專(zhuān)利名稱(chēng)：一種篩選益生菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于畜牧獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及篩選益生菌的方法。
背景技術(shù)：
益生菌是指通過(guò)改善宿主腸道菌群生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達(dá)到提高宿主(人和動(dòng)物)健康水平和健康狀態(tài)的活菌制劑，具有能幫助維持腸道的正常功能，有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收、刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)、提高免疫力的作用。益生菌在保障人畜健康或防治某些疾病方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，篩選不同來(lái)源和具有特殊功能的益生菌菌種成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前我國(guó)尚缺乏原始創(chuàng)新的益生菌關(guān)鍵技術(shù)和產(chǎn)品，在產(chǎn)業(yè)和市場(chǎng)上形成了國(guó)外產(chǎn)品與技術(shù)的雙重壟斷，限制了我國(guó)益生菌產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。益生菌開(kāi)發(fā)的首要關(guān)鍵技術(shù)是菌種的篩選。作為現(xiàn)有技術(shù)采用的篩選方法所依據(jù)的是菌種所具有的生物學(xué)和功能特征，尤其是黏附特性、存活特性、功能性、可加工性等?？墒牵@些特性都取決于菌種本身的特性，因此，從什么途徑、用什么方法篩選出這種菌株是關(guān)鍵。當(dāng)前，應(yīng)用傳統(tǒng)表型鑒定方法及16S rDNA序列同源性分析鑒定方法是篩選菌株的通用方法，這類(lèi)方法都能較好 地篩選出具有強(qiáng)黏附特性、存活特性高、可加工性強(qiáng)的菌株，但是不能有效篩選出有益于動(dòng)物健康的菌株，如可預(yù)防動(dòng)物大腸桿菌病的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選益生菌的方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是從乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、酵母菌、地衣芽孢菌和枯草芽孢菌等益生菌中篩選出可抵抗大腸桿菌負(fù)作用的高效菌株。本發(fā)明所述的一種篩選益生菌的方法是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的:第一步，分離豬或家禽脾臟，進(jìn)行組織原代培養(yǎng)；第二步，取一部分原代培養(yǎng)的脾臟組織，用大腸桿菌K88對(duì)其進(jìn)行攻毒，測(cè)定白細(xì)胞介素8和白細(xì)胞介素4水平的變化；第三步，取一部分原代培養(yǎng)的脾臟組織，用候選的多個(gè)益生菌菌株分別對(duì)其進(jìn)行處理，測(cè)定白細(xì)胞介素8和白細(xì)胞介素4水平的變化；第四步，通過(guò)比較候選的多個(gè)益生菌菌株和大腸桿菌K88處理后白細(xì)胞介素8和白細(xì)胞介素4水平的變化，挑選出與大腸桿菌K88處理引起的2種白細(xì)胞介素變化程度相似、但效果相反的益生菌菌株，初步確定出可能有效的益生菌菌株；第五步，通過(guò)大腸桿菌K88動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)，觀測(cè)初步篩選的益生菌菌株的保護(hù)效果，最終確定出高效的益生菌菌株。本發(fā)明適用于可用于家畜、家禽、小鼠和大鼠等的乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、酵母菌、地衣芽孢菌和枯草芽孢菌等益生菌的篩選。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)是:采用體外免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)攻毒實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法準(zhǔn)確性高、針對(duì)性強(qiáng)和節(jié)省時(shí)間，所篩選的益生菌可有效替代抗生素，減少大腸桿菌引起的疾病，促進(jìn)動(dòng)物健康。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將新鮮豬糞用生 理鹽水稀釋?zhuān)谶x擇性培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，然后各類(lèi)細(xì)菌純化培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)菌微量生化反應(yīng)管選出候選的益生菌菌株(乳桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬)備用。無(wú)菌取21日齡仔豬脾臟，剪碎，研磨勻漿，然后150目銅網(wǎng)過(guò)濾，離心收集細(xì)胞。通過(guò)紅細(xì)胞裂解液和GKN緩沖溶液處理，離心可以得到脾臟細(xì)胞。用RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為IX IO6個(gè)/ml。接種2X IO6個(gè)/孔細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)48小時(shí)后，力口Λ IXlO8個(gè)大腸桿菌Κ88或候選益生菌菌株(乳桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬)共培養(yǎng)2小時(shí)，收集細(xì)胞，檢測(cè)脾臟細(xì)胞白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-8表達(dá)水平。挑選出與大腸桿菌Κ88處理組白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-8變化相反的益生菌菌株(乳酸桿菌、鏈球菌，見(jiàn)表
1.1)作為體外試驗(yàn)篩選的對(duì)象。表1.1各種候選益生菌對(duì)仔豬脾臟細(xì)胞白細(xì)胞介素水平的影響
權(quán)利要求
1.一種篩選益生菌的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)分離豬或家禽脾臟，進(jìn)行組織原代培養(yǎng)； (2)取一部分原代培養(yǎng)的脾臟組織，用大腸桿菌K88對(duì)其進(jìn)行攻毒，測(cè)定白細(xì)胞介素8和白細(xì)胞介素4水平的變化； (3)取一部分原代培養(yǎng)的脾臟組織，用候選的多個(gè)益生菌菌株分別對(duì)其進(jìn)行處理，測(cè)定白細(xì)胞介素8和白細(xì)胞介素4水平的變化； (4)通過(guò)比較候選的多個(gè)益生菌菌株和大腸桿菌K88處理后白細(xì)胞介素8和白細(xì)胞介素4水平的變化，挑選出與大腸桿菌K88處理引起的2種白細(xì)胞介素變化程度相似、但效果相反的益生菌菌株，初 步確定出可能有效的益生菌菌株； (5)通過(guò)大腸桿菌K88動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)，觀測(cè)初步篩選的益生菌菌株的保護(hù)效果，最終確定出高效的益生菌菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選益生菌的方法，其特征在于:所述的益生菌包括乳桿菌屬或乳球菌屬或鏈球菌屬或腸球菌屬或酵母菌或地衣芽孢菌和枯草芽孢菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選益生菌的方法，其特征在于:所述的動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物包括家畜或家禽或小鼠或大鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選益生菌的方法，包括以下步驟(1)原代培養(yǎng)豬或家禽脾臟組織；(2)用大腸桿菌K88對(duì)其進(jìn)行攻毒，測(cè)定白細(xì)胞介素8和白細(xì)胞介素4水平的變化；(3)用候選的益生菌菌株分別對(duì)其進(jìn)行處理，測(cè)定上述2種白細(xì)胞介素水平的變化；(4)通過(guò)比較挑選出與大腸桿菌K88處理引起的2種白細(xì)胞介素變化程度相似、但效果相反的益生菌菌株；(5)通過(guò)大腸桿菌K88動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)，觀測(cè)初選出的益生菌菌株的保護(hù)效果，最終確定高效的益生菌菌株。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)是采用體外免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)攻毒實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法準(zhǔn)確性高、針對(duì)性強(qiáng)和節(jié)省時(shí)間，所篩選的益生菌可有效替代抗生素，減少大腸桿菌引起的疾病，促進(jìn)動(dòng)物健康。
文檔編號(hào)C12R1/01GK103087963SQ201310037320
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月31日
發(fā)明者侯永清, 丁斌鷹, 易丹 申請(qǐng)人:武漢工業(yè)學(xué)院