專利名稱：高效裂解串聯(lián)基因，高效裂解質(zhì)粒及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種由噬菌體PhiX174突變裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA組成的聞效裂解串聯(lián)基因，含有此聞效裂解串聯(lián)基因的聞效裂解質(zhì)粒及構(gòu)建方法，還涉及所述高效裂解質(zhì)粒在制備菌蛻中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)菌菌蛻(Bacterial Ghosts, BGs)是革蘭氏陰性菌被噬菌體PhiX174的裂解蛋白E裂解后形成的完整的細(xì)菌空殼。裂解蛋白E是由91個(gè)氨基酸組成的疏水跨膜蛋白，其本身不具有任何酶的活性，但可通過(guò)寡聚化介導(dǎo)跨膜孔道的形成?？椎佬纬珊?，在細(xì)胞內(nèi)高滲透壓的作用下革蘭氏陰性菌的大部分胞質(zhì)內(nèi)容物由孔道排出，從而形成不含核酸、核糖體及其它組分的細(xì)菌空殼。這種非變性的基因滅活方式使菌蛻完好地保留了細(xì)菌的各種表面抗原成分和免疫粘附分子。因此，菌蛻不僅可以直接作為疫苗使用，而且還可作為遞呈異源抗原的重組疫苗及作為核酸疫苗甚至藥物的遞送載體。細(xì)菌菌蛻的形成是通過(guò)對(duì)裂解基因E的嚴(yán)格表達(dá)調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，應(yīng)用最廣泛的是入pL/pR-cI857溫控表達(dá)系統(tǒng)?；駿的溫控表達(dá)介導(dǎo)的細(xì)菌裂解已經(jīng)成功地應(yīng)用于很多革蘭氏陰性菌，例如:大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺旋桿菌、胸膜肺炎放射桿菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯氏菌、巴氏桿菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、愛(ài)德華菌等。因此，推測(cè)只要將基因E裂解框引入到合適的載體中，E蛋白介導(dǎo)的裂解可能會(huì)在每種革蘭氏陰性菌中發(fā)生。然而，E蛋白介導(dǎo)的裂解過(guò)程依賴于宿主細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，要求宿主細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，OD600值在0.2 0.6之間，這致使菌蛻的產(chǎn)量偏低，限制了菌蛻的大規(guī)模生產(chǎn)。即使宿主細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，E蛋白介導(dǎo)的裂解過(guò)程并不能使所有細(xì)菌失活。有研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)控大腸桿菌菌蛻的形成，在菌蛻制劑中未裂解的可繁殖細(xì)胞最低比率也達(dá)到1%，還存在約4%裂解 不完全的失活細(xì)胞。在這些未裂解和裂解不完全的失活細(xì)胞中存在著大量的細(xì)菌遺傳物質(zhì)，使菌蛻存在著病原決定簇基因或抗生素基因側(cè)向傳播的風(fēng)險(xiǎn)。菌蛻要作為疫苗或分子遞送載體使用，必須克服裂解效率低、產(chǎn)量低及菌蛻中存在的不安全因素等難題。因此，本領(lǐng)域需要更為安全、高效的裂解質(zhì)粒，并應(yīng)用該質(zhì)粒制備安全的菌蛻制劑。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述背景技術(shù)中提到的裂解效率低、產(chǎn)量低及菌蛻中存在的不安全因素等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種由噬菌體PhiX174突變裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA組成的聞效裂解串聯(lián)基因，含有此聞效裂解串聯(lián)基因的聞效裂解質(zhì)粒及構(gòu)建方法。本發(fā)明還提供了所述高效裂解質(zhì)粒在制備菌蛻中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的:
一種由噬菌體PhiX174突變裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA組成的高效裂解串聯(lián)基因，基因序列如序列表中序列3所不。
含有上述所述的聞效裂解串聯(lián)基因的聞效裂解質(zhì)粒。所述的高效裂解質(zhì)粒，將所述的高效裂解串聯(lián)基因酶切后插入PBV220載體中。所述的高效裂解質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
(1)以噬菌體PhiX174RFI DNA為模板、以序列表中的序列4和序列5為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得突變裂解基因E ;
(2)以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板、序列表中序列6和序列7為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得葡萄球菌核酸酶A基因；
(3)將步驟(I)中得到的突變裂解基因E和步驟(2)中得到的葡萄球菌核酸酶A基因作為下一步PCR反應(yīng)的模板，用序列表中的序列4和序列7進(jìn)行擴(kuò)增，得到串聯(lián)基因；
(4)將串聯(lián)基因應(yīng)用I和I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)I和Sall雙酶切的pBV220載體連接，得到高效裂解質(zhì)粒。將步驟(4)得到的高效裂解質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5CI感受態(tài)細(xì)胞，30°C過(guò)夜培養(yǎng)16 h，挑取單菌落于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中30°C過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，保留鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒。所述的高效裂解質(zhì)粒在制備菌蛻中的應(yīng)用。所述的菌蛻優(yōu)選為腸桿菌科的菌蛻。所述的應(yīng)用，包括以下步驟:
(1)將含有高效裂解質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α在30°C培養(yǎng)至OD6tltl值達(dá)到1.0-1.2 ；
(2)培養(yǎng)溫度升高至42°C誘導(dǎo)高效裂解串聯(lián)基因的表達(dá)；
(3)在升溫誘導(dǎo)90min時(shí)添加終濃度為IOmM的CaCl2和I mM的MgCl2，來(lái)激活SNA的活性；
(4)升溫誘導(dǎo)4h時(shí)，收集步驟(3)獲得的菌蛻，洗滌后保存。有益效果:本發(fā)明構(gòu)建的安全高效的裂解質(zhì)粒pBV-mELS能夠在大腸桿菌菌液0D_值達(dá)到1.0以上時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，裂解效率可到達(dá)99.99995%，不僅突破了裂解基因E介導(dǎo)的裂解過(guò)程依賴宿主細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)(OD6c 為0.4 0.6)的局限性，大大提高了菌蛻的產(chǎn)量，還能夠有效清除菌蛻中殘存的遺產(chǎn)物質(zhì)，降低了危害性遺傳元件(抗生素抗性基因和病原決定族基因)的側(cè)向傳播。


附圖1本發(fā)明構(gòu)建的安全高效的裂解質(zhì)粒pBV-mELS的物理圖譜；
附圖2大腸桿菌DH5a (pBV-mELS)的裂解動(dòng)力學(xué)曲線；
附圖3大腸桿菌DH5a (pBV-mELS)在裂解過(guò)程中菌體和上清中遺傳物質(zhì)的定量分析； 附圖4大腸桿菌DH5a (pBV-mELS)在裂解過(guò)程中菌體和上清中遺傳物質(zhì)的電泳分析， 其中A為菌體中基因組DNA，B為菌體中質(zhì)粒DNA，C為培養(yǎng)物上清中DNA ；
附圖5大腸桿菌DH5a (pBV-mELS)菌蛻的掃描電鏡照片；
附圖6大腸桿菌DH5 a (pBV-mE)的裂解動(dòng)力學(xué)曲線；
附圖7大腸桿菌DH5 a (pBV-mE)在裂解過(guò)程中菌體和上清中遺傳物質(zhì)的定量分析； 附圖8大腸桿菌DH5 a (pBV-mE)在裂解過(guò)程中菌體和上清中遺傳物質(zhì)的電泳分析， 其中自左至右依次為菌體中基 因組DNA、菌體中質(zhì)粒DNA、培養(yǎng)物上清中DNA。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡釋本發(fā)明，本發(fā)明構(gòu)建的安全高效的裂解質(zhì)粒PBV-mELS的結(jié)構(gòu)特征和優(yōu)勢(shì)將隨著描述而更為清晰。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、安全高效的裂解質(zhì)粒pBV-mELS的構(gòu)建 1.1噬菌體PhiX174突變裂解基因E的PCR擴(kuò)增
根據(jù)GenBank中PhiX174 (GenBank N0.J02482.1)裂解基因E的編碼序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)將點(diǎn)突變引入引物，擴(kuò)增突變裂解基因E (mE)。在引物mE-F的5’端引入I限制性酶切位點(diǎn)，在引物mE-R的5’端引入15個(gè)氨基酸(Gly4Ser) 3序列作為L(zhǎng)inker,預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為327 bp ο引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下:
mE-F:5’ - GCGAATTCTGGTACGCTGGACTTTGTG -3’，(見(jiàn)序列表中序列 4)mE-R:5’_ GCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACC CTCCTTCCGCAC-3’，(見(jiàn)序列表中序列5)
以PhiX174 RFI DNA為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增突變裂解基因E。PCR反應(yīng)體系為50 yL中，含 IOXDreamTaq Buffer (Mg2+ Plus) 5 μ L, dNTP Mixture 200 μ M, PhiX174 RFI DNA 2ng,mE_F 和 mE_R 各 0.8 μ Μ, Fermentas DreamTaq 1.25 U。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min ；94°C 40s, 60°C 90 s，每個(gè)循環(huán)降低 0.5°C，72°C 40s，20 個(gè)循環(huán)；94°C 40s, 55°C 60s，72°C 40 s, 30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收約320bp的片段，即為突變裂解基因E (見(jiàn)序列表中序列I)的PCR產(chǎn)物。1.2葡萄球菌核酸酶 A基因的PCR擴(kuò)增
根據(jù)Genbank上的金黃色葡萄球菌核酸酶A(SNA)基因(GenBank N0.NC_003923)的序列設(shè)計(jì)引物，引物橫跨SNA成熟蛋白的編碼區(qū)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為506 bp。在引物SNA-F的5，端引入15個(gè)氨基酸(Gly4Ser)3序列作為L(zhǎng)inker,在引物SNA-R的5，端引入5^7 I限制性酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下:
SNA-F:5，_ AGGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGC AACTTCAACT-3’(見(jiàn)序列表中序列6)
SNA-R:5’ - GCGTCGACTTATTGACCTGAATCAGCGT -3’(見(jiàn)序列表中序列 7)
應(yīng)用酚/氯仿抽提法提取金黃色葡萄球菌的基因組DNA，作為PCR模板，以SNA-F和SNA-R為引物，擴(kuò)增不包含信號(hào)肽序列的SNA基因。PCR反應(yīng)體系為50yL中，含IOXDreamTaq BufferCMg2+ Plus)5 μ L, dNTP Mixture 200 μ M，基因組DNA 3 μ L, SNA-F和 SNA-R 各 0.8 μ M, Fermentas DreamTaq 1.25 U。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5 min ；94°C 40s, 60°C 90 s，每個(gè)循環(huán)降低 0.5°C，72°C 40 s，20 個(gè)循環(huán)；94°C 40s, 55°C 60 s’72°C 40 s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收約500bp的片段，即為葡萄球菌核酸酶A基因(以下表述中也稱為SNA基因)(見(jiàn)序列表中序列2)的PCR產(chǎn)物。1.3突變裂解基因E和SNA基因的串聯(lián)擴(kuò)增
以突變裂解基因E和SNA基因的膠回收PCR產(chǎn)物作為下一步PCR反應(yīng)的模板，引物mE_F和SNA-R來(lái)擴(kuò)增突變裂解基因E和SNA的串聯(lián)基因(mE-L_SNA)。PCR反應(yīng)體系為50 μ L中，含 IOXDreamTaq Buffer (Mg2+ Plus) 5 μ L, dNTP Mixture 200 μΜ,膠回收的突變裂解基因 E 和 SNA 基因各 I U L，引物 mE-F 和 SNA-R 各 0.8 u M, Fermentas DreamTaq 1.25U。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5 min ；94°C 45s, 60°C 90 s，每個(gè)循環(huán)降低0.5°C，72°C 508，20個(gè)循環(huán)；941: 45s, 55°C 60 s，72°C 50 s，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收約783 bp的片段，即為高效裂解串聯(lián)基因mE-L-SNA基因(見(jiàn)序列表中序列3)的PCR產(chǎn)物。1.4安全高效的裂解質(zhì)粒的構(gòu)建
用&oR I和Sal I限制性內(nèi)切酶雙酶切mE-L-SNA基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pBV220，切膠回收mE-L-SNA基因片段和線性化pBV220，然后將二者在16°C過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，30°C過(guò)夜培養(yǎng)16 h。挑取單菌落于含100 u g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中30°C過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行I和I雙酶切鑒定。鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒pBV-mELS進(jìn)行測(cè)序鑒定。安全高效的裂解質(zhì)粒pBV-mELS的物理圖譜見(jiàn)圖1。實(shí)施例2、安全的大腸桿菌DH5 a菌蛻的制備
2.1高效裂解串聯(lián)基因mE-L-SNA的誘導(dǎo)表達(dá)
將經(jīng)過(guò)高效裂解質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5 a (pBV-mELS)單克隆接種于5 mL含100U g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后按1%的量轉(zhuǎn)接于50 mL含100U g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl值達(dá)到1.0-1.2時(shí)，將細(xì)菌培養(yǎng)物快速轉(zhuǎn)換到42°C以誘導(dǎo)串聯(lián)基因mE-L-SNA的表達(dá)。為了使SNA的活性達(dá)到最大，在升溫誘導(dǎo)90 min時(shí)添加終濃度為10 mM的CaCl2和I mM的MgCl2。誘導(dǎo)前后間隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定菌液的OD6tltl值和活菌數(shù)，以此來(lái)監(jiān)控細(xì)菌的生長(zhǎng)和裂解。誘導(dǎo)結(jié)束后形成的菌蛻用PBS洗滌后，凍干保存?zhèn)溆?。大腸桿菌DH5a (pBV_mELS)的裂解動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖2。誘導(dǎo)開始后，菌液的OD600值快速降低，菌液的活菌數(shù)也快速減少，至誘導(dǎo)4 h時(shí)，均降至最低，裂解效率達(dá)到99.99995%。2.2裂解過(guò)程中遺傳物質(zhì)的定量分析和電泳分析
大腸桿菌DH5a (pBV-mELS)誘導(dǎo)裂解過(guò)程中，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣2 mL，離心(10000rpm，4°C，10 min)收集菌體，分別用來(lái)提取細(xì)菌的基因組DNA和質(zhì)粒DNA，收集每個(gè)樣品的上清液500 UL用來(lái)提取DNA。應(yīng)用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度?；蚪MDNA應(yīng)用0.7%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，質(zhì)粒DNA和菌液上清中的DNA應(yīng)用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。DNA的定量分析結(jié)果顯示在誘導(dǎo)裂解過(guò)程中，菌體內(nèi)的基因組DNA的含量在誘導(dǎo)后2 h內(nèi)快速下降，隨后呈持續(xù)降低的趨勢(shì)，菌體內(nèi)的質(zhì)粒DNA含量在加入CaCl2和MgCl2之后也呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，而培養(yǎng)物上清中的DNA含量快速增加，至誘導(dǎo)2 h時(shí)達(dá)到最大，隨后逐漸降低(見(jiàn)圖3)。DNA的電泳結(jié)果顯示至誘導(dǎo)4 h時(shí)菌體和上清中均檢不出高分子量的DNA片段和質(zhì)粒DNA，表明菌體內(nèi)的基因組DNA和質(zhì)粒DNA均被SNA降解，然后排出細(xì)胞外(見(jiàn)圖4)。2.3大腸桿菌DH5a (pBV-mELS) 菌蛻的掃描電鏡觀察
取大腸桿菌DH5 a (pBV-mELS)菌蛻PBS洗滌3次，用2.5%戊二醛4°C固定2 h，PBS沖洗后再用1%鋨酸4°C后固定1.5 h，雙蒸水沖洗后，乙醇逐級(jí)脫水，醋酸異戊酯置換，干燥后鍍鉬，掃描電鏡下觀察并拍照(見(jiàn)圖5)。照片顯示，大腸桿菌DH5ci (pBV-mELS)菌蛻除裂解孔道外，菌蛻的細(xì)胞形態(tài)和表面結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯改變，裂解孔道的直徑大約為200-400 nm。本發(fā)明得到的高效裂解質(zhì)粒pBV-mELS也適用于腸桿菌科的其他菌類菌蛻的制備。實(shí)施例3、質(zhì)粒pBV-mELS和pBV_mE的裂解活性比較 3.1裂解質(zhì)粒pBV-mE的構(gòu)建
應(yīng)用引物 mE-F 和 mE-R ’( 5 ’ - CTGTCGACTCACTCCTTCCGCACGTA -3 ’)( 5 ’ 端引入 I限制性酶切位點(diǎn))，以PhiX174 RFI DNA為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增突變裂解基因E，將其應(yīng)用I和5 / I限制性內(nèi)切酶雙酶切后插入質(zhì)粒PBV220，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)酶切鑒定的陽(yáng)性克隆，然后進(jìn)行測(cè)序鑒定。序列正確的質(zhì)粒即為pBV-mE質(zhì)粒。

3.2質(zhì)粒pBV-mELS和pBV-mE的裂解動(dòng)力學(xué)比較
大腸桿菌DH5a (pBV-mE)的誘導(dǎo)裂解的方法與大腸桿菌DH5 a (pBV_mELS)基本相同，唯一不同之處是大腸桿菌DH5 a (pBV-mE)在誘導(dǎo)裂解過(guò)程中不需要添加CaCl2和1%(:12。誘導(dǎo)裂解過(guò)程中，兩者培養(yǎng)物的OD6tltl值的變化規(guī)律相似，但其活菌數(shù)的變化規(guī)律顯著不同。誘導(dǎo)裂解4 h時(shí)，大腸桿菌DH5a (pBV-mELS)培養(yǎng)物的活菌數(shù)要比大腸桿菌DH5 a (pBV-mE)低約2個(gè)數(shù)量級(jí)，見(jiàn)圖2和圖6。3.3遺傳物質(zhì)含量的比較
大腸桿菌DH5a (pBV-mE)在裂解過(guò)程中，菌體內(nèi)的基因組DNA含量在誘導(dǎo)2 h內(nèi)呈降低趨勢(shì)，然后維持在一定的水平；菌體內(nèi)的質(zhì)粒DNA含量在裂解過(guò)程中一直維持在一定的水平(圖7)。電泳結(jié)果顯示，誘導(dǎo)4 h時(shí)菌體中仍然可檢出高分子量的DNA片段和質(zhì)粒DNA(圖8)。由此可見(jiàn),應(yīng)用裂解質(zhì)粒pBV-mE制備的菌脫制劑存在著遺傳物質(zhì)側(cè)向傳播的風(fēng)險(xiǎn)。<110>山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
〈120〉高效裂解串聯(lián)基因，高效裂解質(zhì)粒及構(gòu)建方法和應(yīng)用
權(quán)利要求
1.一種聞效裂解串聯(lián)基因，其特征是基因序列如序列表中序列3所7]^。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效裂解串聯(lián)基因，其特征是由噬菌體PhiX174突變裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA串聯(lián)組成的。
3.含有上述權(quán)利要求1或2所述的高效裂解串聯(lián)基因的高效裂解質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效裂解質(zhì)粒，其特征是將權(quán)利要求1或2所述的高效裂解串聯(lián)基因酶切插入PBV220載體中。
5.一種權(quán)利要求3或4所述的高效裂解質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟: (1)以噬菌體PhiX174RFI DNA為模板、以序列表中的序列4和序列5為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得突變裂解基因E ； (2)以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板、序列表中序列6和序列7為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得葡萄球菌核酸酶A基因； (3)將步驟(I)中得到的突變裂解基因E和步驟(2)中得到的葡萄球菌核酸酶A基因作為下一步PCR反應(yīng)的模板，用序列表中的序列4和序列7進(jìn)行擴(kuò)增，得到串聯(lián)基因； (4)將串聯(lián)基因應(yīng)用I和I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)I和Sal\雙酶切的pBV220載體連接，得到高效裂解質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征是將步驟(4)得到的高效裂解質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，30°C過(guò)夜培養(yǎng)16 h，挑取單菌落于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中30°C過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，保留鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒。
7.—種權(quán)利要 求3或4所述的高效裂解質(zhì)粒在制備菌蛻中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述菌蛻為腸桿菌科的菌蛻。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是包括以下步驟: (1)將含有所述高效裂解質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a在30°C培養(yǎng)至OD6tltl值達(dá)到1.0-1.2 ； (2)培養(yǎng)溫度升高至42°C誘導(dǎo)高效裂解串聯(lián)基因的表達(dá)； (3)在升溫誘導(dǎo)90min時(shí)添加終濃度為IOmM的CaCl2和ImM的MgCl2，來(lái)激活SNA的活性； (4)升溫誘導(dǎo)4h時(shí)，收集步驟(3)獲得的菌蛻，洗滌后保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種由噬菌體PhiX174突變裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA組成的高效裂解串聯(lián)基因，基因序列如序列表中序列3所示。含有上述高效裂解串聯(lián)基因的高效裂解質(zhì)粒。高效裂解質(zhì)粒在制備菌蛻中的應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建的安全高效的裂解質(zhì)粒pBV-mELS能夠在大腸桿菌菌液OD600值達(dá)到1.0以上時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，裂解效率可到達(dá)99.99995%，不僅突破了裂解基因E介導(dǎo)的裂解過(guò)程依賴宿主細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)(OD600為0.4～0.6)的局限性，大大提高了菌蛻的產(chǎn)量，還能夠有效清除菌蛻中殘存的遺產(chǎn)物質(zhì)，降低了危害性遺傳元件(抗生素抗性基因和病原決定簇基因)的側(cè)向傳播。
文檔編號(hào)C12N15/66GK103146732SQ20131003071
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者王金寶, 張玉玉, 吳家強(qiáng), 王可, 杜以軍, 李俊, 于江, 彭軍 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所