專利名稱：一種利用基因重組酵母混合培養(yǎng)將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程及發(fā)酵工程領(lǐng)域，更具體地，涉及一種利用基因重組酵母混合培養(yǎng)將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的方法。
背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維素是自然界中含量最豐富的可再生資源，是植物組織構(gòu)成的主要成分，占植物干重的20-45%。自然界中的木質(zhì)纖維素由植物通過光合作用產(chǎn)生，而其中近90%尚未被人類有效利用，大部分被作為廢料處理，不僅要耗費(fèi)大量的人力物力，而且造成了環(huán)境污染和極大的浪費(fèi)。木質(zhì)纖維素原料主要由纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素構(gòu)成。如果能充分利用其中的纖維素和半纖維素生產(chǎn)生物燃料乙醇，既可以保護(hù)環(huán)境，又能解決國際性的能源危機(jī)問題，同時能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。纖維素是一種由葡萄糖組成的高分子多糖結(jié)構(gòu)，其酶解需要多個纖維素酶的協(xié)同作用完成，主要包括三類纖維素酶:內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase, EG)、外切葡聚糖酶,又稱纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase, CBH)和 β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase, BGL)。EG能隨機(jī)地切斷纖維素長鏈內(nèi)部的β-1，4-糖苷鍵，形成纖維寡糖；CBH則與EG分工，能作用于纖維素分子的結(jié)晶區(qū)，水解纖維素鏈末端的β_1，4-糖苷鍵，依次切下纖維二糖分子；而BGL則能將EG和CBH水解形成的纖維寡糖和纖維二糖繼續(xù)水解為葡萄糖。最終獲得的葡萄糖可被微生物發(fā)酵利用，如用釀酒酵母等可以將纖維素水解產(chǎn)生的葡萄糖發(fā)酵成為乙醇。目前纖維素乙 醇的生產(chǎn)工藝主要有以下幾種:(1)分步糖化發(fā)酵(s印aratehydrolysis and fermentation, SHF)0 SHF使水解和發(fā)酵分步進(jìn)行。優(yōu)點(diǎn)是酶解和發(fā)酵可在各自的最優(yōu)條件下進(jìn)行而不互相影響，缺點(diǎn)是酶解過程中積累的葡萄糖和纖維二糖會對纖維素酶產(chǎn)生末端產(chǎn)物抑制，從而影響酶的活力，同時操作復(fù)雜。⑵同步糖化發(fā)酵(simultaneous sacchari cation and fermentation, SSF)和同步糖化共發(fā)酵(simultaneous sacchari cation and co-fermentation, SSCF)0 SSF 是纖維素的酶解和乙醇發(fā)酵同步進(jìn)行，酶解產(chǎn)生的葡萄糖同時被微生物轉(zhuǎn)化成乙醇；SSCF是在SSF的基礎(chǔ)上，使其發(fā)酵所用的微生物菌種(單菌種或混合菌種)能同時利用己糖和戊糖，故稱為共發(fā)酵。SSF和SSCF解除了纖維素酶的末端產(chǎn)物抑制，提高了酶解效率，同時簡化了生產(chǎn)工藝、縮短了生產(chǎn)周期，且已經(jīng)被證明其效果優(yōu)于SHF。但是SSF和SSCF工藝中糖化和發(fā)酵的條件采用折中的方法，糖化和發(fā)酵都不在最優(yōu)條件下進(jìn)行，并且SSF和SSCF的糖化步驟通常采用商業(yè)酶，纖維素酶的成本和酶解效率是其大范圍工業(yè)化應(yīng)用的阻礙因素。⑶統(tǒng)合生物工藝(consolidated bioprocessing, CBP)。Lynd 等于 2005 年提出了 CBP 的概念，即在不額外添加商業(yè)酶的情況下，由一種或幾種微生物在一個反應(yīng)器來完成纖維素的糖化和乙醇的發(fā)酵的工藝過程。對于需要添加商業(yè)酶的SHF、SSF和SSCF而言，CBP顯著地降低了生產(chǎn)成本。有報道表明，以硬木的粉末為原料，采用CBP的乙醇轉(zhuǎn)化效率比SSF高四倍，且生產(chǎn)成本更低。雖然酶分離純化技術(shù)的日益進(jìn)步，SSF中使用的商業(yè)酶價格較前幾年已經(jīng)明顯下降，但是CBP這一新的工藝因其一體化的優(yōu)點(diǎn)，仍然具有無可比擬的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種利用基因重組酵母混合培養(yǎng)將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的方法。本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種利用基因重組酵母混合培養(yǎng)將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的方法，包括如下步驟:
51.種子液的制備:首選分別構(gòu)建能分泌表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表達(dá)外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表達(dá)β -葡萄糖苷酶(BGL)的菌株AS2.489-PS-BGL ;然后活化培養(yǎng)各菌株至對數(shù)生長期，并使各菌株的酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到0.8^1億/mL，即為成熟種子液；
52.配制發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌，所述培養(yǎng)基含有如下重量份的組分:100100份蔗渣，2(Γ40份玉米漿(液態(tài)， 購自華潤賽力事達(dá)玉米工業(yè)有限公司)，1(Γ30份葡萄糖，5 15份硫酸銨，f 10份磷酸二氫鉀；
53.接種:將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的成熟種子液混合后，于無菌條件下接種，總接種量為培養(yǎng)基體積的8 15% ；
54.發(fā)酵:前酵期通入無菌空氣，控制溫度為28 32°C，攪拌速度為15(Γ250轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌培養(yǎng):Γ5小時，前酵期結(jié)束；然后進(jìn)入主酵期厭氧發(fā)酵階段，主酵期保持溫度為28^32° C，停止通氣并保持5(Γ100轉(zhuǎn)/分鐘的緩慢攪拌，發(fā)酵2 4天；整個發(fā)酵過程中控制pH為3.5 4.5。作為一種優(yōu)選方案，S3所述的接種是將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟種子液按I 5:Γ5:Γ5的體積比混合。作為一種進(jìn)一步優(yōu)選方案，S3所述的接種是將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的三級種子液按I 3:Γ3:Γ3的體積比混合。作為一種最優(yōu)選方案，S3所述的接種是將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的三級種子液按1:3:2的體積比混合。作為一種優(yōu)選方案，S3所述的接種量為培養(yǎng)基體積的12%。作為一種優(yōu)選方案，培養(yǎng)基含有如下重量份的組分:12(Γ180份蔗渣，25 30份玉米漿，15 20份葡萄糖，5 10份硫酸銨，2飛份磷酸二氫鉀。作為一種最優(yōu)選方案，培養(yǎng)基含有如下重量份的組分:150份蔗渣，28份玉米漿，18份葡萄糖，7份硫酸銨，4份磷酸二氫鉀。作為一種優(yōu)選方案，上述培養(yǎng)基中的蔗渣(甘蔗渣)經(jīng)機(jī)械粉碎至15(Γ250目。作為一種優(yōu)選方案，S4中前酵期控制溫度30° C，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌培養(yǎng)4小時；主酵期保持溫度為30° C，發(fā)酵3天。作為一種優(yōu)選方案，S4整個發(fā)酵過程中控制pH為4.0。本發(fā)明所述的AS2.489-PS-EG的構(gòu)建方法參見文獻(xiàn):劉澤寰，臺艷，唐根云，全艷彩，王峻梅，肖文娟，龔映雪.綠色木霉EG III基因的克隆及其在工業(yè)釀酒酵母中的整合表達(dá).中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009, 48(6): 83-88.,即本發(fā)明所述的AS2.489-PS-EG是通過所述文獻(xiàn)中的制備方法制備得到的菌種。本發(fā)明所述的AS2.489-PS-CBH的構(gòu)建方法參見文獻(xiàn):劉澤寰，全艷彩，唐根云，龔映雪，肖文娟，王峻梅.綠色木霉CBH II基因的克隆及在釀酒酵母中的表達(dá).華南理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009, 37(6): 91-95.，即本發(fā)明所述的AS2.489-PS-CBH是通過所述文獻(xiàn)中的制備方法制備得到的菌種。本發(fā)明所述的AS2.489-PS-BGL的構(gòu)建方法參見文獻(xiàn):劉澤寰，唐根云，全艷彩，龔映雪，肖文娟，王峻梅.綠色木霉BGLI基因在釀酒酵母中的克隆、表達(dá)及其纖維素乙醇發(fā)酵.蘭州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009, 45(3): 61-66.即本發(fā)明所述的AS2.489-PS-BGL是通過所述文獻(xiàn)中的制備方法制備得到的菌種。本發(fā)明具有如下有益效果:(I)本方法將產(chǎn)酶、纖維素水解和乙醇發(fā)酵在一個體系中完成，不需額外添加纖維素酶，可在發(fā)酵過程中直接分解纖維素并轉(zhuǎn)化為乙醇，省略了糖化步驟，簡化了操作，節(jié)省了成本，是一套綠色環(huán)保低碳的纖維素乙醇生產(chǎn)工藝；(2)本發(fā)明可通過調(diào)整菌株的接種比例對纖維素酶的協(xié)同作用效果進(jìn)行靈活調(diào)控，克服了傳統(tǒng)工藝無法改變纖維素酶之間協(xié)同作用效果的缺點(diǎn)；同時本發(fā)明所用菌株能自身產(chǎn)纖維素酶。


圖1為本發(fā)明統(tǒng)合生物工藝流程圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1發(fā)酵過程中的乙醇、還原糖時間濃度曲線。圖3為本發(fā)明實(shí)施例2發(fā)酵過程中的乙醇、還原糖時間濃度曲線。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例對發(fā)明不做任何形式的限定。實(shí)施例1三種重組菌株按1:1:1的混合比例發(fā)酵纖維素產(chǎn)乙醇情況
51.種子液的制備:
511.分別構(gòu)建能分泌表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表達(dá)外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表達(dá)β-葡萄糖苷酶(BGL)的菌株AS2.489-PS-BGL ；
512.將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的甘油保藏菌株分別劃線于YPD (含重量百分比成分為:2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖)平板，置于30° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。挑取平板上的單菌落，接種于2mL YB)液體培養(yǎng)基中，于30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)24h，即為一級種子液；將一級種子液轉(zhuǎn)接至20mL YPD中，30° C, 200rpm震蕩培養(yǎng)12h，即為二級種子液；將二級種子液轉(zhuǎn)接至200 mL YH)液體培養(yǎng)基中，30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)約6h，使酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到I億，即為成熟種子液；
52.配制發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌:
S21.發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分均以成本低廉的試劑配制；以玉米漿為有機(jī)氮源，配以(NH4)2SO4為無機(jī)氮源，同時以KH2PO4提供培養(yǎng)基的pH緩沖，而纖維素則為發(fā)酵過程的唯一碳源；發(fā)酵培養(yǎng)基的具體組成為:每升發(fā)酵培養(yǎng)基中含有150克經(jīng)機(jī)械粉碎至200目左右的蔗渣，28克玉米漿，18克葡萄糖，7克硫酸銨，4克磷酸二氫鉀；
S22.根據(jù)上述發(fā)酵培養(yǎng)基組分，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，于發(fā)酵罐中121 ° C實(shí)罐
滅菌(實(shí)消)20 min;
53.接種:將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的成熟種子液按體積比1:1:1混合后，于無菌條件下接種，總接種量為培養(yǎng)基體積的12% ；
54.發(fā)酵:前酵期通入無菌空氣，控制溫度為30°C，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌培養(yǎng)4小時，前酵期結(jié)束；然后進(jìn)入主酵期厭氧發(fā)酵階段，主酵期保持溫度為30° C，停止通氣并保持50轉(zhuǎn)/分鐘的緩慢攪拌，發(fā)酵3天；整個發(fā)酵過程中控制pH為4。
發(fā)酵過程中每隔12小時取樣，用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的乙醇產(chǎn)量和還原糖剩余量。結(jié)果見附圖2。乙醇濃度在主酵期60小時逐漸增大并達(dá)到最高濃度17.llg/L(占理論值的50.2%)，在72小時后開始下降。本實(shí)施例重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。附圖2是3次實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計結(jié)果。實(shí)施例2三種重組菌株按1:3:2的混合比例發(fā)酵纖維素產(chǎn)乙醇情況
51.種子液的制備:
511.分別構(gòu)建能分泌表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表達(dá)外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表達(dá)β-葡萄糖苷酶(BGL)的菌株AS2.489-PS-BGL ；
512.將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的甘油保藏菌株分別劃線于YPD (含重量百分比成分為:2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖)平板，置于30° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。挑取平 板上的單菌落，接種于2mL YB)液體培養(yǎng)基中，于30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)24h，即為一級種子液；將一級種子液轉(zhuǎn)接至20mL YPD中，30° C, 200rpm震蕩培養(yǎng)12h，即為二級種子液；將二級種子液轉(zhuǎn)接至200 mL YH)液體培養(yǎng)基中，30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)約6h，使酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到I億，即為成熟種子液；
52.配制發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌:
521.發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:本發(fā)明所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分均以成本低廉的試劑配制。以玉米漿為有機(jī)氮源，配以(NH4)2SO4為無機(jī)氮源，同時以KH2PO4提供培養(yǎng)基的pH緩沖，而纖維素則為發(fā)酵過程的唯一碳源；發(fā)酵培養(yǎng)基的具體組成為:每升發(fā)酵培養(yǎng)基中含有150克經(jīng)機(jī)械粉碎至150目的蔗渣，28克玉米漿，18克葡萄糖，7克硫酸銨，4克磷酸二氫鉀；
522.根據(jù)上述發(fā)酵培養(yǎng)基組分，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，于發(fā)酵罐中121° C實(shí)罐
滅菌(實(shí)消)20 min;
53.接種:將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的成熟種子液按體積比1:3:2混合后，于無菌條件下接種，總接種量為培養(yǎng)基體積的12% ；
54.發(fā)酵:前酵期通入無菌空氣，控制溫度為30°C，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌培養(yǎng)4小時，前酵期結(jié)束；然后進(jìn)入主酵期厭氧發(fā)酵階段，主酵期保持溫度為30° C，停止通氣并保持50轉(zhuǎn)/分鐘的緩慢攪拌，發(fā)酵3天；整個發(fā)酵過程中控制pH為4。
發(fā)酵過程中每隔12小時取樣，用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的乙醇產(chǎn)量和還原糖剩余量。結(jié)果見附圖3。乙醇濃度在主酵期60小時逐漸增大并達(dá)到最高濃度20.76g/L(占理論值的60.9%)，纖維素乙醇產(chǎn)量顯著高于按1:1:1比例混合培養(yǎng)的結(jié)果。本實(shí)施例重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。附圖3是3次實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計結(jié)果。實(shí)施例3三種重組菌株按2:3:4的混合比例發(fā)酵纖維素產(chǎn)乙醇情況
51.種子液的制備:
511.分別構(gòu)建能分泌表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表達(dá)外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表達(dá)β-葡萄糖苷酶(BGL)的菌株AS2.489-PS-BGL ；
512.將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的甘油保藏菌株分別劃線于YPD (含重量百分比成分為:2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖)平板，置于30° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。挑取平板上的單菌落，接種于2mL YB)液體培養(yǎng)基中，于30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)24h，即為一級種子液；將一級種子液轉(zhuǎn)接至20mL YPD中，30° C, 200rpm震蕩培養(yǎng)12h，即為二級種子液；將二級種子液轉(zhuǎn)接至200 mL YH)液體培養(yǎng)基中，30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)約6h，使酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到I億，即為成熟種子液；
52.配制發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌:
521.發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分均以成本低廉的試劑配制；以玉米漿為有機(jī)氮源，配以(NH4)2SO4為無機(jī)氮源，同時以KH2PO4提供培養(yǎng)基的pH緩沖，而纖維素則為發(fā)酵過程的唯一碳源；發(fā)酵培養(yǎng)基的具體組成為:每升發(fā)酵培養(yǎng)基中含有150克經(jīng)機(jī)械粉碎至200目左右的蔗渣，28克玉米漿，18克葡萄糖，7克硫酸銨，4克磷酸二氫鉀；
522.根據(jù)上述發(fā)酵培養(yǎng)基組分，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，于發(fā)酵罐中121° C實(shí)罐
滅菌(實(shí)消)20 min;53.接種:將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的成熟種子液按體積比2:3:4混合后，于無菌條件下接種，總接種量為培養(yǎng)基體積的12% ；
54.發(fā)酵:前酵期通入無菌空氣，控制溫度為30°C，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌培養(yǎng)4小時，前酵期結(jié)束；然后進(jìn)入主酵期厭氧發(fā)酵階段，主酵期保持溫度為30° C，停止通氣并保持50轉(zhuǎn)/分鐘的緩慢攪拌，發(fā)酵3天；整個發(fā)酵過程中控制pH為4。
發(fā)酵過程中每隔12小時取樣，用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的乙醇產(chǎn)量和還原糖剩余量。結(jié)果見附圖2。乙醇濃度在主酵期60小時逐漸增大并達(dá)到最高濃度15.39g/L(占理論值的45.2%)。本實(shí)施例重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。實(shí)施例4三種重組菌株按3:5:2的混合比例發(fā)酵纖維素產(chǎn)乙醇情況
51.種子液的制備:
511.分別構(gòu)建能分泌表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表達(dá)外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表達(dá)β-葡萄糖苷酶(BGL)的菌株AS2.489-PS-BGL ；
512.將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的甘油保藏菌株分別劃線于YPD (含重量百分比成分為:2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖)平板，置于30° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。挑取平板上的單菌落，接種于2mL YB)液體培養(yǎng)基中，于30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)24h，即為一級種子液；將一級種子液轉(zhuǎn)接至20mL YPD中，30° C, 200rpm震蕩培養(yǎng)12h，即為二級種子液；將二級種子液轉(zhuǎn)接至200 mL YH)液體培養(yǎng)基中，30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)約6h，使酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到I億，即為成熟種子液；
52.配制發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌:521.發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分均以成本低廉的試劑配制；以玉米漿為有機(jī)氮源，配以(NH4)2SO4為無機(jī)氮源，同時以KH2PO4提供培養(yǎng)基的pH緩沖，而纖維素則為發(fā)酵過程的唯一碳源；發(fā)酵培養(yǎng)基的具體組成為:每升發(fā)酵培養(yǎng)基中含有150克經(jīng)機(jī)械粉碎至200目左右的蔗渣，28克玉米漿，18克葡萄糖，7克硫酸銨，4克磷酸二氫鉀；
522.根據(jù)上述發(fā)酵培養(yǎng)基組分，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，于發(fā)酵罐中121° C實(shí)罐
滅菌(實(shí)消)20 min;
53.接種:將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的成熟種子液按體積比3:5:2混合后，于無菌條件下接種，總接種量為培養(yǎng)基體積的12% ；
54.發(fā)酵:前酵期通入無菌空氣，控制溫度為30°C，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌培養(yǎng)4小時，前酵期結(jié)束；然后進(jìn)入主酵期厭氧發(fā)酵階段，主酵期保持溫度為30° C，停止通氣并保持50轉(zhuǎn)/分鐘的緩慢攪拌，發(fā)酵3天；整個發(fā)酵過程中控制pH為4。
發(fā)酵過程中每隔12小時取樣，用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的乙醇產(chǎn)量和還原糖剩余量。結(jié)果見附圖2。乙醇濃度在主酵期60小時逐漸增大并達(dá)到最高濃度13.57g/L(占理論值的39.8%)。本實(shí)施例重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。實(shí)施例5三種重組菌株按4:2:5的混合比例發(fā)酵纖維素產(chǎn)乙醇情況
51.種子液的制備:
511.分別構(gòu)建能分泌表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表達(dá)外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表達(dá)β-葡萄糖苷酶(BGL)的菌株AS2.489-PS-BGL ；
512.將AS2.489 -PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的甘油保藏菌株分別劃線于YPD (含重量百分比成分為:2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖)平板，置于30° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。挑取平板上的單菌落，接種于2mL YB)液體培養(yǎng)基中，于30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)24h，即為一級種子液；將一級種子液轉(zhuǎn)接至20mL YPD中，30° C, 200rpm震蕩培養(yǎng)12h，即為二級種子液；將二級種子液轉(zhuǎn)接至200 mL YH)液體培養(yǎng)基中，30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)約6h，使酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到I億，即為成熟種子液；
52.配制發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌:
521.發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分均以成本低廉的試劑配制；以玉米漿為有機(jī)氮源，配以(NH4)2SO4為無機(jī)氮源，同時以KH2PO4提供培養(yǎng)基的pH緩沖，而纖維素則為發(fā)酵過程的唯一碳源；發(fā)酵培養(yǎng)基的具體組成為:每升發(fā)酵培養(yǎng)基中含有150克經(jīng)機(jī)械粉碎至200目左右的蔗渣，28克玉米漿，18克葡萄糖，7克硫酸銨，4克磷酸二氫鉀；
522.根據(jù)上述發(fā)酵培養(yǎng)基組分，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，于發(fā)酵罐中121° C實(shí)罐
滅菌(實(shí)消)20 min;
53.接種:將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的成熟種子液按體積比4:2:5混合后，于無菌條件下接種，總接種量為培養(yǎng)基體積的12% ；
54.發(fā)酵:前酵期通入無菌空氣，控制溫度為30°C，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌培養(yǎng)4小時，前酵期結(jié)束；然后進(jìn)入主酵期厭氧發(fā)酵階段，主酵期保持溫度為30° C，停止通氣并保持50轉(zhuǎn)/分鐘的緩慢攪拌，發(fā)酵3天；整個發(fā)酵過程中控制pH為4。
發(fā)酵過程中每隔12小時取樣，用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的乙醇產(chǎn)量和還原糖剩余量。結(jié)果見附圖2。乙醇濃度在主酵期60小時逐漸增大并達(dá)到最高濃度16.21g/L(占理論值的47.6%)。本實(shí)施例重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。實(shí)施例6三種重組菌株按5:4:3的混合比例發(fā)酵纖維素產(chǎn)乙醇情況
51.種子液的制備:
511.分別構(gòu)建能分泌表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表達(dá)外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表達(dá)β-葡萄糖苷酶(BGL)的菌株AS2.489-PS-BGL ；
512.將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的甘油保藏菌株分別劃線于YPD (含重量百分比成分為:2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖)平板，置于30° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。挑取平板上的單菌落，接種于2mL YB)液體培養(yǎng)基中，于30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)24h，即為一級種子液；將一級種子液轉(zhuǎn)接至20mL YPD中，30° C, 200rpm震蕩培養(yǎng)12h，即為二級種子液；將二級種子液轉(zhuǎn)接至200 mL YH)液體培養(yǎng)基中，30° C，200rpm震蕩培養(yǎng)約6h，使酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到I億，即為成熟種子液；
52.配制發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌:
521.發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分均以成本低廉的試劑配制；以玉米漿為有機(jī)氮源，配以(NH4)2SO4為無機(jī)氮源，同時以KH2PO4提供培養(yǎng)基的pH緩沖，而纖維素則為發(fā)酵過程的唯一碳源；發(fā)酵培養(yǎng)基的具體組成為:每升發(fā)酵培養(yǎng)基中含有150克經(jīng)機(jī)械粉碎至200目左右的蔗渣，28克玉米漿，18克葡萄糖，7克硫酸銨，4克磷酸二氫鉀；
522.根據(jù)上述發(fā)酵培養(yǎng)基組分，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，于發(fā)酵罐中121° C實(shí)罐
滅菌(實(shí)消)20 min;
53.接種:將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的成熟種子液按體積比5:4:3混合后，于無菌條件下接種，總接種量為培養(yǎng)基體積的12% ；
54.發(fā)酵:前酵期通入無菌空氣，控制溫度為30°C，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌培養(yǎng)4小時，前酵期結(jié)束；然后進(jìn)入主酵期厭氧發(fā)酵階段，主酵期保持溫度為30° C，停止通氣并保持50轉(zhuǎn)/分鐘的緩慢攪拌，發(fā)酵3天；整個發(fā)酵過程中控制pH為4。
發(fā)酵過程中每隔12小時取樣，用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的乙醇產(chǎn)量和還原糖剩余量。結(jié)果見附圖2。乙醇濃度在主酵期60小時逐漸增大并達(dá)到最高濃度14.38g/L(占理論值的42.2%)。本實(shí)施例重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
權(quán)利要求
1.一種利用基因重組酵母混合培養(yǎng)將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的方法，其特征在于，包括如下步驟:子液的制備:首選分別構(gòu)建能分泌表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表達(dá)外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表達(dá)β -葡萄糖苷酶BGL的菌株AS2.489-PS-BGL ;然后活化培養(yǎng)各菌株至對數(shù)生長期，并使各菌株的酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到0.8^1億/mL，即為成熟種子液；制發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌，所述培養(yǎng)基含有如下重量份的組分:100100份蔗渣，20^40份玉米漿，10^30份葡萄糖，5 15份硫酸銨，Γ10份磷酸二氫鉀；種:將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的成熟種子液混合后，于無菌條件下接種，總接種量為培養(yǎng)基體積的8 15% ；酵:前酵期通入無菌空氣，控制溫度為28 32°C，攪拌速度為15(Γ250轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌培養(yǎng):Γ5小時，前酵期結(jié)束；然后進(jìn)入主酵期厭氧發(fā)酵階段，主酵期保持溫度為28^32° C，停止通氣并保持5(Γ100轉(zhuǎn)/分鐘的緩慢攪拌，發(fā)酵2 4天；整個發(fā)酵過程中控制pH為3.5 4.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S3所述的接種是將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟種子液按I 5:Γ5:Γ5的體積比混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S3所述的接種是將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟種子液按I 3:Γ3:Γ3的體積比混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，S3所述的接種是將AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟種子液按1:3:2的體積比混合。`
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S3所述的接種量為培養(yǎng)基體積的12%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基含有如下重量份的組分:12(Γ180份蔗渣，25 30份玉米漿，15 20份葡萄糖，5 10份硫酸銨，2飛份磷酸二氫鉀。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基含有如下重量份的組分:150份蔗渣，28份玉米漿，18份葡萄糖，7份硫酸銨，4份磷酸二氫鉀。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、6或7所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基中的蔗渣經(jīng)機(jī)械粉碎至150 250目。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S4中前酵期控制溫度30°C，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌培養(yǎng)4小時；主酵期保持溫度為30° C，發(fā)酵3天。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的方法，其特征在于，S4整個發(fā)酵過程中控制pH為4.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程及發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體公開了一種利用基因重組酵母混合培養(yǎng)將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的方法。該方法是利用基因工程技術(shù)構(gòu)建能分別分泌表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EG、外切葡聚糖酶CBH和β-葡萄糖苷酶BGL的三種基因重組釀酒酵母菌株，然后將上述三種基因重組酵母菌株混合培養(yǎng)，并以纖維素原料為唯一碳源發(fā)酵，可較高效地將纖維素直接轉(zhuǎn)化為乙醇。本發(fā)明方法將產(chǎn)酶、纖維素水解和乙醇發(fā)酵在一個體系中完成，不需額外添加纖維素酶，可在發(fā)酵過程中直接分解纖維素并轉(zhuǎn)化為乙醇，省略了糖化步驟，簡化了操作，節(jié)省了成本，是一套綠色環(huán)保低碳的纖維素乙醇生產(chǎn)工藝。
文檔編號C12P7/10GK103103221SQ20131003347
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者劉澤寰, 林蔣海, 胡佳, 黎惠忠, 李晶博, 龔映雪, 肖文娟 申請人:廣州分子生物技術(shù)有限公司, 暨南大學(xué)