專利名稱：一種肺炎克雷伯菌kpc型碳青霉烯酶基因核酸檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及blaKPC基因檢測試劑盒，特別是涉及一種利用復合探針技術實時熒光PCR技術檢測肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶基因(blaKPC基因)的試劑盒。該試劑盒通過對樣本中的blaKPC基因進行定性檢測，可廣泛應用于含blaKPC基因細菌感染的輔助診斷。
背景技術：
肺炎克雷伯菌是引起醫(yī)院感染和社區(qū)感染的條件致病菌之一。碳青霉烯類抗菌藥物是治療包括產(chǎn)超廣譜內酰胺酶(ESBLs)在內的肺炎克雷伯菌所致嚴重感染的強有力武器。但是，隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床上的大量使用，出現(xiàn)了不同的耐藥菌株如銅綠假單胞菌和不動桿菌屬細菌。2001年，自Yig it等在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了一種新型的非金屬碳青霉烯酶并命名為KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC)以來，僅僅幾年時間，KPC酶已在美國，特別是在美國的東北部各州蔓延，在局部造成暴發(fā)和流行，而且在腸桿菌的多個菌屬中都有報道，包括肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、沙門菌，主要為質粒介導；目前，產(chǎn)KPC的在菌株中國、以色列、希臘、哥倫比亞、巴西、英國、挪威及瑞典等國家均已發(fā)現(xiàn)。[Yigit H, Queenan AM, Anders on GJ, e t al.Novelcarbapenem-hydrolyzing beta-lactamase， KPC-1， from a carbapenem-resistantstrain of Klebsiella pneumoniae.Antimicrob Agents Chemother,2001,45 (4):1151-1161 ；Mendes RE，Bell JM, T urnidge JD, et al.Carbapenem-resistantisolates of Klebsiella pneumoniae in China and detection of a conjugativeplasmid (blaKPC_2plus qnrB4)and a blaIMP-4gene.Antimicrob Agents Chemother,2008,52 (2):798-799 ;Samuelsen，Naseer U，Tofteland S，et al.Emergence ofclonally related Klebsiella pneumoniae isolates of sequence type258producingplasmid-mediated KPC ca rbapenemase in Norway and Sweden.J Antimicrob Chemother,2009,63(4):654-658]。目前認為KPC型碳青霉烯酶基因是引起腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因，KPC型碳青霉烯酶是一種絲氨酸￠-內酰胺酶，幾乎能水解所有￠-內酰胺類抗生素，包括頭孢菌素類、青霉素類、碳青霉烯類，KPC酶基因位于可移動的質粒上，可以通過質粒或插入序列進行水平傳播。目前所報道的KPC酶分為I 4型，其中KPCl位于一個非接合性質粒上，KPC2、3都位于接合性質粒上。對目前所報道的相關文獻進行統(tǒng)計和分類發(fā)現(xiàn)，世界各地與中國地區(qū)均以KPC2型報道較多。Naas等報道在產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌中，KPC酶基因位于Tn4401轉座子上，左右各有一個插入序列，KPC編碼基因很可能依靠兩邊的插入序列隨著轉座子在不同的菌種中快速傳播。[Bratu S, Landam D, Haag R,et al.Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella pneum oniae in New YorkCity:a new threat to our antibiotic armamentarium.Arch Intern Med，2005，165:1430-1435 ；Smith Moland E,Hanson ND,Herrera VL,et al.Plasmid-mediated carbapenem—hydrolyzing旦-lactamase,KPC—2,in Klebsiella pneumoniae isolates.J AntimicrobChemother，2003，51(3):711-714;Naas T, Nordnann D,Vedel G，et al.Plasmid-mediatedcarbapenem—hydrolyzing旦-lactamase KPC in a Klebsiella pneumoniae isolate fromFrance.Antimicrob Agents Chemother,2005,49(10):4423-4424]。臨床微生物實驗室對產(chǎn)KPC酶菌株的檢測較為困難，主要原因包括:1)產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的菌株既可表現(xiàn)為對碳青霉烯類抗生素耐藥，也可表現(xiàn)為低敏感性；2)存在接種效應，會出現(xiàn)假敏現(xiàn)象；3)產(chǎn)KPC酶的菌株用ESBLs確證試驗檢測可能為陽性，容易造成誤判；4)產(chǎn)KPC酶的菌株往往同時產(chǎn)其它￠-內酰胺酶，產(chǎn)生多重耐藥，容易導致誤檢。現(xiàn)將目前臨床上檢測KPC酶肺炎克雷伯菌的主要方法分述如下:
1.通過液體培養(yǎng)基和紙片擴散法檢測抗菌素敏感性，這類方法由于￠-內酰胺類抗生素抗性的異質表達而容易產(chǎn)生假敏現(xiàn)象。2.瓊脂擴散法:在檢測KPC酶介導的耐藥性時，厄他培南比單獨的美羅培南、亞安培南敏感性更強，因此似乎厄他培南是檢測產(chǎn)KPC腸桿菌屬的最佳分子；然而，由于厄他培南抗性本身并不是KPC表達的標志物，因為其他因素如ESBL和AmpC也會引起厄他培南抗性，因此這類方法也有很大的局限性。3.分子診斷方法:通過分子診斷方法檢測產(chǎn)KPC菌株正逐漸成為金標準。其中，實時熒光PCR法則是公認的檢測細菌最準確、最快捷的方法。目前也有數(shù)種基于PCR末端和實時檢測技術被用于產(chǎn)KPC菌株的檢測，這些技術具有更高的特異性，但需要專業(yè)的技術人員和設備才能實施，檢測成本相對也較高。本試驗以blaKPC基因為靶序列，應用復合探針法建立了一種特異、靈敏、快速檢測產(chǎn)KPC酶細菌的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種實時熒光PCR法檢測blaKPC基因的試劑盒(下面簡稱試劑盒)，該試劑盒包括:(I)樣本處理液、PCR反應液A、PCR反應液B、陰性對照、強陽對照、臨界陽性對照各內標。(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。為了解決上述任務，本發(fā)明的具體技術路線為:(I)針對blaKPC基因保守序列設計的能夠與靶多核苷酸結合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探針。(2)寡核苷酸探針標記熒光發(fā)生基團，使所說的熒光發(fā)生基團與被擴增的靶多聚核苷酸間接結合。(3)適宜于PCR擴增的反應體系和熒光檢測體系。核酸擴增反應體系包括耐熱DNA聚合酶、2’ -脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結合的正向引物、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結合并且兩末端分別結合有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針、含有鎂離子和甲酰胺的緩沖液。(4)從待測樣本中提取DNA，加入前述的反應體系中，直接經(jīng)PCR擴增，從熒光擴增曲線判斷是否存在blaKPC基因。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，其中試劑盒的PCR反應液由2XPCR緩沖液、靶基因及內標正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、滅菌水、內標組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴增的正向和反向引物分別是5 ’ -CTGGGCAGTCGGAGACAAAA-3，和5’-AGACGGCCAACACAATAGGT-3’，內標正向和反向引物分別是5’ -ACCCTATTTTCATTCTTCGCC-3 和 5’ -GGTATCCAGATCCACAACCTT-3’ ；用于靶多核苷酸擴增和監(jiān)測體系的寡核苷酸探針是f: FAM-CAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCC-P, q:ACGACGGCATAGTCATTT-dabcyl,內標探針是 5’ -HEX-CGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACA-TAMRA-3’ ；PCR反應酶系包含Taq酶和UNG酶。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，陰性質控品為滅菌水；陽性質控品和內標質控品為通過體外重組將目的片段基因導入T載體，構建并提取重組質粒DNA，用TE液稀釋-20C保存。用于實際檢測中的質量控制。根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，對blaKPC基因進行檢測，該方法包括下列步驟:(I)用樣本處理液進行陰、陽性質控品和待測樣本的DNA提取。樣本處理液除本發(fā)明提及的方法外，還可以使用其它成熟的DNA提取方法和試劑盒。(2)將提取的DNA加入到含有PCR反應液和PCR反應酶系的PCR反應管中，進行PCR擴增，使用熒光定量PCR檢測儀進行檢測。本發(fā)明所述的試劑盒針對blaKPC基因檢測中的特殊性，對反應體系中引物探針濃度、Mg2+濃度、甲酰胺濃度，退火溫度等均進行優(yōu)化，結合熒光PCR技術，用于blaKPC基因的核酸檢測，并研制出用于blaKPC基因核酸檢測試劑盒，靈敏度可達到IO2拷貝/ml。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有下列優(yōu)點:(I)采用的復合探`針技術為國內唯一實時熒光PCR技術(專利號:ZL99125469.4，相關論文發(fā)表于Anal Biochem, 2002, 309:206-211)，是具有自主知識產(chǎn)權產(chǎn)品。特異性更
強，靈敏度更高；(2)全封閉反應，提取病毒DNA后，直接用于PCR檢測，避免了污染發(fā)生；(3)檢測速度快，整個過程不超過2小時；(4)操作簡單，可控性強，可進行大批量樣品檢測，有利于產(chǎn)業(yè)化；(5) PCR反應體系中加有內標，具有防止假陰性等優(yōu)點。


圖1顯示試劑盒檢測blaKPC基因核酸的條件設置。圖2顯示試劑盒檢測blaKPC基因核酸時不同濃度樣本的擴增曲線，十個陽性標本的擴增曲線為S形，均能夠判定為陽性。圖3顯示試劑盒十個陰性標本的擴增曲線，均不具S形特征，能夠判定為陰性。圖4顯示強陽性對照和臨界陽性對照的擴增曲線。圖示擴增曲線為S型曲線，說明檢測體系有效擴增了 blaKPC基因核酸。圖5顯示陰性質控品擴增曲線。圖示擴增曲線為較平直的折線，與熒光檢測閾值線沒有交點，且曲線不呈S型，說明檢測過程中沒有輪狀病毒核酸的污染。圖6顯示內標擴增曲線。圖示內標擴增曲線為S形，說明檢測體系擴增效率好。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。
blaKPC基因核酸檢測試劑盒檢測方法1.樣品的采集a)血液-采集5-10ml全血，置于EDTA抗凝的采集管中，密閉送檢。b)痰液-清水反復漱口后用力咳痰，從呼吸道深部咳出新鮮痰液于無菌容器密閉送檢。c)尿液-尿液常規(guī)檢驗需收集晨尿，女性采樣前應先用肥皂水或0.1 %高錳酸鉀溶液沖洗外棄陰部。去前后1/3留取中段尿液約5 IOml于無菌容器密閉送檢。d)膿液和創(chuàng)口分泌物-無菌生理鹽水擦洗病灶表面后用棉拭取病灶深部的膿液和分泌物于無菌容器密閉送檢。未破潰的膿腫宜消毒皮膚后，以無菌注射器抽取膿液于無菌容器密閉送檢。2.核酸提取2.1增菌液的處理a)配制樣本處理液:取內標加入到樣品處理液中，加入比例為1: 49，按需加入，振蕩混勻。b)取50 ill增菌液轉移至0.5ml離心管中，加入50 ill樣品處理液充分混勻，100°C保溫10分鐘，誤差不超過I分鐘；4°C放置10分鐘；c) 12，OOOrpm 離心 5 分鐘，備用。2.2.血液標本的處 理d)配制樣本處理液:取內標加入到樣品處理液中，加入比例為1: 49，按需加入，振蕩混勻。a)直接用淋巴細胞分離液分離沉淀白細胞；b)去上清，沉淀中加入50 Ul樣品處理液充分混勻，100°C保溫10分鐘，誤差不超過I分鐘；4°C放置10分鐘；c) 12，OOOrpm 離心 5 分鐘，備用。2.3.其他標本的處理a)配制樣本處理液:取內標加入到樣品處理液中，加入比例為1: 49，按需加入，振蕩混勻。b)向標本管中加入適量(Iml左右)無菌生理鹽水浸泡，然后劇烈振蕩攪拌使其充分混勻，自然沉淀除去粗大顆粒物質后，吸取上清轉移至1.5ml離心管中，12，OOOrpm離心10分鐘；c)去上清，沉淀中加入50 Ul樣品處理液充分混勻，100°C保溫10分鐘，誤差不超過I分鐘；4°C放置10分鐘；d) 12，OOOrpm 離心 5 分鐘，備用。3.PCR 檢測3.1配制體系a)取一支0.5ml離心管，按下列組成配制PCR反應液(N為反應管數(shù)):PCR 反應液 A27 ii I X (N+1)PCR 反應液 B0.4 ii I X (N+1)按27.4 iil/管分裝至PCR反應管中。
(注意:使用前確保PCR反應液充分溶解，PCR反應液B在使用前需離心以確保所有酶集中在底部)b)加樣將I處理過的樣本上清液分別加入PCR反應管中蓋緊管蓋，6000rpm離心Imin后放入PCR擴增儀。擴增程序設置Bio-Rad、ABI7300/7500PCR擴增儀的參數(shù)設置如下
權利要求
1.一種實時熒光PCR法檢測肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶(blaKPC)基因的試劑盒(下面簡稱試劑盒)，該試劑盒包括:(I)樣本處理液、PCR反應液A、PCR反應液B、陰性對照、強陽性對照、臨界陽性對照和內標；(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其中試劑盒的PCR反應液由2 XPCR緩沖液、靶基因和內標的正向引物、反向引物、寡核苷酸探針和滅菌水組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴增的正向和反向引物分別是5’ -CTGGGCAGTCGGAGACAAAA-3’ 和 5’ -AGACGGCCAACACAATAGGT-3’ 監(jiān)測體系的內標引物分別是 5， -ACCCTATTTTCATTCTTCGCC-3，和 5， -GGTATCCAGATCCACAACCTT-3，。
2.根據(jù)權利要求1的試劑盒，其特征還在于用于靶多核苷酸擴增的寡核苷酸探針是5’-FAM-CAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCC-P-3’和 5’ -ACGACGGCATAGTCATTT-dabcy1-3，，監(jiān)測體系的內標探針是 5’ -HEX-CGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACA-TAMRA-3’。
3.根據(jù)權利要求1的 試劑盒，其特征還在于PCR反應酶系包含Taq酶和UNG酶。
4.根據(jù)權利要求1的試劑盒，其特征還在于陰性質控品為滅菌水；陽性質控品和內標質控品為通過體外重組將目的片段基因導入PGEM-T載體，構建并提取重組質粒DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及blaKPC基因檢測試劑盒，特別是涉及一種利用復合探針技術實時熒光PCR技術檢測肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶(blaKPC)基因的試劑盒。該試劑盒通過對樣本中的blaKPC基因進行定性檢測，可廣泛應用于含blaKPC基因細菌感染的輔助診斷。
文檔編號C12R1/22GK103088144SQ20131003512
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月30日 優(yōu)先權日2013年1月30日
發(fā)明者王升啟, 陳蘇紅, 呂虹, 劉志紅, 孫曉彥, 劉琦琪 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所