專利名稱：S-扁桃酸脫氫酶與漆酶偶聯(lián)反應制備苯乙酮酸和r-扁桃酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過鐵氰化物或亞鐵氰化物作為偶聯(lián)劑將兩種酶偶聯(lián)催化S-扁桃酸生成苯乙酮酸的方法，同時實現(xiàn)外消旋扁桃酸手性拆分，具體涉及S-扁桃酸脫氫酶和漆酶的偶聯(lián)反應。
背景技術(shù)：
S-扁桃酸脫氫酶是一類以黃素FMN為輔酶的氧化還原酶，能專一性催化氧化S-扁桃酸生成苯乙酮酸，其輔酶FMN還原為FMNH2。鐵氰化物可以氧化FMNH2生成FMN和亞鐵氰化物。漆酶是一類包含銅離子的酚氧化酶，其利用氧氣將底物氧化，而氧氣被還原成水，而且漆酶具有底物催化范圍廣的特點，可以催化亞鐵氰化物氧化為鐵氰化物。國外DietmarHaltrich等人曾用纖維二糖脫氫酶和漆酶偶聯(lián)生產(chǎn)乳糖酸，但缺乏鐵氰化物作為化學媒介的實驗數(shù)據(jù)。我們以鐵氰化物作為反應媒介，偶聯(lián)漆酶和S-扁桃酸脫氫酶催化的酶反應，進行苯乙酮酸的制備以及外消旋扁桃酸的手性拆分，生產(chǎn)手性扁桃酸，產(chǎn)物R-扁桃酸的對映體過量值可達99.8 %。

發(fā)明內(nèi)容
本 發(fā)明的目的是以亞鐵氰化物或鐵氰化物作為反應媒介，通過漆酶再生輔因子，實現(xiàn)S-扁桃酸脫氫酶和漆酶偶聯(lián)催化S-扁桃酸轉(zhuǎn)化成苯乙酮酸。其反應歷程如下:
權(quán)利要求
1.一種s-扁桃酸脫氫酶與漆酶偶聯(lián)反應制備苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于所述制備步驟如下: 步驟1、將0.ri mmol/L亞鐵氰化物或鐵氰化物用pH為:T8的緩沖液溶解后放在容器中； 步驟2、加入1 100 mmol/L外消旋扁桃酸，添加10飛00活力單位的S-扁桃酸脫氫酶和10^500活力單位的漆酶后，在1(T45°C反應。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-扁桃酸脫氫酶與漆酶偶聯(lián)反應制備苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步驟I中所述的緩沖液為NaH2PO4-檸檬酸緩沖液或Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-扁桃酸脫氫酶與漆酶偶聯(lián)反應制備苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步驟I中所述的亞鐵氰化物為亞鐵氰化鉀或亞鐵氰化鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-扁桃酸脫氫酶與漆酶偶聯(lián)反應制備苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步驟I中所述的鐵氰化物為鐵氰化鉀或鐵氰化鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-扁桃酸脫氫酶與漆酶偶聯(lián)反應制備苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步驟2中所述的S-扁桃酸脫氫酶的活力單位為在30°C，pH6.5的緩沖液中一分鐘轉(zhuǎn)化I Mmol鐵氰化物生成亞鐵氰化物所需的酶量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-扁桃酸脫氫酶與漆酶偶聯(lián)反應制備苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步驟2中所述的漆酶的活力單位為在30°C，pH6.5的緩沖液中一分鐘轉(zhuǎn)化I Mmol亞鐵氰化物生成鐵氰化物所需的酶量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-扁桃酸脫氫酶與漆酶偶聯(lián)反應制備苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步驟2中所述的反應時間為6-14小時。
全文摘要
本發(fā)明提供一種S-扁桃酸脫氫酶和漆酶偶聯(lián)催化S-扁桃酸轉(zhuǎn)化成苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，該方法特別之處是通過漆酶不斷再生反應媒介，進而不斷再生S-扁桃酸脫氫酶的輔酶FMN，從而將S-扁桃酸脫氫酶和漆酶偶聯(lián)起來進行催化反應，這樣，只需要少量的反應媒介，通過充分利用酶催化的高效性，不斷催化氧化S-扁桃酸，提高了單一使用S-扁桃酸脫氫酶的轉(zhuǎn)化效率，降低了反應成本。本發(fā)明用S-扁桃酸脫氫酶和漆酶兩種酶偶聯(lián)催化S-扁桃酸轉(zhuǎn)化為苯乙酮酸，產(chǎn)物R-扁桃酸的對映體過量值可達99.8％。該法只需少量的亞鐵氰化物或鐵氰化物作為反應媒介，工藝簡單、成本低、環(huán)境壓力小、純度高，便于工業(yè)化生產(chǎn)，對外消旋扁桃酸的手性拆分具有很大的應用價值。
文檔編號C12P7/40GK103088076SQ20131003441
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者李大力, 王鵬, 楊軍方, 楊成麗 申請人:南京理工大學