加入Apa I酶切位點。兩引物以質(zhì)粒pKIT為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得帶有pKIT的多克隆位點MCS、接合轉(zhuǎn)移元件oriT、卡那霉素抗性基因Knf及酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI特異識別作用位點的片段。PCR反應(yīng)體系(25uL)組成如下:5 XPrimerSTAR Buffer (Mg2+plus) 5uL ；dNTP Mixture (各 2.5mM) 2uL ；引物 KITF(IOuM)0.25uL ;引物 KITR(IOuM) 0.25uL ;質(zhì)粒 pKIT 模板 0.25uL ；PrimerSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/uL) 0.25uL ;水 17uL。PCR 反應(yīng)條件同上，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 1.52kb。將以上兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠分離后,用Gel Extraction Kit純化回收，再用Sac I和Apa I兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，獲得2.6kb的中間質(zhì)粒pK19。(2)敲除質(zhì)粒骨架pZK19的構(gòu)建根據(jù)NCBI上E.coli K12MG1655基因組中P -半乳糖苷酶基因(IacZ)序列信息，設(shè)計該基因上、下游引物擴(kuò)增IacZ基因:IacZ-F:5' -TTAGGTACCCATTAGGCACCCCAGGCT-3'IacZ-R:5' -GGTAGGTACCGCGAAATACGGGCAGACAT-3'在兩引物的5’端都加入了 Kpn I酶切位點，以E.coli K12的基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得帶有IacZ基因的片段。PCR反應(yīng)體系(25uL)組成如下:5XTranStartFastPfu Buffer5uL ;dNTP Mixture (各 2.5mM)2uL ;引物 IacZ-F(IOuM)0.5uL ;引物IacZ-R(IOuM)0.5uL ；E.coli K12 基因組DNA模板 IuL ；5XPCR Stimulant2.5uL ；TranStartFastPfu DNA Polymerase0.5uL ;水 13uL。PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 2min，94°C變性 20s，55°C退火 20s，72°C延伸 lmin40s，30個循環(huán)后72°C延伸5min，4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為3.17kb。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠分離后用Gel Extraction Kit純化回收,用Kpn I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時將中間質(zhì)粒PK19也用Kpn I酶切，將酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，獲得5.77kb的敲除質(zhì)粒骨架pZK19 (圖1)。2.A.thiooxidans多銅氧化酶基因(cueO)敲除質(zhì)粒pZKC19的構(gòu)建A.thiooxidans多銅氧化酶基因(cueO)敲除流程圖見圖2。根據(jù)NCBI上公布的A.thiooxidans標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19377的基因組序列信息，設(shè)計引物分別擴(kuò)增cueO基因上、下游部分片段作為敲除該基因的上、下游同源臂:CUHF:5' -GAGAAGCTTGAAGATGCCATTCACTCCG-3'CUHR: 5' -ATAAGGATCCCAGTGGGTGGTTGTGCTCT-3'CDHF:5' -GACGGATCCATCATTGCCACATGCTGGAACAC-3'CDHR: 5' -GATTCTAGATACAGTTTAATCCAGCCTATGCAGC-3'在引物CUHF的5，端加入Hind III酶切位點，在引物CUHR和CDHF的5，端加A BamHI酶切位點，在引物C DHR的5 ’端加入Xba I酶切位點。引物對CUHF/CUHR和CDHF/CDHR，分別以A.thiooxidans ATCC19377基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得用于敲除cueO基因的上、下游同源臂片段。PCR反應(yīng)體系(25uL)組成如下:5XPrimerSTARBuffer (Mg2+Plus)5uL ;dNTP Mixture(各 2.5mM)2uL ;引物對 CUHF/CUHR 或 CDHF/CDHR(IOuM)各 0.25uL ；A.thiooxidans ATCC19377 基因組DNA 模板 0.25uL ；PrimerSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/uL) 0.25uL ;水 17uL。PCR 反應(yīng)條件:98°C 預(yù)變性 3min，98°C 變性 10s，58°C (引物對 CUHF/CUHR)或55°C (引物對CDHF/CDHR)退火10s，72。。延伸lmin，30個循環(huán)后72°C延伸5min，4°C保存。PCR擴(kuò)增的上、下游同源臂產(chǎn)物大小都為0.93kb。將以上PCR產(chǎn)物用Gel Extraction Kit純化后，上游同源臂片段用Hind III和BamH I酶切，同時質(zhì)粒pZK19也用這兩種酶進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pZK19-CUH。然后將下游同源臂用BamH I和Xba I酶切，同時將重組質(zhì)粒pZK19-CUH也用BamH I和Xba I酶切，將酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，獲得cueO基因敲除質(zhì)粒pZKC19。3.A.thiooxidans cueO基因敲除單交換子的獲得(I)質(zhì)粒 pZKCl9 導(dǎo)入 A.thiooxidans ATCCl9377將質(zhì)粒pZKC19 轉(zhuǎn)化 E.coli S17-1 A pir, E.coli S17-1 X pir (pZKC19)作為接合轉(zhuǎn)移供體菌，野生型A.thiooxidans ATCC19377作為接合轉(zhuǎn)移受體菌。將受體菌培養(yǎng)在Starkey-S0液體培養(yǎng)基中，30°C, 180rpm,6天至對數(shù)后期,3，OOOrpm離心30s去除硫粉，10，OOOrpm離心2min收集菌體；供體菌37°C，150rpm培養(yǎng)4h至對數(shù)中期，8，OOOrpm離心Imin收集菌體。收集的菌體分別用Starkey-Na2S2O3無機(jī)鹽溶液洗漆兩次,按供體菌:受體菌1: 1.5的比例混勻，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培養(yǎng)基平板的0.22um濾膜上，30°C培養(yǎng)7天。用Starkey-Na2S2O3無機(jī)鹽溶液將濾膜上的接合菌液洗脫下來，經(jīng)梯度稀釋后涂布到含100ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)12天，平板上長出單菌落。(2)發(fā)生第一次同源重組的A.thiooxidans cueO基因敲除單交換子的驗證發(fā)生第一次同源重組的A.thiooxidans單交換子染色體上含有來自質(zhì)粒pZKC19的卡那霉素抗性基因，因此在含100ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固體培養(yǎng)基平板上長出的單菌落即是A.thiooxidans cueO基因敲除單交換子。向平板上的單菌落表面滴加1.0uL濃度為12mg/mL的無菌X_gal溶液，30°C孵育30min，菌落呈藍(lán)色。挑取藍(lán)色菌落至10 20uL無菌水中，取1.0uL菌液作模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證。分別用以下引物:Plasmid-F:5' -CGGATTGACCGTAATGGGAT-3'CueOinR: 5' -CATTGATGAGAAAGCGGTTACC-3'驗證I型單交換子，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2.05kb (圖2)。CueOinF:5' -GCACGGAAATCTGGGAAGTC-3'Plasmid-R:5' -CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3'驗證II型單交換子，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1.59kb (圖2)。

PCR 反應(yīng)體系(25uL)組成如 T:10XPCR Buffer(Mg2+plus)2.5uL ；dNTPMixture (各 2.5mM) 2uL ；引物對 Plasmid-F/CueOinR 或 CueOinF/Plasmid-R (IOuM)各
0.3uL ;菌液模板 IuL ；rTaq DNA Polymerase (5U/uL) 0.125uL ;水 18.775uL。PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 3min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 2min，30個循環(huán)后72°C延伸5min，4°C保存。根據(jù)計數(shù)抗性平板上的單菌落數(shù)，獲得質(zhì)粒pZKC19轉(zhuǎn)入A.thiooxidansATCC19377并整合在其染色體上的接合轉(zhuǎn)移頻率，即第一次同源重組的頻率約為
2.46±1.21X10—7。4.誘導(dǎo)質(zhì)粒 pJRD215-1_SceI 的構(gòu)建用EcoR I和Sal I酶切質(zhì)粒pUC19RP12，瓊脂糖凝膠電泳分離后用GelExtraction Kit純化回收0.82kb的條帶，該片段含有酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI基因，與同樣經(jīng)EcoR I和Sal I酶切的質(zhì)粒PJRD215連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒 pJRD215-1-SceI，見圖 3。5.A.thiooxidans cueO基因敲除突變株的獲得(I)質(zhì)粒 pJRD215_I_SceI 導(dǎo)入 A.thiooxidans cueO 基因敲除單交換子將質(zhì)粒pJRD215-1_SceI 轉(zhuǎn)化 E.coli S17-1 A pir, E.col iS17-1 A pir (pJRD215-1-SceI)作為接合轉(zhuǎn)移供體菌，A.thiooxidans cueO基因敲除單交換子作為接合轉(zhuǎn)移受體菌。受體菌培養(yǎng)在Starkey-S°液體培養(yǎng)基中，30°C，180rpm，6天至對數(shù)后期，3, OOOrpm離心30s去除硫粉，10, OOOrpm離心2min收集菌體；供體菌37°C, 150rpm培養(yǎng)4h至對數(shù)中期,8，OOOrpm離心Imin收集菌體。將收集的菌體分別用Starkey-Na2S2O3無機(jī)鹽溶液洗滌兩次，按供體菌:受體菌1: 1.5的比例混勻，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培養(yǎng)基平板的0.22um濾膜上，30°C培養(yǎng)60h。
用Starkey-Na2S2O3無機(jī)鹽溶液將濾膜上的接合菌液洗脫下來，經(jīng)梯度稀釋后涂布到含100ug/mL鏈霉素的Starkey-Na2S2O3固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)12天，平板上長出單菌落。(2)發(fā)生第二次同源重組的A.thiooxidans cueO基因敲除突變株的初篩和驗證誘導(dǎo)質(zhì)粒上攜帶鏈霉素抗性基因，在鏈霉素培養(yǎng)基平板上長出的單菌落是導(dǎo)入了誘導(dǎo)質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移子，誘導(dǎo)質(zhì)粒上的1-SceI基因表達(dá)產(chǎn)生酵母核酸內(nèi)切酶1-Scel，誘導(dǎo)發(fā)生第二次同源重組，同時交換下來整合在染色體上的IacZ基因和卡那霉素抗性基因。所以，雙交換子沒有3 -半乳糖苷酶活性，也失去了卡那霉素抗性選擇壓力。挑取鏈霉素平板上的接合轉(zhuǎn)移子單菌落至20mL含300ug/mL鏈霉素的Starkey-S0液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)6天，按7%的接種量轉(zhuǎn)接至20mL上述液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)6天，取菌液稀釋后涂布已涂布100uL12mg/mL X-gal的含100ug/mL鏈霉素的Starkey-Na2S2O3培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)12天，白色菌落即是發(fā)生了第二次同源重組的雙交換子(圖4)。傳代2次后發(fā)生第二次同源重組的頻率為1.21±0.3X 10_2。雙交換子中包括回復(fù)為野生型和cueO基因敲除突變株兩種類型(原理見圖2)，挑取初篩為雙交換子的白色菌落至10 20uL無菌水中，取1.0uL菌液作模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，從中篩選和驗證cueO基因敲除突變株(圖5)。用以下引物:CueOoutF: 5' -CCCTTCATTTCCGTTCATCTG-3'CueOoutR:5' -ACGGATTTCCTGAAGAACCC-3'PCR 反應(yīng)體系(25uL)組成如 T:10XTransFast Taq Buffer2.5uL ；dNTPMixture (各 2.5mM) 2uL ;引物 CueOoutF(IOuM)0.25uL 引物 CueOoutR(IOuM) 0.25uL ;菌液模板 IuL ；TansFast Taq DNA Polymerase (2.5U/uL) 0.25uL ;水 I8.75uL。
·
PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 3min，94°C變性 5s，56°C退火 15s，72°C延伸 2min，30 個循環(huán)后72°C延伸5min，4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小:cue0基因敲除突變株為2.7kb，野生菌菌株為3.86kb (圖5)。(2) A.thiooxidans cueO基因敲除突變株中誘導(dǎo)質(zhì)粒的丟失將PCR擴(kuò)增驗證正確的cueO基因敲除突變株稀釋后涂布不含抗生素的Starkey-Na2S2O3培養(yǎng)基平板,30°C培養(yǎng)12天,挑取平板上的單菌落接種到20mL Starkey-S0液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)6天，再繼續(xù)如上轉(zhuǎn)接4次連續(xù)傳代培養(yǎng)，挑取單菌落至10 20uL無菌水中，取1.0uL菌液作模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證質(zhì)粒丟失。用以下引物:SceIF:5' -GGTCCGAACTCTAAACTGCTG-3'SceIR:5' -GGGATCAGGTACGGTTTGATC-3'PCR 反應(yīng)體系(25uL)組成如 T:10XPCR Buffer(Mg2+plus)2.5uL ；dNTPMixture (各 2.5mM) 2uL ;引物 SceIF(IOuM) 0.25uL 引物 SceIR(IOuM) 0.25uL ;菌液模板 IuL ；rTaq DNAPolymerase(5U/ul)0.125uL ;水 18.875uL。PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 3min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 40s，30個循環(huán)后72°C延伸5min，4°C保存。PCR擴(kuò)增誘導(dǎo)質(zhì)粒上1-SceI基因片段，產(chǎn)物大小為0.62kb，電泳檢測若無該擴(kuò)增條帶，則證明質(zhì)粒已丟失。獲得質(zhì)粒丟失的A.thiooxidanscueO基因敲除突變株。
實施例2:嗜酸性氧化硫硫桿菌MerR家族調(diào)控蛋白基因(cueR)的無標(biāo)記敲除1.A.thiooxidans cueR基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建A.thiooxidans cueR基因敲除流程圖見圖6。敲除質(zhì)粒骨架pZK19的構(gòu)建同實施例I (略)。根據(jù)NCBI上公布的A.thiooxidans標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19377的基因組序列信息，設(shè)計引物分別擴(kuò)增cueR基因上、下游部分片段作為敲除該基因的上、下游同源臂:RUHF: 5' -AAGTCGACCGTGCGTGATGTGGGTTAT-3'RUHR: 5' -CCAAGCTTGACTGAATTTTCACGCTCC-3'RDHF: 5' -CCAAGCTTTGGGATGTGAGTCGGGATC-3'RDHR: 5' -TTTCTAGAGGGTCACCAGCGCGGGAAC-3'在引物RUHF的5’端加入Sal I酶切位點，在引物RUHR和RDHF的5’端加入Hind III酶切位點，在引物RDHR的5’端加入Xba I酶切位點。引物對RUHF/RUHR和RDHF/RDHR，分別以A.thiooxidans ATCC19377基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得用于敲除cueR基因的上、下游同源臂片段。PCR反應(yīng)體系(25uL)組成如下:5XPrimerSTARBuffer (Mg2+Plus) 5uL ;dNTP Mixture (各 2.5mM)2uL ;引物對 RUHF/RUHR 或 RDHF/RDHR(IOuM)各 0.25uL ；A.thiooxidans ATCC19377 基因組DNA 模板 0.25uL ；PrimerSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/uL) 0.25uL ;水 17uL。PCR 反應(yīng)條件:98°C預(yù)變性 3min，98°C變性 10s，59。。退火 10s，72。。延伸 lmin,30個循環(huán)后72°C延伸5m in，4°C保存。PCR擴(kuò)增的上、下游同源臂產(chǎn)物大小都為0.93kb。將以上PCR產(chǎn)物用Gel Extraction Kit純化后，上游同源臂片段用Sal I和HindIII酶切，同時質(zhì)粒pZK19也用這兩種酶進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pZK19-RUH。然后將下游同源臂用Hind III和Xba I酶切，同時將重組質(zhì)粒pZK19-RUH也用Hind III和Xba I酶切，將酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，獲得cueR基因敲除質(zhì)粒pZKR19 (圖6)。2.A.thiooxidans cueR基因敲除單交換子的獲得(I)質(zhì)粒 pZKRl9 導(dǎo)入 A.thiooxidans ATCCl9377將質(zhì)粒pZKR19 轉(zhuǎn)化 E.coli S17-1 Apir, E.coli S17-1 X pir (pZKR19)作為接合轉(zhuǎn)移供體菌，野生型A.thiooxidans ATCC19377作為接合轉(zhuǎn)移受體菌。接合轉(zhuǎn)移子的獲得與實施例1相同(略)。(2)發(fā)生第一次同源重組的A.thiooxidans cueR基因敲除單交換子的驗證發(fā)生第一次同源重組的A.thiooxidans cueR基因敲除單交換子的驗證同實施例1 (略)，其中設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證的引物如下:Plasmid-F:5' -CGGATTGACCGTAATGGGAT-3'(同實施例1)CueRinR: 5' -GTCAGGGAAAAACCCAGATTC-3'驗證I型單交換子，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1.87kb (圖6)。CueRinF: 5' -CGGCCATGGTTCAGTAGAC-3'Plasmid-R:5' -CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3'(同實施例1)驗證II型單交換子，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1.46kb (圖6)。3.A.thiooxidans cueR基因敲除突變株的獲得
誘導(dǎo)質(zhì)粒pJRD215_I_SceI的構(gòu)建、誘導(dǎo)質(zhì)粒pJRD215_I_SceI 轉(zhuǎn)入 A.thiooxidanscueR基因敲除單交換子、使用基于￠-半乳糖苷酶活性的菌落篩選方法初篩發(fā)生了第二次同源重組的雙交換子等原理與操作與實施例1相同(略)。雙交換子中包括回復(fù)為野生型和cueR基因敲除突變株兩種類型，挑取初篩為雙交換子的白色菌落至10 20uL無菌水中，取1.0uL菌液作模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，從中篩選和驗證cueR基因敲除突變株。PCR反應(yīng)體系的組成和PCR反應(yīng)條件同實施例1 (略)。其中使用的引物為:CueRoutF: 5' -CGGGGTCGCATTACTGGTT-3'CueRoutR: 5' -CTACAGCAACCAGCATTGAAGGC-3'PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小:cueR基因敲除突變株為1.15kb，野生菌菌株為1.65kb(圖6)。A.thiooxidans cueR基因敲除突變株中誘導(dǎo)質(zhì)粒的丟失操作及驗證與實施例1相同(略)。 實施例3:嗜酸性 氧化硫硫桿菌copA基因的無標(biāo)記敲除1.A.thiooxidans copA基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建A.thiooxidans copA基因敲除流程圖見圖7。敲除質(zhì)粒骨架pZK19的構(gòu)建見實施例I (略)。根據(jù)NCBI上公布的A.thiooxidans標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19377的基因組序列信息，設(shè)計引物分別擴(kuò)增copA基因上、下游部分片段作為敲除該基因的上、下游同源臂:AUHF: 5' -TATGTCGACCGATCCAGTGCCATTTCCAG-3'AUHR: 5' -GTGAAGCTTCTGCAGGAAGCACAGGTCATC-3'ADHF: 5' -CTCAAGCTTCGTTTGAAGTGGCTGCGTC-3'ADHR: 5' -CTTTCTAGAAGCCAGGTTGCCAGACCATC-3'在引物AUHF的5’端加入Sal I酶切位點，在引物AUHR和ADHF的5’端加入Hind111酶切位點，在引物ADHR的5，端加入Xba I酶切位點。弓丨物對AUHF/AUHR和ADHF/ADHR，分別以A.thiooxidans ATCC19377基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得用于敲除copA基因的上、下游同源臂片段。PCR反應(yīng)體系組成及PCR反應(yīng)條件與實施例2相同(略)。上、下游同源臂片段克隆至敲除質(zhì)粒骨架pZK19上獲得copA基因敲除質(zhì)粒pZKA19(同實施例2，略)(圖7)。2.A.thiooxidans copA基因敲除單交換子的獲得copA基因敲除質(zhì)粒pZKA19導(dǎo)入A.thiooxidans ATCC19377獲得接合轉(zhuǎn)移子的操作與實施例1相同(略)。發(fā)生第一次同源重組的A.thiooxidans copA基因敲除單交換子的篩選和驗證(同實施例1，略)，其中設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證的引物如下:Plasmid-F:5' -CGGATTGACCGTAATGGGAT-3'(同實施例1)CopAinR: 5' -CTCAAATTCACGCTGGCCTG-3'驗證I型單交換子，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2.87kb (圖7)。CopAinF: 5' -GGATTTCAGCTGAATCCCATGC-3'Plasmid-R:5' -CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3'(同實施例1)驗證II型單交換子，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1.95kb (圖7)。
3.A.thiooxidans copA基因敲除突變株的獲得誘導(dǎo)質(zhì)粒pJRD215_I_SceI的構(gòu)建、誘導(dǎo)質(zhì)粒pJRD215_I_SceI 轉(zhuǎn)入 A.thiooxidanscopA基因敲除單交換子、使用基于P -半乳糖苷酶活性的菌落篩選方法初篩發(fā)生了第二次同源重組的雙交換子等原理與操作與實施例1相同(略)。雙交換子中包括回復(fù)為野生型和copA基因敲除突變株兩種類型，挑取初篩為雙交換子的白色菌落至10 20uL無菌水中，取1.0uL菌液作模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，從中篩選和驗證copA基因敲除突變株。PCR反應(yīng)體系的組成和PCR反應(yīng)條件同實施例1 (略)。其中使用的引物為:CopAoutF: 5' -CGATATGCCGGTCTTGAAAC-3'CopAoutR: 5' -CGTAAAATGGTGACATCACTGC-3'
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小:copA基因敲除突變株為3.15kb，野生菌菌株為5.51kb(圖7)。A.thiooxidans copA基因敲除突變株中誘導(dǎo)質(zhì)粒的丟失操作及驗證與實施例1相同(略)。以上具體描述了本發(fā)明技術(shù)方案的操作實例，不視為對本發(fā)明的應(yīng)用限制。凡操作條件的等同替換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌無標(biāo)記基因敲除菌株的方法，步驟包括: (1)構(gòu)建含有大腸桿菌P-半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI特異識別作用位點、oriColEl復(fù)制原點、能進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的敲除質(zhì)粒骨架； (2)分別選擇目標(biāo)敲除基因上、下游長度為0.5 2.0kb的同源序列作為上、下游同源臂，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，按照在基因組上的方向分別克隆到敲除質(zhì)粒骨架的多克隆位點中，構(gòu)建目標(biāo)基因的敲除質(zhì)粒； (3)將目標(biāo)基因的敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化具有接合轉(zhuǎn)移功能的E.coli 317-1入!)化作為供體菌，分別收集培養(yǎng)至對數(shù)中期的供體菌細(xì)胞和對數(shù)后期的A.thiooxidans受體菌細(xì)胞，按照供體菌:受體菌為1:1 1:2的比例混勻，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培養(yǎng)基平板的濾膜上，28 32 °C培養(yǎng)5 9天，用Starkey-Na2S2O3無機(jī)鹽溶液將濾膜上的菌體洗脫下來，經(jīng)梯度稀釋后涂布到含80 150ug/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固體培養(yǎng)基平板上，28 32°C培養(yǎng)10 15天，獲得具有卡那霉素抗性的接合轉(zhuǎn)移子即A.thiooxidans單交換子； (4)以X-gal作為底物，對單交換子進(jìn)行藍(lán)色菌落驗證，進(jìn)一步設(shè)計引物對藍(lán)色菌落的單交換子進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證，證明單交換子發(fā)生了第一次同源重組使目標(biāo)基因的敲除質(zhì)粒整合到受體菌染色體上； (5)構(gòu)建含有酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI基因、鏈霉素抗性基因以及接合轉(zhuǎn)移功能的廣泛宿主范圍特性的質(zhì)粒，作為誘導(dǎo)質(zhì)粒； (6)將誘導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化具有接合轉(zhuǎn)移功能的E.coli S17-1 Xpir作為供體菌，以A.thiooxidans單交換子作為受體菌，分別收集培養(yǎng)至對數(shù)中期的供體菌細(xì)胞和對數(shù)后期的受體菌細(xì)胞，按照供體菌:受體菌為1:1 1:2的比例混勻，涂在放置于Starkey-Na2S2O3接合培養(yǎng)基平板的濾膜上，28 32°C培養(yǎng)48 72h后，用Starkey-Na2S2O3無機(jī)鹽溶液將濾膜上的菌體洗脫下來，經(jīng)梯度稀釋后涂布到含80 150ug/mL鏈霉素的Starkey-Na2S2O3固體培養(yǎng)基平板上，28 32°C培養(yǎng)10 15天，獲得導(dǎo)入誘導(dǎo)質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移子； (7)以X-gal作為底物，對獲得的接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行白色菌落初篩，進(jìn)一步設(shè)計引物對白色菌落的雙交換子進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳篩選驗證，獲得發(fā)生第二次同源重組且實現(xiàn)目標(biāo)基因敲除的A.thiooxidans突變株； (8)對驗證的目標(biāo)基因敲除突變株在不添加抗生素的無選擇壓力條件下轉(zhuǎn)接3 5次連續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失的A.thiooxidans目標(biāo)基因敲除突變株； 其特征是: 步驟(1)所述構(gòu)建含有大腸桿菌3 -半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI特異識別作用位點、oriColEl復(fù)制原點、能進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的敲除質(zhì)粒骨架的方法是:選擇含有卡那霉素抗性基因、含有多克隆位點MCS便于同源臂的插入、含有接合轉(zhuǎn)移元件oriT區(qū)便于通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入A.thiooxidans細(xì)胞、含有18bp的酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI特異識別作用位點便于誘發(fā)第二次同源重組、含有oriColEl復(fù)制原點、不能在A.thiooxidans中自主復(fù)制的大腸桿菌質(zhì)粒，插入大腸桿菌3 -半乳糖苷酶基因IacZ獲得敲除質(zhì)粒骨架； 步驟(4)所述以X-gal作為底物，對單交換子進(jìn)行藍(lán)色菌落驗證，進(jìn)一步設(shè)計引物對藍(lán)色菌落的單交換子進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證，證明單交換子發(fā)生了第一次同源重組使目標(biāo)基因的敲除質(zhì)粒整合到受體菌染色體上的方法是:將0.5 1.5uL的5 20mg/mL無菌X-gal溶液，滴加到卡那霉素抗性平板上的單菌落表面，28 35°C放置20 40min,挑取藍(lán)色菌落至10 20uL無菌水中，取0.5 1.5uL菌液作模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證；將驗證正確的菌液接種到20mL含250 400ug/mL卡那霉素的Starkey-S°液體培養(yǎng)基中，28 35°C培養(yǎng)5 7天后轉(zhuǎn)接到IOOmL含250 400ug/mL卡那霉素的Starkey-S°液體培養(yǎng)基中，28 32°C培養(yǎng)5 7天； 步驟(5)所述構(gòu)建含有酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI基因、鏈霉素抗性基因以及接合轉(zhuǎn)移功能的廣泛宿主范圍特性的質(zhì)粒，作為誘導(dǎo)質(zhì)粒的方法是:選擇具有廣泛宿主范圍特性的復(fù)制原點、能在E.coli和A.thiooxidans中均能自主穩(wěn)定復(fù)制、拷貝數(shù)相對較高、攜帶鏈霉素抗性基因和接合轉(zhuǎn)移元件oriT區(qū)的質(zhì)粒；導(dǎo)入酵母核酸內(nèi)切酶1-SceI基因，構(gòu)成攜帶1-SceI基因的誘導(dǎo)質(zhì)粒； 步驟(7)所述以X-gal作為底物，對獲得的接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行白色菌落初篩，進(jìn)一步設(shè)計引物對白色菌落的雙交換子進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳篩選驗證，獲得發(fā)生第二次同源重組且實現(xiàn)目標(biāo)基因敲除的A.thiooxidans突變株的方法是:挑取鏈霉素平板上的接合轉(zhuǎn)移子單菌落至20mL含250 400ug/mL鏈霉素的Starkey-S0液體培養(yǎng)基中，28 32°C培養(yǎng)5 7天，按5 10%的接種量轉(zhuǎn)接20mL上述液體培養(yǎng)基中，28 32°C培養(yǎng)5 7天，取菌液稀釋后涂布已涂布80 150uL的5 20mg/mL X-gal的含80 150ug/mL鏈霉素的Starkey-Na2S2O3培養(yǎng)基平板，28 32°C培養(yǎng)10 15天，挑取白色菌落至10 20uL無菌水中，取0.5 1.5uL菌液作模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，從中篩選和驗證發(fā)生了雙交換的突變株；將驗證的突變株菌液接種到20mL Starkey-Sci液體培養(yǎng)基中，28 32°C培養(yǎng)5 7天，獲得發(fā)生第二次同源重組且實現(xiàn)目標(biāo)基因敲除的A.thiooxidans突變株； 步驟(8)所述對驗證的目標(biāo)基因敲 除突變株在不添加抗生素的無選擇壓力條件下轉(zhuǎn)接3 5次連續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失的A.thiooxidans目標(biāo)基因敲除突變株的方法是:將驗證的目標(biāo)基因敲除突變株稀釋后涂布Starkey-Na2S2O3培養(yǎng)基平板，28 32°C培養(yǎng)10 15天，挑取平板上的單菌落接種到20mL Starkey-S0液體培養(yǎng)基中，28 32°C培養(yǎng)5 7天；再繼續(xù)如上轉(zhuǎn)接3 5次連續(xù)傳代培養(yǎng)，挑取單菌落至10 20uL無菌水中，取·0.5 1.5uL菌液作模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證質(zhì)粒丟失； 上述 Starkey-Na2S2O3 無機(jī)鹽溶液配方為:(NH4) 2S046.0g/L，KH2P026.0g/L，MgSO4 7H201.0g/L, CaCl2 2H200.5g/L，pH4.8，121°C滅菌 20min ; 上述 Starkey-Na2S2O3 固體培養(yǎng)基配方為:A 液:(NH4)2SO40.6g，KH2PO20.6g，MgSO4 7H201.0g，CaCl2 2H200.05g，蒸餾水 100mL，pH4.8，121°C 滅菌 20min ;B 液:瓊脂粉 2g，蒸餾水 IOOmL, 121°C滅菌 20min ；C 液:Na2S2032.0gjFeSO4 7H200.006g 溶解至 IOmL 蒸餾水中，過濾除菌;A液和B液高壓滅菌后冷卻至80V混合，再加入C液混合，制備固體平板； 上述Starkey-Na2S2O3固體接合培養(yǎng)基配方為:在上述Starkey-Na2S2O3固體培養(yǎng)基配方A液中加入0.05%酵母粉； 上述 Starkey-S0 液體培養(yǎng)基配方為:(NH4) 2S042.0g/L, KH2P023.0g/L, MgSO4 7H200.5g/L, CaCl2 2H200.25g/L, FeSO4 7H200.01g/L，濃 H2SO4 調(diào)節(jié)至 pH2.5，121°C 滅菌20min ;硫粉放入試劑瓶中密閉，煮沸3h滅菌，接種后按10g/L加入培養(yǎng)基中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌無標(biāo)記基因敲除菌株的方法，其特征是:步驟(I)所述敲除質(zhì)粒骨架選插入大腸桿菌3 -半乳糖苷酶基因lacZ、oriColEl復(fù)制原點的大腸桿菌質(zhì)粒pKIT。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌無標(biāo)記基因敲除菌株的方法，其特征是:步驟(4)所述以X-gal作為底物,對A.thiooxidans單交換子進(jìn)行藍(lán)色菌落驗證選向卡那霉素抗性平板上的單菌落表面滴加1.0uL的12mg/mL的無菌X-gal溶液，30°C孵育30mino
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌無標(biāo)記基因敲除菌株的方法，其特征是:步驟(5)所述誘導(dǎo)質(zhì)粒是插入1-SceI基因的廣泛宿主范圍特性質(zhì)粒PJRD215。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌無標(biāo)記基因敲除菌株的方法，其特征是:步驟(7)所述以X-gal作為底物，對獲得的接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行白色菌落初篩選挑取鏈霉素平板上的接合轉(zhuǎn)移子單菌落至20mL含300ug/mL鏈霉素的Starkey_S°液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)6天，按7%的接種量轉(zhuǎn)接20mL上述液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)6天，取菌液稀釋后涂布已涂布IOOuL的12mg/mL X-gal的含100ug/mL鏈霉素的Starkey-Na2S2O3培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)12天，獲得發(fā)生第二次同源重組的白色雙交換子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌無標(biāo)記基因敲除菌株的方法，其特征是:步驟(8)所述獲得誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失的A.thiooxidans目標(biāo)基因敲除突變株選通過不加鏈霉素的Starkey-S°液體培養(yǎng)30°C培養(yǎng)6天和Starkey-Na2S2O3固體平板30°C培養(yǎng)12天，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次傳代培養(yǎng),獲得誘導(dǎo)質(zhì)粒丟 失的A.thiooxidans目標(biāo)基因敲除突變株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選嗜酸性氧化硫硫桿菌無標(biāo)記基因敲除菌株的方法，采用構(gòu)建目標(biāo)基因的敲除質(zhì)粒和攜帶I-SceI基因的誘導(dǎo)質(zhì)粒，通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入嗜酸性氧化硫硫桿菌中，使用抗性標(biāo)記篩選單交換子，使用藍(lán)白篩選初篩雙交換子。本發(fā)明首次建立了嗜酸性氧化硫硫桿菌的無標(biāo)記基因敲除方法，首次將β-半乳糖苷酶藍(lán)白篩選應(yīng)用于雙交換子的篩選，不僅能快速、穩(wěn)定、高效地敲除目標(biāo)基因，而且克服了已有無標(biāo)記基因敲除流程中因缺少選擇壓力造成的篩選困難這一瓶頸，縮短了雙交換子篩選時間、提高了篩選效率、減少了篩選成本，為嗜酸性氧化硫硫桿菌穩(wěn)定的遺傳改造提供了便利的新方法。
文檔編號C12N15/09GK103232994SQ20131002990
公開日2013年8月7日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者劉相梅, 文晴, 王慧妍, 林建群 申請人:山東大學(xué)