專利名稱：一種利用ssr分子標(biāo)記對(duì)五節(jié)芒與荻雜交種進(jìn)行快速鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物雜交種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種芒屬植物雜交種分子鑒定方法。
背景技術(shù)：
芒屬植物(Miscanthus)為禾本科、多年生高大草本C4植物,作為最具發(fā)展?jié)摿Φ哪茉粗参锶找媸艿疥P(guān)注。中國(guó)是芒屬植物的起源與分布中心，具有豐富的野生資源、生態(tài)類型多。芒屬植物適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、凈能產(chǎn)出高、生物質(zhì)品質(zhì)好、轉(zhuǎn)化利用途徑廣、生態(tài)價(jià)值好等特點(diǎn)，適合在邊際土地上種植利用，是一種兼具生態(tài)效益與經(jīng)濟(jì)效益的草本能源植物。芒屬植物中的荻(Miscanthus Sacchariflorus)在我國(guó)東北、西北、華北及華東均有分布，抗逆性強(qiáng)，自然衰老，在耐鹽堿方面表現(xiàn)顯著，可作為改良鹽堿的先鋒植物，但生物質(zhì)產(chǎn)量較低。五節(jié)芒(Miscanthus Floridulus)分布于長(zhǎng)江中下游及以南區(qū)域,具有植株高大，生物質(zhì)產(chǎn)量高，其莖及葉可為造紙?jiān)?，葉幼嫩時(shí)可做飼料，但抗旱、耐寒能力較弱，且不能自然衰老等特點(diǎn)。作為能源植物必須具備高生物質(zhì)產(chǎn)量、高環(huán)境適應(yīng)能力、低生產(chǎn)成本和產(chǎn)品的低含水量等特性，因此荻和五節(jié)芒單獨(dú)作為能源植物的利用價(jià)值不大。開展五節(jié)芒和荻作的人工雜交研究，是利用荻和五節(jié)芒的各自優(yōu)良性狀，培育出抗逆性強(qiáng)、高產(chǎn)、廣適應(yīng)性等綜合性狀優(yōu)良新品種的最佳途徑。在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)芒屬植物的自交結(jié)實(shí)率在不同基因型芒屬植物中存在較大的差異，因此有可能在雜交種后代中存在自交苗，必須要準(zhǔn)確的鑒定真假雜交種植株，避免在遺傳分析和育種選擇中出現(xiàn) 誤差。形態(tài)學(xué)性狀是雜交種鑒定的基礎(chǔ)，尤其一些父本所特有的性狀在雜種中的表現(xiàn)，是鑒別雜交種的重要形態(tài)學(xué)標(biāo)記，但其鑒定耗時(shí)長(zhǎng)，占用大量土地資源，形態(tài)學(xué)性狀受環(huán)境影響等，不利于雜交種的快速鑒定。本發(fā)明方法利用SSR分子標(biāo)記對(duì)芒屬植物五節(jié)芒與荻人工雜 交種真實(shí)性進(jìn)行鑒定，具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)，為開展芒屬植物分子育種奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效快速的五節(jié)芒與荻雜交種的鑒定方法，該方法操作簡(jiǎn)便、具有快速、重復(fù)性好、不受環(huán)境因素影響、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，非常適合五節(jié)芒與荻雜交種群體的早期鑒定。本發(fā)明的目的是通過下述方式實(shí)現(xiàn)的:一種利用SSR分子標(biāo)記對(duì)五節(jié)芒與荻雜交種進(jìn)行快速鑒定的方法，包括以下步驟:I)基因組DNA的提取待測(cè)的五節(jié)芒與荻雜交種植株提取DNA ；2) SSR-PCR 反應(yīng)
加入HAU-170號(hào)引物進(jìn)行SSR-PCR，引物序列如下:正向引物序列:5’-TGCATGGTTGCTTCAGCAGT-3’，反向引物序列:5’-ACAGAA ACCAATGCATGTGATGAG-3’ ；3)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；4)銀染和條帶分析。步驟I)的具體過程為:待測(cè)的五節(jié)芒與荻雜交種植株長(zhǎng)到4-5葉時(shí)，采用CTAB法提取葉片DNA，所提取的DNA溶解于pH8.0的TE溶液中，4°C保存?zhèn)溆?。步驟2)的SSR-PCR反應(yīng)體系為:PCR 反應(yīng)體積為 15 μ L，其中包括:10XBufferl.5 μ L, 25mmo1.171 的 MgCl2L 5 μ L，IOmmol.Γ1 的 dNTPs0.3 μ L，5U.μ Γ1 的 Taq 聚合酶 0.1 μ L, 20_25ng.μ Γ1 的 DNA 模板2yL,2ymol.L-1的引物1.5 μ L，超純水補(bǔ)足；PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán):94°C變性30s，54°C退火溫度下復(fù)性30s，72°C延伸lmin，最后72°C延伸7min后4°C保存。步驟3)的具體過程為:PCR產(chǎn)物在非變 性聚丙烯酰胺凝膠電泳上檢測(cè)，用IXTBE作為電泳緩沖液；在SSR-PCR產(chǎn)物體系中加入2 μ L的6X上樣緩沖液混合，加入2 μ L至點(diǎn)樣孔中，電泳2小時(shí)。步驟4)的具體過程為:固定:將電泳完的凝膠放入400mL的固定液中固定5min，然后用蒸餾水清洗一次；銀染:在400mL的銀染液中銀染12min，然后用蒸餾水清洗一次；清底:在400mL的硫代硫酸鈉溶液里面洗30s，變黃倒掉，用蒸餾水清洗一次；顯影:然后將凝膠放入400mL的顯影液中6 lOmin，待顯出條帶后再用蒸餾水清洗一次；終止:用400mL的終止液終止顯影，在膠片燈下觀察拍照；分析:在五節(jié)芒與荻雜交種植株中包含一個(gè)大小IOObp左右的特異性條帶和一個(gè)大小為123bp左右的特異性條帶；確定為真實(shí)雜交種。所述的五節(jié)芒與荻雜交種是利用湖南邵陽(yáng)五節(jié)芒和陜西鳳縣的荻為親本培育出的雜交群體。本發(fā)明提出的對(duì)五節(jié)芒與荻雜交種分子鑒定方法，利用特異性SSR引物，使得五節(jié)芒與荻的雜交種在苗期就可以進(jìn)行快速鑒定。在特異性引物的篩選過程中，提取了全國(guó)不同地區(qū)五節(jié)芒和荻的DNA樣本，材料分布范圍廣，驗(yàn)證了 HAU-170引物的廣適用性。在五節(jié)芒和荻的雜交群體鑒定中，HAU-170號(hào)引物在雜交后代中表現(xiàn)出良好的互補(bǔ)性，且鑒定出的真雜交種植株在田間也被鑒定為真雜種。本發(fā)明為五節(jié)芒與荻的雜交種群體提供了一種操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好、不受環(huán)境因素影響的鑒定方法。


圖1:五節(jié)芒與荻的HAU-170引物的標(biāo)記結(jié)果；
圖2:利用HAU-170號(hào)引物進(jìn)行雜交種群體鑒定的標(biāo)記結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:引物篩選I)基因組DNA的提取選取各個(gè)地區(qū)的五節(jié)芒與荻及已獲得的五節(jié)芒與荻人工雜交種植株(實(shí)驗(yàn)材料保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物資源圃)，待植株長(zhǎng)到4-5葉時(shí)，選取幼嫩無(wú)病斑的葉片，用蒸餾水沖洗2 3遍，再采用常規(guī)CTAB法提取基因組DNA，溶解DNA的TE溶液pH值為8.0 ;4°C保存?zhèn)溆谩４蚪MDNA完全溶解后，DNA濃度用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)來確定。2 )基于PCR的SSR分子標(biāo)記分析
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PCR 反應(yīng)體積為 15ii L，其中包括:10 X Bufferl.5 ii L，MgCl2 (25mmol.171)1.5u L,dNTPsdOmmol -L—1) 0.3 y L，Taq 聚合酶(5U u L-1) 0.1 y L，DNA 模板(20_25ng.u L-1) 2u L,引物(2 u mo1-LlLSiiL,超純水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán)(94 °C變性30s，54°C退火溫度下復(fù)性30s，72°C延伸lmin)，最后72°C延伸7min后4°C保存。反應(yīng)在 Biometra Tgradient PCR 儀中進(jìn)行。引物序列如下:正向引物序列:5’-TGCATGGITGCTTCAGCAGT-3’，反向引物序列:5’ -ACAGAA ACCAATGCATGTGATGAG-3'；3)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠(配方見表I)電泳上檢測(cè)，用I X TBE作為電泳緩沖液。在SSR-PCR產(chǎn)物體系中加入2 ii L的6X上樣緩沖液(0.25% (W/V)溴酚藍(lán)，0.25%(W/V)二甲苯青FF，40% (W/V)蔗糖水溶液)混合，用IOii L的tip頭加入2 y L至點(diǎn)樣孔中，電泳恒定電壓為200V，電泳2小時(shí)后，硝酸銀染色。表I非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳配方
權(quán)利要求
1.一種利用SSR分子標(biāo)記對(duì)五節(jié)芒與荻雜交種進(jìn)行快速鑒定的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)基因組DNA的提取 待測(cè)的五節(jié)芒與荻雜交種植株提取DNA ； 2)SSR-PCR 反應(yīng) 加入HAU-170號(hào)引物進(jìn)行SSR-PCR，引物序列如下: 正向引物序列:5’ -TGCATGGITGCTTCAGCAGT-3’， 反向引物序列:5’-ACAGAA ACCAATGCATGTGATGAG-3’ ； 3)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳； 4)銀染和條帶分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟I)的具體過程為: 待測(cè)的五節(jié)芒與荻雜交種植株長(zhǎng)到4-5葉時(shí)，采用CTAB法提取葉片DNA，所提取的DNA溶解于pH8.0的TE溶液中，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟2)的SSR-PCR反應(yīng)體系為: PCR 反應(yīng)體積為 15ii L，其中包括=IOXBufferL 5u L,25mmol I71 的 MgCl2L 5 u L,IOmmol L-1 的 dNTPs0.3u L,5U u L-1 的 Taq 聚合酶 0.1 y L, 20_25ng.u L-1 的 DNA 模板2uL,2umol L-1的引物1.5 yL，超純水補(bǔ)足；PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán):94°C變性30s，54°C退火溫度下復(fù)性30s，72°C延伸lmin，最后72°C延伸7min后4°C保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟3)的具體過程為: PCR產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上檢測(cè)，用I X TBE作為電泳緩沖液；在SSR-PCR產(chǎn)物體系中加入2 ii L的6X上樣緩沖液混合，加入2u L至點(diǎn)樣孔中，電泳2小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟4)的具體過程為: 固定:將電泳完的凝膠放入400mL的固定液中固定5min,然后用蒸懼水清洗一次； 銀染:在400mL的銀染液中銀染12min，然后用蒸餾水清洗一次； 清底:在400mL的硫代硫酸鈉溶液里面洗30s，變黃倒掉，用蒸餾水清洗一次； 顯影:然后將凝膠放入400mL的顯影液中6 lOmin，待顯出條帶后再用蒸餾水清洗一次； 終止:用400mL的終止液終止顯影，在膠片燈下觀察拍照； 分析:在五節(jié)芒與荻雜交種植株中包含一個(gè)大小IOObp左右的特異性條帶和一個(gè)大小為123bp左右的特異性條帶；確定為真實(shí)雜交種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 所述的五節(jié)芒與荻雜交種是利用湖南邵陽(yáng)五節(jié)芒和陜西鳳縣的荻為親本培育出的雜交群體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用SSR分子標(biāo)記對(duì)草本能源植物五節(jié)芒與荻的種間遠(yuǎn)緣雜交種進(jìn)行快速鑒定的方法。選取植株的幼嫩葉片，蒸餾水清洗后采用常規(guī)CTAB法提取基因組DNA，基于PCR的SSR分子標(biāo)記分析各個(gè)地區(qū)五節(jié)芒和荻分別具有的特異性條帶，篩選出1對(duì)合適的SSR標(biāo)記，該標(biāo)記在五節(jié)芒中產(chǎn)生一個(gè)特異性條帶(100bp左右)，同時(shí)在荻中產(chǎn)生另一個(gè)特異性條帶(123bp左右)，而在兩者的雜交后代中則表現(xiàn)為共顯性，因此該SSR標(biāo)記可用于五節(jié)芒與荻雜交后代的分子鑒定。利用本發(fā)明的方法可以快速準(zhǔn)確地鑒定五節(jié)芒和荻的雜交種的真實(shí)性。本發(fā)明為五節(jié)芒與荻的雜交提供了一種操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好、不受環(huán)境因素影響的鑒定方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103074440SQ201310037209
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月31日
發(fā)明者易自力, 朱玉葉, 艾辛, 蔣建雄 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)