一種將穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入黃色短桿菌（或谷氨酸棒桿菌）的轉(zhuǎn)化方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種能在大腸桿菌和黃色短桿菌（或谷氨酸棒桿菌）中穿梭表達(dá)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入谷氨酸棒桿菌和營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌的快速有效方法。本發(fā)明提供的方法包括制備感受態(tài)細(xì)胞和高溫培養(yǎng)轉(zhuǎn)化兩個(gè)步驟：（1）將營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌（或谷氨酸棒桿菌）接種至特殊配制的培養(yǎng)基上，使?fàn)I養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌（或谷氨酸棒桿菌）快速增殖，之后再轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基上，制備感受態(tài)細(xì)胞。（2）將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒和上述制備的感受態(tài)細(xì)胞混勻并冰浴，然后恒溫培養(yǎng)，將質(zhì)粒導(dǎo)入到所述待轉(zhuǎn)化的黃色短桿菌（或谷氨酸棒桿菌）中。本發(fā)明提供的方法，能減少黃色短桿菌對(duì)穿梭質(zhì)粒的限制性酶切作用，并能穩(wěn)定復(fù)制和傳遞，轉(zhuǎn)化效果好，操作簡(jiǎn)便。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種將穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)的轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)菌轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體涉及一種將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)中的方法，包括野生型和營(yíng)養(yǎng)缺陷型。
【背景技術(shù)】
[0002]黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛存在于自然界中。由于黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)的特性，一般化學(xué)法制備的感受態(tài)細(xì)胞很難將質(zhì)粒導(dǎo)入黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)細(xì)胞，或者在基因工程菌構(gòu)建中常用的轉(zhuǎn)化法是電擊轉(zhuǎn)化比較容易將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，但是電擊轉(zhuǎn)化黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)所用的感受態(tài)細(xì)胞制備的培養(yǎng)基原料較昂貴，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率不太高，電壓(電容與電阻的設(shè)置)和時(shí)間參數(shù)是關(guān)鍵參數(shù)。而對(duì)于條件比較簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，電轉(zhuǎn)設(shè)備缺乏的情況下，用此化學(xué)方法制備感受態(tài)細(xì)胞，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌中，37°C恒溫培養(yǎng)一段時(shí)間后，質(zhì)粒能夠在細(xì)菌中穩(wěn)定遺傳，是一個(gè)節(jié)省成本的好方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提供一種比較簡(jiǎn)便的特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法制備黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)感受態(tài)細(xì)胞，并恒溫培養(yǎng)將質(zhì)粒導(dǎo)入其細(xì)胞能穩(wěn)定遺傳的簡(jiǎn)便方法。
[0004]本發(fā)明提供的制備黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)化的方法:
(I)所述感受態(tài)細(xì)胞制備步驟如下:
挑取一新鮮培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78單菌落接種于2.5 ml GM I培養(yǎng)基中，300C，130-150 rpm的條件下，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；將過(guò)夜培養(yǎng)物按10%接種量轉(zhuǎn)接到2.5ml新鮮的GM I中，37°C 200-230 rpm振蕩培養(yǎng)3.5h ;再將培養(yǎng)物進(jìn)行第二次傳代，接種于5 ml GMII培養(yǎng)基中，按5%接種量進(jìn)行第二次傳代，37°C 200-230 rpm振蕩培養(yǎng)90 min，取I ml培養(yǎng)物，5000 rpm室溫離心5 min，用1/10體積上清液重新懸浮細(xì)菌沉淀，即為營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌感受態(tài)細(xì)胞。同理，將谷氨酸棒桿菌ATCC 13032制備成的感受態(tài)細(xì)胞，方法類(lèi)似于上述制備營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌感受態(tài)細(xì)胞，營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株，所加的試劑是氨基酸，非營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株，將氨基酸改用無(wú)菌水代替。所述GM I生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溶劑為水(如雙蒸水)，溶質(zhì)及其濃度如下=15% K2HPO4.3H20，6% KH2P04，2% (NH4) 2S04,0.2%MgSO4,1%檸檬酸鈉，將上述各成份溶于蒸餾水中，6.6X IO4 Pa高壓滅菌，室溫保存；10%酵母粉，1%水解酪蛋白，25mM MgCl2 (MgCl2*6H20，分子量為203)，高壓滅菌，酵母粉溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，水解酪蛋白和MgCl2溶液可室溫儲(chǔ)存；20%葡萄糖，0.25%所需氨基酸His (組氨酸)、Pro (脯氨酸)、Met (甲硫氨酸)，0.1M CaCl2 (CaCl2*2H20，分子量為 147)，用 0.22 μ m的微孔濾膜除菌，葡萄糖溶液和CaCl2室溫儲(chǔ)存，氨基酸溶液_20°C保存。
[0005](2)所述將穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78 (或谷氨酸棒桿菌ATCC13032)細(xì)胞的步驟如下:取質(zhì)粒pXMJ19、pXMJ19-argH和無(wú)菌水各10 μ I加至營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌ΑΝ78感受態(tài)細(xì)胞懸浮液中，至終濃度I μ g/ml，質(zhì)粒體積不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的1/20，混勻。37°C水浴中靜置30-60 min，37°C 200 rpm振蕩培養(yǎng)2-4 h，涂布于含有氯霉素(30 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，每100 μ I轉(zhuǎn)化體系涂I個(gè)平板，每一種黃色短桿菌的轉(zhuǎn)化體系涂5個(gè)平板，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。計(jì)算平均轉(zhuǎn)化率(轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)/y g DNA)。由于黃色短桿菌是營(yíng)養(yǎng)缺陷型，在LB固體培養(yǎng)基中加入3%的氨基酸混合液(0.25% His，Pro，Met)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78生長(zhǎng)良好。同理，谷氨酸棒桿菌13032轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)流程類(lèi)似于黃色短桿菌AN78，由于谷氨酸棒桿菌13032是野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株，在涂布轉(zhuǎn)化體系的LB平板時(shí)，不加入氨基酸混合液。
[0006]LB液體培養(yǎng)基(PH 7.2)的制備方法:將IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg氯化鈉和雙蒸水充分混勻并用雙蒸水定容至1L。
[0007]營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78的LB培養(yǎng)基配制:將10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、IOg氯化鈉和雙蒸水充分混勻并用雙蒸水定容至1L,加入0.25%的His、Pro、Met氨基酸混合液3ml。
[0008]所述待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒具體可為穿梭質(zhì)粒pXMJ19以及它的重組質(zhì)粒。
[0009]所述野生型谷氨酸棒桿菌或經(jīng)過(guò)誘變的營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78可為未經(jīng)基因工程菌改造的谷氨酸棒桿菌(或黃色短桿菌)。所述的谷氨酸棒桿菌的菌株是ATCC13032，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株是黃色短桿菌AN78。
[0010]所述轉(zhuǎn)化與 所述感受態(tài)細(xì)胞的配比為:100 ng-5 μ g (如100 ng-2 μ g或2-5 μ g)所述轉(zhuǎn)化質(zhì)粒:0.2 X IO9 CFU-0.49 X IO9 CFU (如 0.2 X IO9 CFU-0.31 X IO9CFU 或0.31 X IO9CFU -0.49 X IO9 CFU 感受態(tài)細(xì)胞)。
[0011]所述離心的條件具體可為:5000 r/min,離心10 min。
[0012]所述質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞的整個(gè)轉(zhuǎn)化流程中，都處于冰浴的條件下。
[0013]以上任一所述的振蕩條件可采用如下:150-220 rpm，如150-180 rpm或180-220rpm,所述振蕩的半徑具體可為12 mm。
[0014]黃色短桿菌在指數(shù)生長(zhǎng)期會(huì)有部分細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)，尤其是在營(yíng)養(yǎng)貧乏的培養(yǎng)基中易形成感受態(tài)細(xì)胞，例如以葡萄糖為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。本發(fā)明針對(duì)常規(guī)的黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)轉(zhuǎn)化方法，依托黃色短桿菌或谷氨酸棒桿菌的自然轉(zhuǎn)化原理，思路清晰，操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化效果好，為對(duì)菌株進(jìn)一步的遺傳操作打下基礎(chǔ)。本發(fā)明可在棒桿菌類(lèi)轉(zhuǎn)化上應(yīng)用，前景廣闊。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖l.pXMJ19質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]圖2.pXMJ19_argH質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017]圖3.為實(shí)施例1中的抽提的質(zhì)粒PXMJ19和及^7? I WLBernH I單酶切鑒定結(jié)果。I泳道為I單酶切的質(zhì)粒PXMJ19 ；2泳勸BamH I單酶切的質(zhì)粒pXMJ19 ；3泳道為抽提的未酶切的質(zhì)粒PXMJ19 ;4泳道為Marker，從上到下分別為，10000 bp, 7000 bp, 4000 bp,2000 bp,1000 bp,500 bp,250 bp。
[0018]圖4.為實(shí)施例2中抽提的重組質(zhì)粒PXMJlkargH以及EcoR I熱BamH I雙酶切鑒定結(jié)果。I泳道為Marker，從上到下分別為，10000 bp, 7000 bp, 4000 bp, 2000 bp,1000 bp, 500 bp, 250 bp;2 泳道為I 單酶切的質(zhì)粒 pXMJ19_argH ;3 泳道為I 和BamH I雙酶切重組質(zhì)粒pXMJ19_argH ；4泳道為抽提的質(zhì)粒，5泳造為BamH I單酶切的質(zhì)粒pXMJ19-argH。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。本專(zhuān)利中的” h”均代表小時(shí)。本專(zhuān)利中的“min”均代表分鐘。
[0020]谷氨酸棒桿菌ATCC 13032:購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78是本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0021]穿梭質(zhì)粒pXMJ19 (結(jié)構(gòu)示意見(jiàn)圖1):購(gòu)自北大工學(xué)院紹興技術(shù)研究院。
[0022]穿梭重組質(zhì)粒pXMJ19_argH，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2。
[0023]LB液體培養(yǎng)基(PH 7.2)的制備方法:將10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化鈉和雙蒸水充分混勻并用雙蒸水定容至IL ;121 1:高溫滅菌20 min。
[0024]LB固體培養(yǎng)基(PH 7.2)的制備方法:將10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化鈉、15g瓊脂粉和雙 蒸水充分混勻并用雙蒸水定容至IL ;121度高溫滅菌20 min。
[0025]IOX無(wú)機(jī)鹽母液(PH 7.0)的制備方法:將10 g硫酸銨、60 g磷酸氫二鉀、10 g檸檬酸三鈉和2g七水合硫酸鎂用雙蒸水溶解并定容至1L，121°C高溫滅菌20 min。
[0026]20%葡萄糖溶液的制備方法:將20g葡萄糖用雙蒸水溶解定容至100 ml，用過(guò)
0.22um細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌，保存于4°C冰箱。
[0027]2%酪蛋白水解物溶液的制備方法:將2g酪蛋白水解物，用雙蒸水溶解并定容至100ml，用0.22 μ m細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌。
[0028]實(shí)施例1穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的轉(zhuǎn)化方法 生長(zhǎng)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備
生長(zhǎng)培養(yǎng)基(IL)的制備方法:將IOX無(wú)機(jī)鹽母液，20%葡萄糖溶液、2%酪蛋白水解物溶液和雙蒸水混合，得到生長(zhǎng)培養(yǎng)基GM I ;生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溶劑為雙蒸水，溶質(zhì)及其濃度如下:硫酸銨2 g/L、磷酸氫二鉀14.8 g/L、檸檬酸三鈉1.9 g/L、硫酸鎂0.098 g/L、葡萄糖5g/L、酪蛋白水解物0.2 g/L。
[0029]誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IL)的制備方法:將IOX無(wú)機(jī)鹽母液，0.5 ml 0.1M CaCl2, Iml 25mM MgCl2, 20 %葡萄糖溶液和雙蒸水混合，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)基GM II ;誘導(dǎo)培養(yǎng)基的溶劑為雙蒸水，溶質(zhì)及其濃度如下:硫酸銨2 g/L、磷酸氫二鉀14.8 g/L、檸檬酸三鈉1.9 g/L、硫酸鎂 0.098 g/L、葡萄糖 5 g/L。
[0030]感受態(tài)細(xì)胞的制備如見(jiàn)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0031]將穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌，實(shí)驗(yàn)流程如見(jiàn)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0032]轉(zhuǎn)化效果的驗(yàn)證
隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化平板上生長(zhǎng)的形態(tài)與谷氨酸棒桿菌ATCC 13032相近的單菌落，在含30μ g/ml氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取10株進(jìn)行純化培養(yǎng)，其中轉(zhuǎn)化pXMJ19-argH和PXMJ19質(zhì)粒的菌株分別各5株，共獲得10株純培養(yǎng)的菌株。
[0033]將得到的純培養(yǎng)菌株在含30 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、180rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
[0034]取完成培養(yǎng)體系抽提質(zhì)粒，一部分重組質(zhì)粒pXMJ19_argH為模板并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序；另一部分抽提的質(zhì)粒PXMJ19和重組質(zhì)粒pXMJ19-argH電泳檢測(cè)并用限制性?xún)?nèi)切酶IiBamH I進(jìn)行單酶切鑒定，重組質(zhì)粒pXMJ19-argH進(jìn)行I取BamH I雙酶切驗(yàn)證。則該菌株為成功將穿梭質(zhì)粒pXMJ19_argH和PXMJ19導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌ATCC 13032細(xì)胞中。價(jià)ο/? I琳BamH I單酶切驗(yàn)證質(zhì)粒pXMJ19(見(jiàn)圖3)，結(jié)果表明，成功穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入了谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的細(xì)胞中。 [0035]獲得的10株純培養(yǎng)菌株，經(jīng)過(guò)抽提質(zhì)粒、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，有6株(其中導(dǎo)入pXMJ19-argH的細(xì)胞為兩株，而導(dǎo)入pXMJ19的細(xì)胞為四株)是成功將穿梭載體pXMJ19_argH或PXMJ19導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌13032的重組菌，轉(zhuǎn)化效率為60%。
[0036]實(shí)施例2將穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78的轉(zhuǎn)化方法 生長(zhǎng)培養(yǎng)基GM I和誘導(dǎo)培養(yǎng)基GM II的制備
生長(zhǎng)培養(yǎng)基(I L)GM I的制備方法:將IOX無(wú)機(jī)鹽母液，20%葡萄糖溶液、2%酪蛋白水解物溶液和雙蒸水混合，得到生長(zhǎng)培養(yǎng)基；生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溶劑為雙蒸水，溶質(zhì)及其濃度如下:硫酸銨2 g/L、磷酸氫二鉀14.8 g/L、檸檬酸三鈉1.9 g/L、硫酸鎂0.098 g/L、葡萄糖5 g/L、酪蛋白水解物0.2 g/L, 0.25%氨基酸混合液(His，Met, Pro)。
[0037]誘導(dǎo)培養(yǎng)基(I L)GM II的制備方法:將IOX無(wú)機(jī)鹽母液，20%葡萄糖溶液和雙蒸水混合，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)基；生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溶劑為雙蒸水，溶質(zhì)及其濃度如下:硫酸銨2g/L、磷酸氫二鉀14.8 g/L、檸檬酸三鈉1.9 g/L、硫酸鎂0.098 g/L、葡萄糖5 g/L, 0.25%氨基酸混合液(His, Met, Pro)ο
[0038]感受態(tài)細(xì)胞的制備如見(jiàn)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0039]將穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78，實(shí)驗(yàn)流程如見(jiàn)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0040]轉(zhuǎn)化效果的驗(yàn)證
隨機(jī)挑取步驟三的平板上生長(zhǎng)的形態(tài)與營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78相近的單菌落，在含30 μ g/ml氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取10株進(jìn)行純化培養(yǎng)，共獲得10株純培養(yǎng)的菌株。
[0041]將得到的純培養(yǎng)菌株在含30 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C >180 rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
[0042]取完成培養(yǎng)體系抽提質(zhì)粒，一部分重組質(zhì)粒pXMJ19_argH為模板并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序；另一部分抽提的質(zhì)粒PXMJ19和重組質(zhì)粒pXMJ19-argH電泳檢測(cè)并用限制性?xún)?nèi)切酶IiBamH I進(jìn)行單酶切鑒定，重組質(zhì)粒pXMJ19-argH進(jìn)行I取BamH I雙酶切驗(yàn)證。則該菌株為成功將穿梭質(zhì)粒pXMJ19_argH和pXMJ19導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78細(xì)胞中，抽提的重組質(zhì)粒pXMJ19_argH經(jīng)過(guò)雙酶切及和I中，結(jié)果有兩條約6600bp和1400bp的條帶出現(xiàn)(結(jié)果見(jiàn)圖4)，證明穿梭質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化導(dǎo)入了營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78中。
[0043]上述步驟獲得的10株純培養(yǎng)菌株均為成功將穿梭載體pXMJ19_argH和pXMJ19導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化效率為100%。
【權(quán)利要求】
1.在特殊的培養(yǎng)基上使得細(xì)菌細(xì)胞處于感受態(tài)的狀況下，能將在大腸桿菌和黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)中穿梭表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入到營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)中的方法，包括制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化兩個(gè)步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的感受態(tài)細(xì)胞制備的培養(yǎng)基，其特征在于配方: . IOml GM1:1mlIOXspizizen salts, . 0.1ml 10%酵母粉， . 0.25ml 20% 葡萄糖， . 0.2ml 1%水解酪蛋白， . 0.2ml 0.25%所需氨基酸， 補(bǔ)充滅菌蒸餾水至總體積為IOml ； . IOml GMI1:1mlIOXspizizen salts, . 0.05ml 10% 酵母粉，. 0.25ml 20% 葡萄糖， . 0.04ml 1%水解酪蛋白， . 0.2ml 0.25%所需氨基酸， . 0.05ml 0.1M CaCl2, . Iml25mM MgCl2, 補(bǔ)充滅菌蒸餾水至總體積為IOml ； . IOXspizizen salts (100ml): . 15% K2HPO4.3H20, 15g3g. 6% KH2PO4,6g1.2g .2% (NH4)2SO4,2g0.4. 0.2% MgSO4,0.2g0.04. 1% 檸檬酸鈉，Ig0.2 溶于蒸餾水中，6.6X IO4 Pa高壓滅菌，室溫保存；營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株，所加的試劑是氨基酸，非營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株，將氨基酸改用無(wú)菌水代替；通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)先在GMI培養(yǎng)基上快速增殖，達(dá)到對(duì)數(shù)期后，轉(zhuǎn)接入營(yíng)養(yǎng)相對(duì)缺乏的培養(yǎng)基上GMII，使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，相當(dāng)于細(xì)胞處于感受態(tài)的條件下，在質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞后，能減少黃色短桿菌(或谷氨酸棒桿菌)對(duì)質(zhì)粒的限制酶切作用，穩(wěn)定遺傳。
3.如權(quán)利要求1至2任一所述的方法，其特征在于:所述待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒與所述感受態(tài)細(xì)胞的配比為:100ng-5 μ g所述待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒:0.2X IO9CFU -0.49X IO9 CFU感受態(tài)細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒為穿梭質(zhì)粒pXMJ19, pXMJ19-argH。
5.如權(quán)利要求1至4任一所述的方法，其特征在于:所述轉(zhuǎn)化整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程都處于冰浴的條件下。
6.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌為經(jīng)過(guò)誘變的組氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株；所述谷氨酸棒桿菌ATCC 13032是標(biāo)準(zhǔn) 菌株。
【文檔編號(hào)】C12R1/13GK103966251SQ201310033531
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月29日
【發(fā)明者】王翠平, 馬承國(guó), 王開(kāi)成, 張傳軍 申請(qǐng)人:上海凱圣生物科技有限公司, 山西凱盛肥業(yè)有限公司