專利名稱：一種淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學微生物學領(lǐng)域，具體涉及一種淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)感染泌尿生殖系統(tǒng)引起淋病,此病是一種常見的性傳播疾病(Sexual Transmitted Disease, STD)。近年來淋病發(fā)病率居我國性傳播疾病首位，危害十分嚴重。淋病奈瑟菌經(jīng)性行為傳播，多侵襲泌尿生殖道黏膜，主要引起男性尿道炎、前列腺炎和女性盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎等。由于淋病奈瑟菌耐藥性現(xiàn)象的日趨嚴重，淋病的治療也出現(xiàn)了新的難題。因此，對淋病奈瑟菌感染機制及疫苗的研究成為預防和控制淋病流行傳播的重要措施。淋病奈瑟菌(NG)生長較慢，對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求非常高，常用巧克力(色)血瓊脂培養(yǎng)基，需要在5%C02環(huán)境下才能生長良好。普通轉(zhuǎn)化需要新鮮的液體培養(yǎng)物且不易轉(zhuǎn)化成功。目前尚缺少適宜淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法從而實現(xiàn)外源基因的表達，這在很大程度上限制了對淋病奈瑟菌的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適合淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，其中包括制備適宜轉(zhuǎn)化用的淋病奈瑟菌感受態(tài)，探索淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化條件，實現(xiàn)外源基因在淋病奈瑟菌中的表達。本發(fā)明所使用的技術(shù)方案是淋病奈瑟菌分別經(jīng)液體及固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，收集細菌于離心管中，細菌經(jīng)洗滌懸浮后制得淋病奈瑟菌感受態(tài)作為轉(zhuǎn)化用受體菌備用；通過電轉(zhuǎn)化方法將原核表達載體petl-EGFP轉(zhuǎn)入備用的淋病奈瑟菌中，用酶切和PCR方法篩選鑒定重組淋病奈瑟菌(rNG);熒光顯微鏡觀察rNG外源蛋白的表達情況。rNG經(jīng)固體培養(yǎng)基多次傳代及凍存3、6、9、12月后對其穩(wěn)定性進行評價。構(gòu)建的rNG為進一步研究淋病奈瑟菌的感染免疫機制奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明中淋病奈瑟 菌培養(yǎng)時，先液體培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)到對數(shù)生長期。上述方法中，制備淋病奈瑟菌感受態(tài)是冰浴靜置后用超純水洗滌。上述方法中所述的轉(zhuǎn)化為電轉(zhuǎn)化，細菌經(jīng)孵育后直接轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)后再涂板。上述原核表達載體petl-EGFP，其結(jié)構(gòu)是在質(zhì)粒pet_30a的BamHI和HindII雙酶切位點插入EGFP序列。本發(fā)明通過優(yōu)化淋病奈瑟菌的培養(yǎng)條件，制備了淋病奈瑟菌感受態(tài)，建立了淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，此轉(zhuǎn)化方法簡便易行，獲得的重組菌性質(zhì)穩(wěn)定，為今后淋病奈瑟菌感染機制和疫苗效果的研究奠定了基礎(chǔ)。同時，該轉(zhuǎn)化方法的建立進一步拓寬了淋病奈瑟菌的研究領(lǐng)域，因而具有廣闊的市場前景。


圖1為熒光顯微鏡下觀察到的表達EGFP的淋病奈瑟菌圖像。
具體實施例方式1、電轉(zhuǎn)化用淋病奈瑟菌感受態(tài)的制備淋病奈瑟菌經(jīng)液體及固體培養(yǎng)基每升液體培養(yǎng)基含有哥倫比亞培養(yǎng)基基礎(chǔ)(35g),酵母抽提物(5g),葡萄糖(5g),新胨蛋白胨(2. 5g),氯化血紅素(終濃度O. 015%。)，吐溫-80 (終濃度O. 05%)，吡哆醛(終濃度O. 006%。)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(終濃度
O.015%。)；每升固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入瓊脂粉(終濃度2%)培養(yǎng)到對數(shù)生長期后(先液體培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng))，用O. OlM PBS緩沖液輕輕洗下固體培養(yǎng)基上的細菌收集于離心管中置于冰浴中。細菌再經(jīng)預冷的超純水充分洗滌、懸浮，100 μ I分裝后即用于電轉(zhuǎn)化試驗或凍存于_80°C備用。2、電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒petl-EGFP的小量制備根據(jù)EGFP序列設(shè)計引物，上下游引物序列為cgggatccgtgagcaagggcgaggag(SEQ ID NO.1),cccaagcttcggccgctt tacttgtacag(SEQ IDNO. 2)。引物中分別引入BamHI和HindIII酶切位點。以質(zhì)粒pEGFP-Nl (Clontech公司)為模板，PCR擴增EGFP，經(jīng)TA克隆獲得重組質(zhì)粒T-EGFP。用BamHI和HindIII分別雙酶切質(zhì)粒T-EGFP和pet_30 a (Novagen公司)，將EGFP片段與pet_30a片段連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒 petl-EGFP。取2 μ I的小提質(zhì)粒petl-EGFP加入100 μ I淋病奈瑟菌感受態(tài)細胞中，混勻靜置后進行電轉(zhuǎn)化。設(shè)置電轉(zhuǎn)化條件(電擊參數(shù)設(shè)置為1.2-1.8kV，25yF)。電轉(zhuǎn)化結(jié)束后將細菌混合物置于37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),細菌培養(yǎng)物經(jīng)離心后涂布于卡那霉素平板靜置培養(yǎng)。取單個菌落擴增和提取質(zhì)粒后用PCR和酶切篩選鑒定重組菌rNG。3、外源蛋白表達鑒定正確的rNG轉(zhuǎn)接于卡那霉素平板(含終濃度lmmol/L IPTG)，待長出菌苔后通過熒光顯微鏡觀察，可見綠色熒光，如圖1。rNG經(jīng)固體培養(yǎng)基多次傳代后能穩(wěn)定表達EGFP，經(jīng)凍存3、6、9、12月后仍穩(wěn)定表達EGFP。表達菌株提取質(zhì)粒后，酶切和PCR鑒定正確。構(gòu)建的重組菌rNG為研究淋病奈瑟菌的感染免疫機制奠定了基礎(chǔ)。淋病奈瑟菌轉(zhuǎn)化方法的建立進一步拓寬了淋病奈瑟菌的研究領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括以下步驟淋病奈瑟菌分別經(jīng)液體及固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，收集細菌于離心管中；細菌經(jīng)冰浴靜置、充分洗滌和懸浮后制得淋病奈瑟菌感受態(tài)作為轉(zhuǎn)化用受體菌備用；通過電轉(zhuǎn)化方法將原核表達載體轉(zhuǎn)入到上述備用的淋病奈瑟菌感受態(tài)中，用酶切和PCR方法篩選鑒定重組淋病奈瑟菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于淋病奈瑟菌培養(yǎng)時，先液體培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)到對數(shù)生長期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于制備淋病奈瑟菌感受態(tài)是冰浴靜置后用超純水洗滌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化為電轉(zhuǎn)化，細菌經(jīng)孵育后直接轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)后再涂板。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學微生物學領(lǐng)域，具體涉及一種淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法。該方法是將淋病奈瑟菌分別經(jīng)液體及固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，收集細菌于離心管中；細菌經(jīng)冰浴靜置、充分洗滌和懸浮后制得淋病奈瑟菌感受態(tài)作為轉(zhuǎn)化用受體菌備用；通過電轉(zhuǎn)化方法將原核表達載體轉(zhuǎn)入到上述備用的淋病奈瑟菌感受態(tài)中，用酶切和PCR方法篩選鑒定重組淋病奈瑟菌。本發(fā)明通過優(yōu)化淋病奈瑟菌的培養(yǎng)條件，制備了淋病奈瑟菌感受態(tài)，建立了淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，此轉(zhuǎn)化方法簡便易行，獲得的重組菌性質(zhì)穩(wěn)定，為今后淋病奈瑟菌感染機制和疫苗效果的研究奠定了基礎(chǔ)。同時，該轉(zhuǎn)化方法的建立進一步拓寬了淋病奈瑟菌的研究領(lǐng)域。
文檔編號C12R1/36GK103060363SQ201310031718
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者焦紅梅, 賀麗, 陳瑾, 李國才, 陳紅菊, 潘興元, 田芳, 季明春 申請人:揚州大學