專利名稱：一種制備光合細(xì)菌菌液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備細(xì)菌菌液的方法，尤其涉及一種制備光合細(xì)菌菌液的方法。
背景技術(shù)：
光合細(xì)菌(photosynthetic bacteria,簡(jiǎn)稱PSB),是地球上最古老的具有原始光能合成體系的原核生物，是在厭氧條件下進(jìn)行光合作用且不產(chǎn)生氧氣一類細(xì)菌的總稱，這是與綠色植物、藻類及其他光合作用生物不同之處。光合細(xì)菌廣泛分布于沼澤、池塘、湖泊、河流、水溝、海洋及土壤中， 是一種優(yōu)良的水產(chǎn)環(huán)境改良劑和飼料添加劑。目前光合細(xì)菌菌液制備方法都很繁瑣，培養(yǎng)基的成分復(fù)雜，大多是在特殊培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，而且是在一定的PH值和光照強(qiáng)度下進(jìn)行培養(yǎng)，現(xiàn)有制備方法的缺陷在于制備所用的培養(yǎng)基中往往需要添加某種或某些特殊物質(zhì)，如促酵劑、木瓜提取液、槲寄生提取物等，成分復(fù)雜，配制繁瑣，而且制備過程中多數(shù)需要特殊的光照。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:提供一種培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單的制備光合細(xì)菌菌液的方法。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是:一種制備光合細(xì)菌菌液的方法，其步驟是:(I)菌種的復(fù)蘇將裝有光合細(xì)菌菌種的凍存管進(jìn)行菌種快速溶解復(fù)蘇，溶解后的菌液成為復(fù)蘇菌液；(2)菌液劃線及靜置培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)上，用復(fù)蘇菌液在平板固體培養(yǎng)基上劃線，將劃線后的平板固體培養(yǎng)基在30°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 36小時(shí)長(zhǎng)出單菌落后，用接種環(huán)挑取平板固體培養(yǎng)基上的單菌落在斜面培養(yǎng)基上劃線，劃線后的斜面培養(yǎng)基在30°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 36小時(shí)菌落長(zhǎng)出；(3)菌落洗脫及培養(yǎng):菌落長(zhǎng)出后，用光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基將斜面培養(yǎng)基上的菌落洗脫下來成為菌落溶液，菌落溶液進(jìn)行初次培養(yǎng)即可得到初次培養(yǎng)菌液，初次培養(yǎng)菌液再進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)即可得到轉(zhuǎn)接培養(yǎng)菌液。在上述步驟(I)中，所述菌種快速溶解復(fù)蘇的方法是:將裝有光合細(xì)菌菌種的凍存管立即放置于溫度為38°C 40°C的水浴中復(fù)蘇并快速搖動(dòng)，直到凍存管內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止。在上述步驟⑵中，所述平板固體培養(yǎng)基配制方法為:將5克蛋白胨、I克酵母浸粉、0.1克磷酸高鐵、20克瓊脂、1000毫升煮沸海水加熱溶解，并用濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)到pH為7.6的培養(yǎng)基溶解液裝于錐形瓶中，然后將裝有培養(yǎng)基溶解液的錐形瓶置于高壓蒸汽滅菌器中，在溫度121 °C，壓力105kPa的條件下滅菌25分鐘，然后將裝有培養(yǎng)基溶解液的錐形瓶從高壓蒸汽滅菌器取出，錐形瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基溶解液在凝固之前倒入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿中冷卻凝固到室溫即可得到平板固體培養(yǎng)基。在上述步驟⑵中，所述斜面固體培養(yǎng)基配制方法為:將5克蛋白胨、I克酵母浸粉、0.1克磷酸高鐵、20克瓊脂、1000毫升煮沸海水加熱溶解，用濃度為lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)到pH為7.6成為培養(yǎng)基溶解液分裝于試管中，試管用棉塞封口，然后試管豎直置放入高壓蒸汽滅菌器中，在溫度121 °C，壓力105kPa的條件下滅菌25分鐘，然后試管從高壓蒸汽滅菌器取出，在培養(yǎng)基溶解液凝固之前，將試管傾斜成與水平面成45度角的斜面，培養(yǎng)基溶解液自然凝固到室溫即可得到斜面固體培養(yǎng)基。在上述步驟(3)中，所述初次培養(yǎng)是將菌落溶液混合均勻后裝入三角燒瓶中，牛皮紙包扎封口后，置于搖床上震蕩培養(yǎng)，搖床上震蕩培養(yǎng)的條件是溫度28°C 35°C，轉(zhuǎn)速50rpmo在上述步驟(3)中，所述轉(zhuǎn)接培養(yǎng)為搖床震蕩培養(yǎng)，搖床震蕩培養(yǎng)的條件是接種量 10%，溫度 28°C 35°C，轉(zhuǎn)速 50rpm。在上述步驟(3)中，所述轉(zhuǎn)接培養(yǎng)為在恒溫培養(yǎng)箱中的靜置培養(yǎng)，靜置培養(yǎng)的條件是接種量20%，溫度28°C 35°C，每天不定時(shí)搖晃3 6次。在上述步驟(3)中，所述光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基配制方法為:稱取酵母浸粉0.5克，稱取蛋白胨3克溶于I升煮沸海水，溶解后的溶液裝入三角燒瓶中，用牛皮紙包扎封口后，在高壓蒸汽滅菌器中，在溫度121 °C，壓力105kPa的條件下滅菌25分鐘，滅菌后自然冷卻到室溫即可得到光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基。

本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明固體培養(yǎng)基配制簡(jiǎn)單，僅需要酵母浸粉、蛋白胨、磷酸高鐵、瓊脂和煮沸海水配制，光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基僅需要酵母浸粉、蛋白胨和煮沸海水。培養(yǎng)所需設(shè)備簡(jiǎn)單，僅需要一個(gè)可溫控的搖床培養(yǎng)箱或恒溫培養(yǎng)箱即可。制備出來的光合細(xì)菌菌液濃度高，質(zhì)量好。因此，本發(fā)明方法具有培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單，菌液濃度高，質(zhì)量好的特點(diǎn)。


圖1、本發(fā)明實(shí)施例平板固體培養(yǎng)基劃線分區(qū)示意圖。圖2、本發(fā)明實(shí)施例接種10%嗜硫小紅卵菌培養(yǎng)液時(shí)的照片。圖3、本發(fā)明實(shí)施例接種10%嗜硫小紅卵菌培養(yǎng)液培養(yǎng)到第4天時(shí)的照片。
具體實(shí)施例方式一、本發(fā)明實(shí)施例固體培養(yǎng)基的配置本發(fā)明實(shí)施例固體培養(yǎng)基采用2216E固體培養(yǎng)基，2216E固體培養(yǎng)基簡(jiǎn)稱固體培養(yǎng)基，是一種培養(yǎng)海洋細(xì)菌的專用培養(yǎng)基，用于海洋細(xì)菌的劃線培養(yǎng)或涂布培養(yǎng)。本發(fā)明實(shí)施例固體培養(yǎng)基分為平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基，用培養(yǎng)皿制備的固體培養(yǎng)基，叫做平板培養(yǎng)基；用試管制備的固體培養(yǎng)基叫斜面培養(yǎng)基。本發(fā)明實(shí)施例固體培養(yǎng)基的成分和配制方法如下:制備固體培養(yǎng)基的材料準(zhǔn)備:用電子天平稱取蛋白胨5克，酵母浸粉I克，磷酸高鐵0.1克，瓊脂20克，以及量取煮沸海水I升。平板培養(yǎng)基的制備:將上述稱取量的蛋白胨、酵母浸粉、磷酸高鐵、瓊脂，以及量取的煮沸海水加熱溶解，本實(shí)施例用2升的錐形瓶混合，電爐加熱溶解，煮沸5分鐘，以將內(nèi)容物完全溶解為準(zhǔn)。再用濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液將溶解后的液體調(diào)節(jié)到pH為7.6即得到培養(yǎng)基溶解液，然后將該培養(yǎng)基溶解液分裝于多個(gè)錐形瓶，本實(shí)施例每個(gè)250毫升的錐形瓶中分裝100毫升的培養(yǎng)基溶解液，共需要10個(gè)錐形瓶。裝有培養(yǎng)基溶解液的錐形瓶置于高壓蒸汽滅菌器中，在溫度121 °C，壓力105kPa的條件下滅菌25分鐘后，將滅菌后的錐形瓶從高壓蒸汽滅菌器取出，位于錐形瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基溶解液在凝固之前，將該培養(yǎng)基溶解液分別倒入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿，滅菌的培養(yǎng)皿于高壓蒸汽滅菌器在溫度121°C，壓力105kPa的條件下滅菌25分鐘。本實(shí)施例培養(yǎng)皿的直徑為9厘米，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入15毫升經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基溶解液，待培養(yǎng)基溶解液冷卻到室溫凝固后置4°C冰箱內(nèi)冷藏保存?zhèn)溆?。斜面培養(yǎng)基的制備:用電子天平稱取蛋白胨5克，酵母浸粉I克，磷酸高鐵0.1克，瓊脂20克，以及量取煮沸海水I升加熱溶解，用濃度為lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)到pH為
7.6即得到培養(yǎng)基溶解液。培養(yǎng)基溶解液分裝于試管中，本實(shí)施例需50個(gè)試管，每個(gè)試管裝20毫升培養(yǎng)基溶解液，試管用棉塞封口，豎直放入高壓蒸汽滅菌器中，在溫度121°C，壓力為105kPa的條件下滅菌25分鐘，然后將試管從高壓蒸汽滅菌器取出，培養(yǎng)基溶解液在凝固之前，將試管傾斜成與桌面(水平面)成45度角的斜面，讓試管內(nèi)的培養(yǎng)基溶解液自然凝固到室溫后置4°C冰箱內(nèi)冷藏保存?zhèn)溆?。若配?216E液體培養(yǎng)基，則不需要加瓊脂，其成分，滅菌和制作方法與上述相同。二、本發(fā)明實(shí)施例光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基的配置本發(fā)明實(shí)施例光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基配制方法:用電子天平稱取酵母浸粉0.5克，蛋白胨3克溶于I升煮沸海水中，溶解`后的培養(yǎng)溶液裝入規(guī)格為2升的三角燒瓶中，用牛皮紙包扎封口三角燒瓶后，封口后的三角燒瓶在高壓蒸汽滅菌器中在溫度121°C，壓力為105kPa的條件下滅菌25分鐘后自然冷卻到室溫備用。三、本發(fā)明實(shí)施例具體操作方法本發(fā)明實(shí)施例具體操作方法以光合細(xì)菌中的嗜硫小紅卵菌菌種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包括實(shí)驗(yàn)室保存的嗜硫小紅卵菌菌種的復(fù)蘇、初次培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。嗜硫小紅卵菌(Rhodovulumsulfidophilus)屬于細(xì)菌類，α變形菌綱，紅細(xì)菌目，紅細(xì)菌科,小紅卵菌屬(RhodovulumHiraishi and Ueda),細(xì)胞卵圓形至桿形,0.5 0.9 μ mX 0.9 2.0 μ m。單極生鞭毛運(yùn)動(dòng)或不運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞行二分分裂，革蘭氏染色陰性。兼性厭氧光養(yǎng)菌，即光照厭氧和黑暗好氧條件下均能很好生長(zhǎng)。最佳生長(zhǎng)方式是利用各種有機(jī)化合物進(jìn)行光合異養(yǎng)生長(zhǎng)。在硫化氫和硫代硫酸鈉存在時(shí)，可進(jìn)行光自養(yǎng)或光異養(yǎng)生長(zhǎng)。嗜硫小紅卵菌是小紅卵菌屬的一個(gè)模式種。嗜硫小紅卵菌作為光合細(xì)菌的一種，廣泛應(yīng)用于改善水質(zhì)，減少病原微生物和不良藻類，以及作為魚蝦的餌料添加劑。1、菌種的復(fù)蘇:將在_80°C保存的裝有嗜硫小紅卵菌的凍存管取出，立即放置于38°C 40°C水浴中快速?gòu)?fù)蘇并快速搖動(dòng)，本實(shí)施例用手搖動(dòng)，即手握凍存管抖動(dòng)手腕，直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，需要50秒 100秒。在超凈工作臺(tái)上打開凍存管，超凈工作臺(tái)需要提前用紫外燈照射15分鐘消毒。用接種環(huán)沾取少取嗜硫小紅卵菌菌液，即將接種環(huán)的環(huán)體伸入菌液中沾取菌液，沾取的體積約為5微升，在平板固體培養(yǎng)基上劃線，劃線時(shí)，如圖1所示，將一個(gè)平板固體培養(yǎng)基分成四個(gè)小區(qū)進(jìn)行劃線，第一小區(qū)作為A區(qū)，用作待分離菌的菌源區(qū)；第二小區(qū)和第三小區(qū)分別作為B區(qū)和C區(qū)，是逐級(jí)稀釋的過渡區(qū)，第四小區(qū)作為D區(qū)則是關(guān)鍵區(qū)，使D區(qū)出現(xiàn)大量的單菌落以供挑選純種用。首先劃A區(qū):將平板固體培養(yǎng)基置于酒精燈旁(距離酒精燈10厘米)，左手持培養(yǎng)皿，左手手掌托住皿底，用拇指和食指將皿蓋掀開，與皿底呈45度角并且開口朝向酒精燈，右手拿已沾取嗜硫小紅卵菌菌液的接種環(huán)先在A區(qū)劃3 4條連續(xù)的平行線，線條多少應(yīng)依挑菌量的多少而定，若挑菌量多可以多劃幾條平行線。本實(shí)施例線長(zhǎng)I 3厘米，上下相鄰平行線間距I厘米。在A區(qū)劃線后應(yīng)立即燒掉接種環(huán)上的殘菌，以免因嗜硫小紅卵菌過多而影響后面各區(qū)的分離效果。然后劃其它區(qū):將燒去殘菌后的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基邊 緣冷卻I分鐘左右，溫度冷卻到不燙手即可，并使平板培養(yǎng)基B區(qū)轉(zhuǎn)到靠近酒精燈的一面，接種環(huán)通過A區(qū)(菌源區(qū))將嗜硫小紅卵菌帶到B區(qū)，隨即劃數(shù)條致密的平行線，本實(shí)施例B區(qū)線長(zhǎng)I 3厘米，上下相鄰平行線間距I厘米。再?gòu)腂區(qū)作C區(qū)的劃線，即從B區(qū)將嗜硫小紅卵菌帶到C區(qū)，從B區(qū)將嗜硫小紅卵菌帶到C區(qū)前要燒掉接種環(huán)上的殘菌。最后經(jīng)C區(qū)作D區(qū)的劃線，即從C區(qū)將嗜硫小紅卵菌帶到D區(qū)，在D區(qū)劃線，從C區(qū)將嗜硫小紅卵菌帶到D區(qū)前也要燒掉接種環(huán)上的殘菌，劃D區(qū)時(shí)切勿重新接觸A區(qū)、B區(qū)，以免該兩區(qū)中濃密的菌液帶到D區(qū)，影響單菌落的形成。燒去接種環(huán)上的殘菌，倒置培養(yǎng)皿，倒置培養(yǎng)皿比正放培養(yǎng)皿更加不容易污染雜菌，因?yàn)榭諝庵幸灿须s菌，另外皿底和皿蓋雖然消毒殺菌，但在操作過程中，接觸的外表仍然可能污染，倒置可以使雜菌盡可能少接觸培養(yǎng)基。倒置培養(yǎng)皿也可以防止培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，使培養(yǎng)基保持濕潤(rùn)。倒置也可以防止水分冷凝后滴到培養(yǎng)基上，導(dǎo)致菌落蔓延，無法計(jì)數(shù)。劃線后的平板固體培養(yǎng)基在30°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 36小時(shí)。平板固體培養(yǎng)基D區(qū)長(zhǎng)出單菌落后，用接種環(huán)挑取平板固體培養(yǎng)基D區(qū)上的單菌落，在斜面培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，本實(shí)施例在斜面培養(yǎng)基上呈“之”字形劃線，劃線后的斜面培養(yǎng)基在30°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 36小時(shí)后菌落長(zhǎng)出。菌落長(zhǎng)出后，用光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基將斜面固體培養(yǎng)基上的菌落洗脫下來，洗脫步驟如下:在超凈工作臺(tái)中，用微量移液器將Iml光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基放入培養(yǎng)有嗜硫小紅卵菌菌落的斜面固體培養(yǎng)基的試管中，在震蕩器上劇烈震蕩(溫度控制在15 30°C )，直到斜面固體培養(yǎng)基上的菌落全部洗脫下來成為菌液。斜面固體培養(yǎng)基長(zhǎng)出的菌落是固體培養(yǎng)基上挑出的單菌落長(zhǎng)出來的，是一個(gè)擴(kuò)大培養(yǎng)的步驟。本實(shí)施例的嗜硫小紅卵菌是從海水中分離純化鑒定而來的，即從山東牟平海區(qū)取回海水樣本100微升，在2216E固體平板培養(yǎng)基上涂布均勻，倒置培養(yǎng)皿置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 3天觀察，用接種環(huán)挑取紫色菌落，再在2216E固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，3 5天后可見平板培養(yǎng)基上有散的紫色菌落生長(zhǎng)，挑取單個(gè)的紫色菌落經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定即為嗜硫小紅卵菌。2、初次培養(yǎng)Iml復(fù)蘇洗脫下來的菌液和IOOml光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基混合均勻后裝入三角燒瓶中，牛皮紙包扎封口后，置于搖床上震蕩培養(yǎng)，搖床上震蕩培養(yǎng)可使細(xì)菌懸浮，繁殖速度快。搖床上震蕩培養(yǎng)的條件是溫度28°C 35°C，轉(zhuǎn)速50rpm，3天 4天即可得到菌液濃度達(dá)到約200億個(gè)/毫升(2 X IOltVml)的初次培養(yǎng)菌液。本發(fā)明實(shí)施例菌液濃度測(cè)定方法:將上述從斜面固體培養(yǎng)基洗脫下來的菌液用無菌海水以10倍濃度依次稀釋，即，IOOuL菌液加900uL無菌海水，菌液濃度稀釋到前次菌液濃度的1/10，如此稀釋10次，從而稀釋到原有濃度的10_1(1倍，所以最后得到稀釋后菌液濃度為之前的10,倍濃度，最后用IOOuL的微量移液器吸取IOOuL稀釋了 10_1(1倍的菌液在平板固體培養(yǎng)基上用涂布棒涂布，涂布在超凈工作臺(tái)內(nèi)操作，靠近酒精燈的火焰(間距10厘米)，涂布前先將涂布棒在濃度為75%酒精浸泡30秒消毒，然后于酒精燈火焰上來回?zé)?，稍冷卻后進(jìn)行涂布，將菌液涂布均勻，涂布時(shí)皿蓋稍開即可，不要將皿蓋全拿下來，即掀開皿蓋一端，使涂布棒伸進(jìn)培養(yǎng)基涂布，涂布好的培養(yǎng)皿蓋好皿蓋后倒置放于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落數(shù)，再乘以101(1，即為Iml原菌液里的濃度。菌落直徑I 3mm,數(shù)量為2 10個(gè)。3、轉(zhuǎn)接培養(yǎng)以10 %的接種量將初次培養(yǎng)菌液和光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基混合，例如要培養(yǎng)I升菌液，即需要IOOml初次培養(yǎng)好的初次培養(yǎng)菌液和900ml的光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基用三角燒瓶混合均勻后裝入規(guī)格為2升的三角燒瓶中，置于搖床(28°C 35°C，轉(zhuǎn)速50rpm)，本實(shí)施例搖床采用全溫培養(yǎng)搖床，3天 4天即可得到濃度達(dá)200億個(gè)/毫升的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)菌液。轉(zhuǎn)接培養(yǎng)也可在恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，接種量20% (如200ml初次培養(yǎng)好的初次培養(yǎng)菌液和800ml的光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基混合均勻)，溫度28°C 35°C，每天不定時(shí)搖晃幾次，本實(shí)施例每天搖晃5 6次,或間隔3 4小時(shí)搖一次,5天 6天也可得到濃度達(dá)200億個(gè)/毫升的嗜硫小紅卵菌菌液。1、本實(shí)施例配置固體培養(yǎng)基和光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基用到如下具體的儀器和試劑:電子天平:亞太計(jì)量?jī)x器有限公司生產(chǎn)，型號(hào)DS-200。高壓蒸汽滅菌器:山東新華安得醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)，YXQG02型手提式電熱壓力蒸汽消毒器。玻璃儀器:直徑為9厘米的培養(yǎng)皿；直徑(外徑)為1.8cm,長(zhǎng)度18cm的玻璃試管；規(guī)格分別為IL和2L的三角燒瓶；規(guī)格分別為500ml和IL的燒杯均購(gòu)自四川蜀牛玻璃儀器公司。酵母浸粉:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，250g裝，BR生化試劑(Biological reagent生物染色劑)，微黃或類白色粉末。蛋白胨:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，250g裝，BR生化試劑(Biological reagent生物染色劑)，白色至淺黃色粉末。磷酸高鐵:天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)，250g裝，灰白或淡粉紅色粉末。瓊脂:北京康倍斯(chembase)科技有限公司生產(chǎn),500g裝,淡黃色粉末。氫氧化鈉:天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，分析純，500g裝，白色粒狀。煮沸海水:用規(guī)格為2L的三角燒瓶取IL海水煮沸5分鐘冷卻到室溫即為煮沸海水。2、 本發(fā)明實(shí)施例所用到的其它儀器和試劑:
接種環(huán):北京泰怡達(dá)生物科技有限公司生產(chǎn)，桿長(zhǎng)50毫米，桿的直徑為0.5毫米。微量移液器:德國(guó)艾本德(Eppendorf)公司生產(chǎn)，量程為100 μ L和lmL。震蕩器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)，型號(hào)V0R76X-5。恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科技儀器有限公司生產(chǎn)，型號(hào)DHP-9162。超凈工作臺(tái):蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)，型號(hào)AIR TECH。電熱恒溫水箱:上海一恒科技儀器有限公司生產(chǎn)，型號(hào)DKB-600B。全溫培養(yǎng)搖床，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司生產(chǎn)，型號(hào)QYC-200。無菌海水:將煮沸海水在高壓蒸汽滅菌器中在溫度121°C，壓力105kPa條件下滅菌25min，滅菌后，冷卻到室溫即為無菌海水。

按照上述的操作步驟，以10%的接種量將培養(yǎng)的嗜硫小紅卵菌菌液和光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基在三角燒瓶中混合均勻，見圖2，然后置于搖床(28°C 35°C，轉(zhuǎn)速50rpm)培養(yǎng)，4天即可得到200億個(gè)/毫升的高濃度菌液，見圖3。經(jīng)試驗(yàn)，本發(fā)明方法也適用于光合細(xì)菌其他種屬如深紅紅螺菌，球形紅色假單孢菌，莢膜紅色假單孢菌的培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種制備光合細(xì)菌菌液的方法，其步驟是: (1)菌種的復(fù)蘇 將裝有光合細(xì)菌菌種的凍存管進(jìn)行菌種快速溶解復(fù)蘇，溶解后的菌液成為復(fù)蘇菌液； (2)菌液劃線及靜置培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)上，用復(fù)蘇菌液在平板固體培養(yǎng)基上劃線，將劃線后的平板固體培養(yǎng)基在30°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 36小時(shí)長(zhǎng)出單菌落后，用接種環(huán)挑取平板固體培養(yǎng)基上的單菌落在斜面培養(yǎng)基上劃線，劃線后的斜面培養(yǎng)基在30°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 36小時(shí)菌落長(zhǎng)出； (3)菌落洗脫及培養(yǎng): 菌落長(zhǎng)出后，用光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基將斜面培養(yǎng)基上的菌落洗脫下來成為菌落溶液，菌落溶液進(jìn)行初次培養(yǎng)即可得到初次培養(yǎng)菌液，初次培養(yǎng)菌液再進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)即可得到轉(zhuǎn)接培養(yǎng)菌液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種制備光合細(xì)菌菌液的方法，其特征在于:在步驟(I)中，所述菌種快速溶解復(fù)蘇 的方法是:將裝有光合細(xì)菌菌種的凍存管立即放置于溫度為38°C 40 V的水浴中復(fù)蘇并快速搖動(dòng)，直到凍存管內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種制備光合細(xì)菌菌液的方法，其特征在于:在步驟(2)中，所述平板固體培養(yǎng)基配制方法為:將5克蛋白胨、I克酵母浸粉、0.1克磷酸高鐵、20克瓊脂、1000毫升煮沸海水加熱溶解，并用濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)到pH為7.6的培養(yǎng)基溶解液裝于錐形瓶中，然后將裝有培養(yǎng)基溶解液的錐形瓶置于高壓蒸汽滅菌器中，在溫度121°C，壓力105kPa的條件下滅菌25分鐘，然后將裝有培養(yǎng)基溶解液的錐形瓶從高壓蒸汽滅菌器取出，錐形瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基溶解液在凝固之前倒入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿中冷卻凝固到室溫即可得到平板固體培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種制備光合細(xì)菌菌液的方法，其特征在于:在步驟(2)中，所述斜面固體培養(yǎng)基配制方法為:將5克蛋白胨、I克酵母浸粉、0.1克磷酸高鐵、20克瓊脂、1000毫升煮沸海水加熱溶解，用濃度為lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)到pH為7.6成為培養(yǎng)基溶解液分裝于試管中，試管用棉塞封口，然后試管豎直置放入高壓蒸汽滅菌器中，在溫度121°C，壓力105kPa的條件下滅菌25分鐘，然后試管從高壓蒸汽滅菌器取出，在培養(yǎng)基溶解液凝固之前，將試管傾斜成與水平面成45度角的斜面，培養(yǎng)基溶解液自然凝固到室溫即可得到斜面固體培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種制備光合細(xì)菌菌液的方法，其特征在于:在步驟(3)中，所述初次培養(yǎng)是將菌落溶液混合均勻后裝入三角燒瓶中，牛皮紙包扎封口后，置于搖床上震蕩培養(yǎng)，搖床上震蕩培養(yǎng)的條件是溫度28°C 35°C，轉(zhuǎn)速50rpm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種制備光合細(xì)菌菌液的方法，其特征在于:在步驟(3)中，所述轉(zhuǎn)接培養(yǎng)為搖床震蕩培養(yǎng)，搖床震蕩培養(yǎng)的條件是接種量10%，溫度28°C 35°C，轉(zhuǎn)速50rpmo
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種制備光合細(xì)菌菌液的方法，其特征在于:在步驟(3)中，所述轉(zhuǎn)接培養(yǎng)為在恒溫培養(yǎng)箱中的靜置培養(yǎng)，靜置培養(yǎng)的條件是接種量20%，溫度28°C 35°C，每天不定時(shí)搖晃3 6次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種制備光合細(xì)菌菌液的方法，其特征在于:在步驟(3)中，所述光合細(xì)菌菌液培養(yǎng)基配制方法為:稱取酵母浸粉0.5克，稱取蛋白胨3克溶于I升煮沸海水，溶解后的溶液裝入三角燒瓶中，用牛皮紙包扎封口后，在高壓蒸汽滅菌器中，在溫度121°C，壓力105kPa的條件下滅菌25分鐘，滅菌后自然冷卻到室溫即可得到光合細(xì)菌菌液培養(yǎng) 基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備光合細(xì)菌菌液的方法，其步驟是(1)將裝有光合細(xì)菌菌種的凍存管進(jìn)行溶解復(fù)蘇，溶解后的菌液成為復(fù)蘇菌液；(2)在超凈工作臺(tái)上，用復(fù)蘇菌液在平板固體培養(yǎng)基上劃線，將劃線后的平板固體培養(yǎng)基在30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24～36小時(shí)長(zhǎng)出單菌落后，用接種環(huán)挑取平板固體培養(yǎng)基上的單菌落在斜面培養(yǎng)基上劃線，劃線后的斜面培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24～36小時(shí)菌落長(zhǎng)出；(3)菌落長(zhǎng)出后，用光合細(xì)菌液培養(yǎng)基將斜面培養(yǎng)基上的菌落洗脫下來成為菌落溶液，菌落溶液進(jìn)行初次培養(yǎng)得到初次培養(yǎng)菌液，初次培養(yǎng)菌液進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)接培養(yǎng)菌液。本發(fā)明具有培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單，菌液濃度高，質(zhì)量好的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103146597SQ201310036820
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月7日
發(fā)明者王娜, 崔翠菊, 劉延嶺, 張立楠, 李曉捷, 金光, 羅世菊, 張壯志, 王青巖, 孫娟 申請(qǐng)人:山東東方海洋科技股份有限公司