一種海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白的制備方法，步驟為：取海膽卵研磨，將研磨液涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)2天；挑取單菌落反復(fù)劃線培養(yǎng)至純菌株；得海膽共生多粘芽孢桿菌DNC2；將DNC2菌株在pH9的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中35℃發(fā)酵1天，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中牛肉膏和蛋白胨所占的質(zhì)量百分比分別為3%和6%；4000r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為60%，4℃靜置過(guò)夜，10000r/min離心處理30min，將沉淀物用PBS緩沖液溶解后，再用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析4天，得海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白。本方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉。
【專利說(shuō)明】一種海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海膽為棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinoderma-to)海膽綱(Echinoidea)動(dòng)物。海膽以其生殖腺供食，其生殖腺又稱海膽卵、海膽籽、海膽黃、海膽膏，色橙黃，味鮮香，占海膽全重的8%~15%。目前世界上已發(fā)現(xiàn)的海膽有850余種，常見(jiàn)的包括光棘球海膽(也稱大連紫海膽)、紫海膽以及馬糞海膽。
[0003]海膽綱的一些種類自古即為滋補(bǔ)佳品，常用于預(yù)防和治療一些疾病，這些功能主要是由其所含多糖、蛋白、脂肪酸、色素、微量元素等活性物質(zhì)成分決定的，各成分的鑒定及功效正在被逐漸證明。另外海膽中還含有一些共附微生物，但這些微生物及其代謝產(chǎn)物迄今未止還沒(méi)有被充分利用。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉、利用海膽卵制備海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白的方法，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005]本發(fā)明的一種海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白的制備方法，步驟如下:
a.取健康、新鮮的海膽卵研磨后，將200PL研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，在37 °C恒溫條件下培養(yǎng)2天；
b.挑取單菌落反復(fù)劃線培養(yǎng)至純菌株；得到海膽共生多粘芽孢桿菌DNC2(Bacilluspolymyxa);該菌株已于2012年12月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào):CGMCC No: 7078 ；
c.將DNC2菌株在pH9的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中35°C條件下發(fā)酵I天，所述牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中牛肉膏和蛋白胨所占的質(zhì)量百分比分別為3%和6% ；
d.在4000r/min的條件下離心去除菌體,在上清液中加入硫酸銨,硫酸銨的飽和終濃度為60%，4°C靜置過(guò)夜，在10000 r/min條件下離心處理30 min,將沉淀物用PBS緩沖液溶解后，再用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中的物質(zhì)冷凍干燥，得海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白。
[0006]本發(fā)明的海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉，從海膽共生多粘芽孢桿菌菌株DNC2的發(fā)酵液中所提取的抗腫瘤活性蛋白抗腫瘤活性強(qiáng)，對(duì)白血病k562細(xì)胞株、人肝癌H印G2，乳腺癌MDA-MB-231和MFC-7均有明顯的抑制活性，因此可應(yīng)用于抗腫瘤藥品的制備，具有產(chǎn)業(yè)價(jià)值。
[0008]本發(fā)明中的海膽源多粘芽孢桿菌菌株已于2012年12月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào):CGMCC No: 7078。
【具體實(shí)施方式】
[0009]本發(fā)明的實(shí)施例依次按如下步驟進(jìn)行:
a.將打撈后的新鮮海膽，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌水清洗5遍后，取干凈、新鮮的海膽卵用研磨機(jī)充分研磨成勻漿后，將200 PL研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37 °C恒溫培養(yǎng)2天。
[0010]b.挑取單個(gè)形態(tài)各異的菌落反復(fù)劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，用濾紙片法檢測(cè)各純菌株的抑菌活性作為初步篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明DNC2菌株抑菌活性明顯。
[0011]對(duì)DNC2活性菌株利用16sRNA分子鑒定確定其為芽孢桿菌屬，通過(guò)耐鹽性試驗(yàn)、對(duì)溶菌酶抗性試驗(yàn)、V.P實(shí)驗(yàn)、苯丙氨酸、丙二酸鹽實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、產(chǎn)糊精結(jié)晶、油脂水解、淀粉水解、二羥丙酮的形成、過(guò)氧化氫酶、酪氨酸水解、產(chǎn)硫化氫、明膠水解、對(duì)溶菌酶抗性、石蕊牛乳實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵、硝酸鹽還原、產(chǎn)生吲哚、動(dòng)力實(shí)驗(yàn)、卵磷脂酶、甲基紅實(shí)驗(yàn)、酪素水解等生理生化試驗(yàn)將其鑒定到種，該活性菌株為多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa),該菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào):CGMCC No: 7078 ；
c.以抑菌圈平均直徑為標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的最佳條件，在pH9的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中35°C發(fā)酵I天，所述牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中牛肉膏和蛋白胨的質(zhì)量百分比分別為3%和6% ；
d.在4000r/min條件下離心處理,去除菌體,在上清液中加入硫酸銨,硫酸銨的飽和終濃度為60%，4°C靜置過(guò)夜，在10000 r/min條件下離心處理30 min,將沉淀物用PBS緩沖液溶解后，再用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中的物質(zhì)冷凍干燥，得海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白；SDS-PAGE電泳結(jié)果表明沉淀物為蛋白質(zhì)。
[0012]e.體外抗腫瘤活性的檢測(cè):取凍干樣品用DMEM溶解，培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞(將肝癌細(xì)胞HePG2、乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7、白血病細(xì)胞K562)，樣品設(shè)定濃度梯度，用MTT法測(cè)蛋白作用后腫瘤細(xì)胞存活率。具體操作如下:
首先培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，將肝癌細(xì)胞HePG2、乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7、白血病細(xì)胞K562復(fù)蘇到20%的血清培養(yǎng)集中，培養(yǎng)4飛天，接種到六孔板中，換成10%培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到2 X IO6后接種到96孔板中，每空100 PL，過(guò)夜；將蛋白用DMEM溶液溶解，然后用DMEM做梯度稀釋(10、20、30、40、60、80、100、150 Pg/mL)，將96孔板中培養(yǎng)基棄掉加入蛋白樣品孵育6小時(shí)，空白對(duì)照只加DMEM。配制MTT，6小時(shí)后每空加入10 μL ΜΤΤ，孵育4小時(shí)，然后將孔內(nèi)液體棄掉，每空加入100 μL DMSO溶解紫色結(jié)晶，37 °C水浴保持20分鐘。然后用酶標(biāo)儀在490 nm下測(cè)吸光度值進(jìn)而處理數(shù)據(jù)計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果該蛋白在60 μδ/mL時(shí)對(duì)白血病細(xì)胞K562抑制率就可達(dá)65.8%，在300 Pg/mL時(shí)抑制率高達(dá)95.87% ;該蛋白在60 μg/mL對(duì)肝癌細(xì)胞HePG2抑制率為73.29%，在300 μg/mL時(shí)抑制率為90.41% ;在150^gZmL時(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231抑制率為81.64%，300 Pg/mL時(shí)抑制率為95.67% ;而對(duì)MCF-7細(xì)胞株的抑制率在30 Pg/mL時(shí)就可達(dá)60.93%，該菌株發(fā)酵液在低劑量范圍內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞 ，因此可作為粉劑或針劑應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備。
【權(quán)利要求】
1.一種海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白的制備方法，其特征在于:步驟如下: a.取健康、新鮮的海膽卵研磨成均漿后，將研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，在37 °C恒溫條件下培養(yǎng)2天； b.挑取單菌落反復(fù)劃線培養(yǎng)至純菌株；得到海膽共生多粘芽孢桿菌DNC2{Bacillus
該菌株已于2013年I月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào):CGMCC No: 7078 ； c.將DNC2菌株在pH9的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中35°C條件下發(fā)酵I天，所述牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中牛肉膏和蛋白胨所占的質(zhì)量百分比分別為3%和6% ； d.在4000r/min的條件下離心去除菌體,在上清液中加入硫酸銨,硫酸銨的飽和終濃度為60%，4°C靜置過(guò)夜，在10000 r/min條件下離心處理30 min,將沉淀物用PBS緩沖液溶解后，再用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中的物質(zhì)冷凍干燥，得海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述所的海膽源多粘芽孢桿菌抗腫瘤活性蛋白的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/12GK103966285SQ201310034685
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月30日
【發(fā)明者】張付云, 徐鳳, 蒼桂璐, 楊陽(yáng), 劉曄 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué), 張付云