專利名稱：一種基于連接酶反應的多特異位點dna甲基化電化學檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種DNA甲基化測定分析方法，具體涉及一種基于連接酶反應的多特異位點DNA甲基化電化學檢測方法。
背景技術：
DNA甲基化是一種廣泛存在于高等生物的重要基因表觀遺傳修飾方式，也是外遺傳體系的一種重要表達調控機制。DNA甲基化主要發(fā)生在5’-CpG-3’的C，生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。大量研究表明，DNA甲基化是在不改變基因堿基序列的情況下，通過改變CpG島的甲基化程度，在轉錄水平上實現(xiàn)調控基因表達，消除潛在危險DNA序列，調節(jié)發(fā)育過程和各種生理反應等功能。相反，DNA低甲基化和CpG島高甲基化等異常的基因組甲基化，不僅會導致DNA復制延遲、染色體壓縮、轉錄抑制等，而且會影響疾病的易感性、發(fā)生發(fā)展、預后和轉歸等。近年發(fā)現(xiàn)，基因組DNA異常甲基化與多種疾病尤其是年齡相關的慢性疾病的發(fā)生密切相關。由于DNA甲基化在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用，建立準確度高、操作簡單的DNA甲基化檢測方法，對疾病的早期診治和社區(qū)干預等具有十分重要的理論意義和實用價值。

DNA甲基化的檢測研究可分為三個層次:(1)基因組整體甲基化水平檢測，(2)特異位點甲基化水平檢測，(3)新甲基化位點的尋找。常規(guī)的DNA甲基化的檢測方法主要依賴甲基化敏感性內切酶在各自識別位點對5-mC和C不同的敏感性進行區(qū)分，或重亞硫酸鹽對甲基化和非甲基化胞嘧啶的化學活性不同使DNA包含的甲基化信息轉變?yōu)樾蛄械牟町愋畔ⅰ７椒ㄖ饕谆Y合蛋白柱層層析，MSssI甲基轉移酶分析和氯乙醛反應法，甲基化特異性PCR (MSP),甲基化敏感性單鏈構象分析，重亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性內切酶分析法(COBRA),甲基化敏感性斑點分析，甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳，甲基化敏感單核苷酸引物延伸法(MS-SNuPE)，PCR熒光變性曲線分析，變性高效液相色譜法(DHPLC)，甲基化熒光檢測(MethyLight)，甲基化特異性多連接依賴性探針擴增(MS-MLPA)，DNA甲基化微陣列芯片技術等。雖然甲基化檢測方法得到很大發(fā)展，但各種方法存在著明顯的限制性。重亞硫酸鹽法要求大量的克隆測序，過程繁瑣、昂貴，同時處理不完全時容易導致假陽性；甲基化敏感性單核苷酸引物衍生技術則存在著實驗步驟略復雜，若要檢測多個位點時，需要設計多個引物和存在放射性污染及重亞硫酸鹽處理不完全的問題；甲基化敏感性鏈解曲線分析技術等則存在著靈敏度太低的缺點；依賴基因測序或多步的PCR擴增使分析步驟復雜，檢測需時長，測定成本高；使用限制性內切酶只能獲得特殊酶切位點的甲基化水平，不能確定樣品DNA中其它位點的甲基化情況。因此，需要尋找更加簡單、快速的方法。電化學方法具有快速，靈敏，不受溶液濁度影響，且儀器簡單、操作方便，使用成本低，無需復雜的前處理過程，易于微型化和實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等特點，在DNA甲基化檢測方面具有獨特優(yōu)勢。近年來，DNA甲基化的電化學檢測方法取得了一定的突破，但從文獻報道來看，DNA甲基化的電化學檢測主要集中在DNA整體甲基化水平的檢測，對特異位點的甲基化水平檢測和新位點尋找的電化學方法鮮有報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于連接酶反應的多特異位點DNA甲基化電化學檢測方法。本發(fā)明所采取的技術方案是:
一種多特異性位點DNA甲基化檢測方法，包括如下步驟:
(1)根據(jù)目標DNA序列上的每個特異性甲基化位點的側翼序列設計一組核酸探針，每組核酸探針由一條分離探針和一條信號探針組成，分離探針用固相載體修飾，信號探針用量子點修飾，檢測不同甲基化位點所使用的信號探針上修飾的量子點不同；
(2)目標DNA樣品用重亞硫酸鹽處理，使未被甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶；
(3)將分離探針和信號探針加入步驟(2)處理后的目標DNA溶液中進行雜交；
(4)收集固相載體，清洗后加入DNA連接酶反應液進行連接反應，反應結束后進行解鏈反應，解鏈結束后，趁熱將固相載體與反應液分離；
(5)收集固相載體，清洗后利用溶出伏安法測定固相載體上連接的量子點的電化學信
號;
(6)根據(jù)電化學信號的歸屬和強度確定甲基化的位點和甲基化程度。所述分離探針的長度為35 45 bp,信號探針的長度為10 15 bp,以保證雜交的選擇性。所述固相載體為磁性微球、聚四氟乙烯微球、金片、或表面修飾有羧基或氨基的微米材料。分離探針的制備方法如下:固相載體分別用100 mM咪唑緩沖溶液和EDC/NHS溶液處理后，加入核酸分子，35 45°C下振蕩反應I 3小時,分尚，分別用2XSSC緩沖溶液(0.5% SDS)和65°C高純水清洗，得到分離探針。信號探針的制備方法如下:量子點水溶液與核酸分子混合，在N2保護下攪拌16 24 小時，逐滴加入 PBS (pH 7.4,0.24 M NaCl, 0.1% NaN3)后在 PBS (pH 7.4,0.2 M NaCl)中透析36 48小時，離心收集制備的信號探針。步驟(3)所述雜交的條件為:35 45°C下雜交I 3小時。步驟(4)所述連接酶反應液的組成為:30 mM Tris-HCl,4 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4j0.005% BSA, 0.2 mM NAD 和 0.5 U/L Ecoli DNA 連接酶。連接反應的條件為:35 40°C下反應I 2小時。解鏈的條件為:85 95°C下解鏈5 15分鐘。步驟(5)測定溶出伏安曲線的條件為:玻碳電極在300 500 ii g/L鉍溶液中，一
0.9 一 1.1 V沉積10分鐘。本發(fā)明方法的原理如 下:
如圖1所示，根據(jù)目標DNA鏈上的甲基化位點A的側翼序列設計一組核酸探針(Pl和P2)甲基化位點B的側翼序列設計一組核酸探針(P3和P4)，Pl和P4分別標記CdS和PbS量子點作為信號探針(PbS-Pl，CdS-P4)，探針P2和P3 —起固定在固相載體(磁珠)上作為分離載體(MB-P2P3)。
如圖2所示，含目標DNA鏈的待測樣品溶液首先經(jīng)重亞硫酸鹽處理，目標DNA鏈中沒有發(fā)生甲基化的C脫氨基轉化為U，而5-mC保持不變。該待測溶液與MB-P2P3雜交并磁性分離，目標DNA鏈被選擇性雜交到固相載體(MB)表面，與溶液中共存的DNA片段分離。進一步將該MB與PbS-Pl和CdS-P4雜交，量子點PbS和CdS被連接到MB表面。加入疋col1.DNA連接酶，該DNA連接酶在間隙位置(圖1中箭頭所指位置)發(fā)生作用，識別錯配位點。當目標鏈上位點發(fā)生甲基化時，對應的相鄰兩條探針鏈與目標鏈完全互補，連接酶將該兩條探針鏈連接成一條新的核酸鏈。反之，當位點沒有發(fā)生甲基化時，對應的相鄰兩條探針鏈與目標鏈形成單堿基錯配，連接酶不能發(fā)生作用。所得磁珠于緩沖溶液中加熱解鏈，磁性分離，甲基化位點上的標記量子點通過DNA鏈與磁珠相連,而非甲基化位點上的標記量子點則被解鏈分離。向解鏈后的磁珠中加入I M硝酸，利用溶出伏安法測定磁珠上連接的量子點的電化學信號。根據(jù)電信號的歸屬和強度確定甲基化的位點和甲基化程度。本發(fā)明的有益效果是:
該方法利用特異性免疫反應和標記抗體的酶在二氧化鈦溶膠凝膠膜上表現(xiàn)的直接電化學響應，發(fā)展了新穎的無試劑免疫分析方法并制備了免疫傳感器。利用二氧化鈦溶膠凝膠氣相沉積法固定抗原分子，并利用競爭免疫分析方法，通過直接測定反應到免疫傳感器表面上標記抗體的酶的直接電化學響應信號的降低直接得到待測抗原的濃度。該方法較現(xiàn)有的免疫分析方法，具有以下優(yōu)點:
(1)溶出伏安法具有富集和溶出過程，靈敏度高，是一種很好的檢測痕量金屬離子濃度的電化學方法；
(2)秘膜電極代替?zhèn)鹘y(tǒng)的萊電極,秘金屬本身毒性較小，環(huán)境友好，而且具有與萊電極相媲美的電化學性能，如電勢窗口大，靈敏度高，檢測限低等；
(3)無需進行繁瑣的基因測序步驟，簡化了分析體系，降低測定成本；
(4)無需PCR擴增步驟，簡化了分析的操作步驟，縮短了分析時間，適用于臨床上在線快速檢測；`
(5)無需使用限制性內切酶，對特異位點的甲基化研究具有普適性，縮短了分析時間，避免了限制性內切酶的缺點；
(6)根據(jù)電化學信號的峰電位和峰電流，實現(xiàn)多特異甲基化位點的同時測定，
(7)該方法表現(xiàn)出很好的精確性，重復性和穩(wěn)定性，可發(fā)展成為試劑盒并向市場推廣。


圖1為核酸探針與目標DNA的互補配對關系 圖2為基于連接酶反應的多特異位點DNA甲基化電化學檢測方法原理 圖3為實施例1核酸探針與目標DNA的互補配對關系 圖4為雜交溫度和雜交時間對甲基化電化學測定的影響(A.雜交溫度，B.雜交時間)；圖5為解鏈溫度和解鏈時間對甲基化電化學測定的影響(A.解鏈溫度，B.解鏈時間)；圖6為沉積電位、沉積時間、溶液中鉍離子濃度和電極預處理時間對甲基化電化學測定的影響(A.沉積電位，B.沉積時間，C.溶液中鉍離子濃度，D.電極預處理時間)；
圖7為實施例1目標DNA鏈不同甲基化位點的標準曲線。
具體實施例方式下面以p53腫瘤抑制基因片段的甲基化檢測為例，對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。一、制備核酸探針
1、目標基因片段的處理
用重亞硫酸鹽處理P53腫瘤抑制基因片段，步驟如下:
根據(jù)重亞硫酸鹽轉化試劑盒說明，適量重亞硫酸鹽混合物用800 UL去核糖核酸酶的水在60 °C溶解完全。在200 uL PCR管中加入15 u L DNA樣品溶液(I ng - 2 u g),5UL去核糖核酸酶的水，85 UL重亞硫酸鹽混合物溶液，35 uL DNA保護緩沖溶液。蓋上PCR管蓋子，充分混合重亞硫酸鹽反應液，室溫下保存。在PCR儀中95°C變性5 min,60 V溫育25 min，繼續(xù)在95 °C變性5 min,60 °C溫育85 min，再在95 °C變性5 min，在60 V溫育175 min，在20 °C保存過夜。處理前的基因片段為:
5’ -CC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTTATCCGA GTG GAA ACA-3’ (SEQ ID NO:1)。處理后的基因片段為:
5’ -UU UAU UAT GAG CGU TCU TUA GAT AGU GAT GGT UTG GUU UUT UUT UAG UAT UTTATU CGA GTG GAA AUA-3’ (SEQ ID NO:2)。2、設計核酸探針
根據(jù)目標基因經(jīng)重亞硫酸鹽修飾后的堿基序列(SEQ ID N0:2)，以甲基化位點為分界線設計相應核酸探針(見圖3)。核酸探針I(yè) (Pl)與第一甲基化位點5’端序列(5’ -UU UAU UAT GAG C-3’)互補；核酸探針2 (P2)與第一甲基化位點3’端到目標基因序列中點的序列(5’-GU TCU TUA GATAGU GAT GGT UTG-3’)互補；核酸探針3 (P3)與目標基因序列中點到第二甲基化位點的序列(5，-GUU UUT UUT UAG UAT UTT ATU C-3’)互補；核酸探針4 (P4)是第二甲基化位點3’端到目標基因3’端序列(5’ -GA GTG GAA AUA-3’)互補。其中，P2和P3在設計時，除了與待測DNA序列互補外，P2的5’端和P3的3’端有6-8 bp序列互補，形成樹杈結構的頸部，中間有6-8 bp惰性序列形成三角區(qū)減少雜交的張力。同時，考慮DNA連接酶反應，Pl和P4的5’端磷酸基修飾，P2和P3的3’端羥基修飾。四條核酸探針序列如下:
Pl 5，-P-GCTCATGGTGGG-C6-SH-3，(SEQ ID NO: 3)
P2 5’ -NH2-C6-ACA CAC CAT GCA TGA CAA CAA CAA CAA CAC GCT ATC TGA GCAGC-0H-3’ (SEQ ID NO:4)
P3 5’-P-GAT MG ATG CTG AGG ACA ACA CAC ACA ACA CAT GCA TGA CAC AC-C6-NH2_3’(SEQ ID N0:5)
P4 5’ -SH-C6-TGTTTCCACTCG-0H-3’ (SEQ ID NO:6) 3、量子點標記信號探針Pl和P4
Pl用量子點PbS修飾，步驟為:1 mg/ml的量子點(PbS)水溶液與8 OD/ml核酸探針Pl混合，在N2保護下攪拌24小時。逐滴加入PBS(pH 7.4,0.24 M NaCl,0.1% NaN3)后在PBS(pH 7.4,0.2 M NaCl)中透析48小時。離心收集制備的PbS-Pl，加入PBS (pH 7.4,0.24 MNaCl,0.1% NaN3)后置于4°C下待用。P4用量子點CdS修飾，制備步驟相同。4、核酸探針P2和P3共同修飾磁性微球
10 UL磁性微球溶液用100 mM咪唑緩沖溶液(pH 7.0)清洗兩次，加入100微升EDC/NHS溶液反應30分鐘后，加入50 UL 10 uM P3和P4溶液，50°C下振蕩反應3小時。磁分離后，用2 X SSC緩沖溶液(0.5% SDS)清洗3次，65°C高純水清洗兩次，溶解于PBS (pH
7.4,0.24 M NaCl,0.1% NaN3)溶液中，置于 4°C下待用。所述EDC/NHS溶液是由I g/L EDC和I g/L NHS按1:1 (v/v)混合得到。二、測定條件優(yōu)化
1、雜交溫度和雜交時間
在DNA雜交過程中，雜交溫度低于DNA的熔鏈溫度(Tm) 1(T15 ° C時，互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少；若雜交溫度低于Tm 30 ° C，互補鏈之間配對減少，錯配對增多，氫鍵結合減弱。一般最適溫度理論計算公式為T = Tm - 25 ° C。在DNA雜交過程中，雜交溫度影響雜交效果。雜交時間過短導致互補鏈中錯配情況增加，探針鏈不能很好 的捕捉目標鏈，使信號出現(xiàn)假陽性；而雜交時間過長則影響實驗的效率及檢測方法的實時性。在本實施例中，以完全甲基化的p53腫瘤抑制基因片段為研究對象，分別改變雜交溫度和雜交時間，選擇最大電流響應時的相應值作為最佳雜交條件。如圖4A所示。在雜交溫度分別為10，25，38和55 ° C條件下分別測定完全甲基化的目標P53基因片段。當雜交溫度為10 ° C時，由于溫度過低，互補堿基配對減少，錯配對增多，氫鍵的結合力弱，因此檢測信號較小，不適宜DNA的雜交。隨雜交溫度提高，檢測信號明顯增大，38° C達到最大值。繼續(xù)升高雜交溫度到55 ° C，會導致融鏈，雜交效率降低，信號下降。因此，選擇38 ° C作為實驗最終雜交溫度。圖4B優(yōu)化了在38° C下的雜交時間。當雜交時間為I小時，檢測信號較小。延長雜交時間從2到6小時，檢測信號增大并基本達到穩(wěn)定，表明2 h后雜交情況趨于穩(wěn)定。因此選擇2 h為優(yōu)化后的雜交時間。2、解鏈溫度和解鏈時間
解鏈時間影響解鏈效果。解鏈時間過短，解鏈不完全，導致假陽性結果；解鏈時間過長，使DNA和磁性微球長期處于高溫環(huán)境中，導致DNA鏈斷裂成單個堿基，或者磁性微球變性磁性降低，損失一部分信號。圖5A以完全非甲基化的目標p53基因片段為對象，研究了解鏈溫度對測定的影響。由圖可知70 ° C時檢測到的峰信號最大，可以認為是70 ° C時溫度不夠導致解鏈不完全，會使檢測出現(xiàn)假陽性結果，。當解鏈溫度從70° C升高到90 ° C，測定信號迅速降低。溫度高于90 ° C后，測定信號趨于穩(wěn)定值，因此選擇90 ° C為解鏈溫度。圖5B為在90° C解鏈溫度下不同解鏈時間對測定的影響。隨解鏈時間從5 min延長到25 min，測定信號迅速下降，并趨于穩(wěn)定值，認為解鏈完全。因此，選擇20 min為優(yōu)化后的解鏈時間。
3、溶出伏安法條件選擇
圖6A為以完全甲基化的目標p53基因片段為對象，研究不同沉積電位對測定的影響。當沉積電位從-0.85 V向負方向改變時，測定信號迅速增加，并在沉積電位負于-1.0 V后趨于極限值。因此，選擇優(yōu)化的電沉積電位為-1.0 V。圖6B為在-1.0 V沉積電位下不同沉積時間對測定信號的影響情況。隨沉積時間從50 s延長到450 S，峰電流與沉積時間呈線性關系。450 s以后，Pb離子的信號略有下降，而Cd離子的信號繼續(xù)增加，到600 s達到穩(wěn)定值。因此，選擇600 s為最佳的沉積時間。圖6C研究了溶液中鉍離子濃度對溶出伏安響應的影響。當鉍離子濃度為0 200吒L—1時，Cd峰電流顯著增加，200 600 I^g L—1時出現(xiàn)平臺期，大于600 I^g L—1時，峰電流呈下降的趨勢。而對于Pb的峰電流，當鉍離子濃度為0 200 I^g L—1時，峰電流顯著增加，200 600 I^g L—1時增加趨勢稍緩，大于600 I^g L—1時，峰電流呈下降的趨勢。檢測時需同時檢測溶液中的Cd和Pb離子濃度，綜合二者，選擇400 I^g L—1作為最終溶液中鉍離子的濃度。圖6D為電極測定后清洗時間的優(yōu)化。由于方波伏安法是一種比較快速的掃描方法，因此從負電位掃到正電位時，電極上仍然有殘留的待測金屬和金屬鉍，影響下一次的測定。因此，需要在電極上 加一個正電壓清洗一段時間，使電極上的金屬離子完全的溶出，盡量的還原電極表面。圖6D為在+0.3 V電壓下不同清洗時間重復測定五次得到的Cd和Pb離子的響應。當清洗時間為15 s時，多次測定重復性差。隨著清洗時間的增長，測定的重復性提高，實驗選擇優(yōu)化的清洗時間為75 S。三、不同甲基化位點的標準曲線獲得
取10 L P2和P3核酸探針修飾的磁性微球與一系列標準濃度的甲基化目標鏈在38°C下雜交2小時，再分別加入10 uL PbS-Pl和CdS-P4溶液，室溫下雜交I小時。收集磁性微球，用超純水清洗2次，加入20 UL酶反應液(30 mM Tris-HCl,4 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4j0.005% BSA, 0.2 mM NAD 和 0.5 U/L Ecoli DNA 連接酶)，38 °C下反應 I 小時。將反應液在90°C下解鏈10分鐘，收集磁性微球，趁熱將反應液抽出后，依次用I XPBS溶液(0.2% Tween 20)和超純水清洗磁性微球，加入100 uL I M HNO3溶液，玻碳電極在400U g/L鉍溶液中，一 1.1 V沉積10分鐘，得到溶出伏安曲線。重復測定三次后，取平均值。圖7A為只有甲基化位點A被甲基化的目標鏈濃度對Pb離子的響應校準曲線，溶液中隨目標鏈濃度的增加，Pb離子的響應峰電流逐漸增加，響應峰電流值與目標鏈濃度的呈現(xiàn)良好的線性關系，線性方程是:/pa (PA) = -0.0505c (nmol I71) - 1.096 (n=3, R=0.9663)，線性范圍和檢出限依次是 10 nmol L-1 80 nmol I71 和 230 pmol I71 (S/N =3)。圖7B是只有甲基化位點B被甲基化的目標鏈濃度對Cd離子的響應校準曲線。隨溶液中目標鏈濃度的增加，Cd離子的響應峰電流增加，并呈現(xiàn)良好的線性關系。線性方程Upa (u A) = -0.0471c (nmol I71) - 0.7533 (n=3, R = 0.9637)，線性范圍和檢出限依次是 10 nmol L-1 80 nmol L-1 和 300 pmol L-1 (S/N = 3)。圖7C為兩個位點同時甲基化的目標鏈濃度與Pb和Cd離子的伏安響應關系，表現(xiàn)出與圖7A和圖7B相同的線性關系，說明可同時檢測兩個位點的甲基化情況。
四、P53腫瘤抑制基因片段特異位點甲基化的測定
(I)p53腫瘤抑制基因片段樣品用重亞硫酸鹽處理:
取試劑盒封裝的重亞硫酸鹽混合物用800 UL去核糖核酸酶的水在60 V溶解完全。在200 uL PCR管中加入15 uL DNA樣品溶液(I ng - 2 u g),5 u L去核糖核酸酶的水，85 UL重亞硫酸鹽混合物溶液，35 UL DNA保護緩沖溶液。蓋上PCR蓋子，充分混合重亞硫酸鹽反應液，室溫下保存。在PCR儀中95 V變性5 min, 60 °C溫育25 min，繼續(xù)在95°C變性5 min, 60 °C溫育85 min，再在95 °C變性5 min，在60 °C溫育175 min，在20 °〇保存過夜。(2)取10 UL P2和P3核酸探針修飾的磁性微球與p53腫瘤抑制基因片段樣品在38°C下雜交2小時，再分別加入10 ii L PbS-Pl和CdS-P4溶液，室溫下雜交I小時。(2)收集磁性微球，用超純水清洗2次，加入20 ii L酶反應液(30 mM Tris-HCl，4mM MgCl2,10 mM (NH4)2SO4j0.005% BSA, 0.2 mM NAD 和 0.5 U/L Ecoli DNA 連接酶)，38 °C下反應I小時。將反應液在90°C下解鏈10分鐘。(3)收集磁性微球，趁熱將反應液抽出后，依次用IXPBS溶液(0.2% Tween 20)和超純水清洗磁性微球，加入10 0 UL I M HNO3溶液，玻碳電極在400 U g/L鉍溶液中，一 1.1V沉積10分鐘，得到溶出伏安曲線。(4)利用標準曲線法，計算p53腫瘤抑制基因片段樣品中特異位點甲基化的濃度。
權利要求
1.一種多特異性位點DNA甲基化檢測方法，包括如下步驟: (1)根據(jù)目標DNA序列上的每個特異性甲基化位點的側翼序列設計一組核酸探針，每組核酸探針由一條分離探針和一條信號探針組成，分離探針用固相載體修飾，信號探針用量子點修飾，檢測不同甲基化位點所使用的信號探針上修飾的量子點不同； (2)目標DNA樣品用重亞硫酸鹽處理，使未被甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶； (3)將分離探針和信號探針加入步驟(2)處理后的目標DNA溶液中進行雜交； (4)收集固相載體，清洗后加入DNA連接酶反應液進行連接反應，反應結束后進行解鏈反應，解鏈結束后，趁熱將固相載體與反應液分離； (5)收集固相載體，清洗后利用溶出伏安法測定固相載體上連接的量子點的電化學信號; (6)根據(jù)電化學信號的歸屬和強度確定甲基化的位點和甲基化程度。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離探針的長度為35 45bp,信號探針的長度為10 15 bp。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相載體為磁性微球、聚四氟乙烯微球、金片、或表面修飾有羧基或氨基的微米材料。
4.根據(jù)權利要求1 3任一項所述的方法，其特征在于，所述分離探針的制備方法如下:固相載體分別用100 mM咪唑緩沖溶液和EDC/NHS溶液處理后，加入核酸分子，35 45°C下振蕩反應I 3小時，分離，分別用2X SSC緩沖溶液(0.5% SDS)和65°C高純水清洗，得到分離探針。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述信號探針的制備方法如下:量子點水溶液與核酸分子混合，在N2保護下攪拌16 24小時，逐滴加入PBS (pH 7.4，0.24 MNaCl, 0.1% NaN3)后在PBS (pH 7.4,0.2 M NaCl)中透析36 48小時，離心收集制備的信號探針。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述雜交的條件為:35 45°C下雜交I 3小時。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述連接酶反應液的組成為:30mM Tris-HCl,4 mM MgCl2,10 mM (NH4)2SO4j0.005% BSA,0.2 mM NAD和0.5 U/L Ecoli DNA連接酶。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述連接反應的條件為:35 40°C下反應I 2小時。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述解鏈的條件為:85 95°C下解鏈5 15分鐘。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)測定溶出伏安曲線的條件為:玻碳電極在300 500 u g/L鉍溶液中，一 0.9 一 1.1 V沉積10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于連接酶反應的多特異位點DNA甲基化電化學檢測方法。該方法利用特異性免疫反應和標記抗體的酶在二氧化鈦溶膠凝膠膜上表現(xiàn)的直接電化學響應，發(fā)展了新穎的無試劑免疫分析方法并制備了免疫傳感器。利用二氧化鈦溶膠凝膠氣相沉積法固定抗原分子，并利用競爭免疫分析方法，通過直接測定反應到免疫傳感器表面上標記抗體的酶的直接電化學響應信號的降低直接得到待測抗原的濃度。本方法無需進行繁瑣的基因測序步驟，簡化了分析體系，降低測定成本，具有很好的精確性，重復性和穩(wěn)定性，可發(fā)展成為試劑盒并向市場推廣。
文檔編號C12Q1/68GK103114139SQ20131003100
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權日2013年1月25日
發(fā)明者戴宗, 鄒小勇, 蔡婷 申請人:中山大學