專利名稱：三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法及基因工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乙醇的生物制備領(lǐng)域，具體地涉及三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法及基因工程菌株。
背景技術(shù)：
隨著人類文明的不斷進(jìn)步，全球能源問題彰顯，現(xiàn)已成為制約全球經(jīng)濟(jì)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的重要因素。燃料乙醇是一種清潔、可再生的生物質(zhì)能源，纖維素燃料乙醇技術(shù)原料來源廣泛，是一項(xiàng)可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境友好型技術(shù)，其核心技術(shù)體系的建設(shè)已成為一個(gè)全球能源戰(zhàn)略必爭(zhēng)之地。木質(zhì)纖維素分解之后主要轉(zhuǎn)化為葡萄糖和木糖，葡萄糖和木糖在厭氧條件下經(jīng)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)發(fā)酵生成乙醇。本發(fā)明旨在以木質(zhì)纖維生物質(zhì)為原料，對(duì)經(jīng)過多重基因改良獲得釀酒酵母工程菌株進(jìn)行發(fā)酵獲得的纖維素乙醇關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)地研究，通過篩選并獲得一系列優(yōu)化的高產(chǎn)和高效率的纖維素乙醇目標(biāo)菌株，為纖維素乙醇商業(yè)化生產(chǎn)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。木糖發(fā)酵時(shí)先經(jīng)木糖還原酶基因XR,木糖醇脫氫酶基因XDH，木酮糖激酶基因XK連續(xù)催化生成5-磷酸-木酮糖，然后在磷酸戊糖途徑主要基因RPE1，RKII, TALI, TKLl催化作用下進(jìn)入糖酵解途徑，最后轉(zhuǎn)化為乙醇。在上述發(fā)酵過程中，目前許多研究者對(duì)XR進(jìn)行蛋白工程，例如單突變體XR (K270R)和四突變體XR (K270S/N272P/S271G/R276F)，希望通過調(diào)節(jié)XR的氧化還原水平來提高木糖的消耗速率。有一些研究者對(duì)木糖利用代謝途徑關(guān)鍵基因XR/XDH/XK/TAL1中的一個(gè)或者兩個(gè)進(jìn)行不同拷貝的探索，期望更有效的提高木糖和葡萄糖的利用率?，F(xiàn)有技術(shù)研究表明木糖乙醇發(fā)酵過程中大部分基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著改變，因此轉(zhuǎn)錄調(diào)控是進(jìn)一步提高乙醇產(chǎn)量的有效途徑?，F(xiàn)有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控技術(shù)主要是通過經(jīng)典的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PGKl和ADHl來介導(dǎo)上述重要的七基因轉(zhuǎn)錄，期望提高七基因的表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)纖維素乙醇產(chǎn)量的提高。但上述現(xiàn)有技術(shù)改造的釀酒酵母工程菌株發(fā)酵木糖時(shí)生長(zhǎng)速率緩慢，乙醇產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率偏低，乙醇的產(chǎn)量水平在0.36-0.42g/g總糖。然而，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控技術(shù)帶來的基因工程發(fā)酵代謝過程中的質(zhì)粒負(fù)擔(dān)，代謝負(fù)擔(dān)，各種環(huán)境壓力響應(yīng)都有可能影響最終的乙醇產(chǎn)量和產(chǎn)率，這是該研究技術(shù)的不確定性。同時(shí)木糖利用的低消耗速率，低轉(zhuǎn)化速率，盡管研究者嘗試了不同的啟動(dòng)子，不同的拷貝數(shù)目，不同的微生物菌株背景來源，不同的基因蛋白工程，都沒有改變纖維素乙醇技術(shù)目前面臨的瓶頸和難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此為了解決上述問題提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明的首要目的是提供三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法。本發(fā)明的另一目的是提供三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的基因工程菌株。根據(jù)本發(fā)明的三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法包括通過構(gòu)建基因XR、XDH、XK、RPEl、RKIl和TALl的表達(dá)質(zhì)粒，在釀酒酵母中表達(dá)上述基因的步驟，其中，用KGDl啟動(dòng)子介導(dǎo)限速基因XK，用HSP26啟動(dòng)子介導(dǎo)關(guān)鍵限速基因TALl。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
，所述三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法包括步驟:(1)將質(zhì)粒p61轉(zhuǎn)入釀酒酵母WT，得到WXY1，其菌株含有兩基因pADHl-RPEl和pPGKl-XDH,質(zhì)粒p61的構(gòu)建過程:721bp的啟動(dòng)子克隆進(jìn)入pbluescript,接下來71bp7的ADHl 啟動(dòng)子，434bp 的 PGKl 終止子，410bp 的 RPEl 啟動(dòng)子，629bp (自 ATG 起 629bp)的 RPEl結(jié)構(gòu)基因一部分，XDH結(jié)構(gòu)基因，選擇標(biāo)記RKUR，依次克隆進(jìn)來，形成質(zhì)粒p61 ；(2)將質(zhì)粒p62轉(zhuǎn)入WXYl，得到WXY2，該菌株額外含有pADHl_XR和pPGKl_XK，質(zhì)粒P62的構(gòu)建過程:在上述p61質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，500bp的XK啟動(dòng)子替換RPEl啟動(dòng)子，419bp(自ATG起419bp)的XK結(jié)構(gòu)基因一部分替換RPEl結(jié)構(gòu)基因一部分(自ATG)，含有四個(gè)突變的 xRk27cis/n272P/S271G/R276F 替換 XDH 結(jié)構(gòu)基因，形成質(zhì)粒 P62 ；(3)將質(zhì)粒p64轉(zhuǎn)入WXY2，得到WXY3，該菌株額外含有多拷貝的pPGKl-RKIl和pADHl-TALl，并且該菌株能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇，質(zhì)粒p64的構(gòu)建過程:用717的ADHl啟動(dòng)子替換PESC-LEU中的反向啟動(dòng)子PGAL10/PGAL1，接下來72Ibp的PGKl啟動(dòng)子，選擇標(biāo)記Zeocin, 1723bp的r DNA，TALl和RKIl結(jié)構(gòu)基因依次克隆進(jìn)來，形成質(zhì)粒p64 ；(4)將質(zhì)粒pUC-3XK270R轉(zhuǎn)入釀酒酵母WT，得到WXY4，該菌株含有三基因pADH1-XR/pPGK1-XDH/pPGK1-XK,能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇；將質(zhì)粒pUC_3XK270R轉(zhuǎn)入WXY3，得到WXY5，該菌株能很好地利用木糖，產(chǎn)生更多的乙醇；(5) pv3質(zhì)粒的構(gòu)建過程如下:首先將TALl結(jié)構(gòu)基因連接在pBluscript原始質(zhì)粒上，接下來依次將啟動(dòng)子CRE1，啟動(dòng)子KGDlr，XK-ORFr，選擇標(biāo)記基因RUR結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)子HSP26r，終止子CREl克隆進(jìn)來，形成pv3質(zhì)粒，其表型見表I，整合插入位點(diǎn)為CREl結(jié)構(gòu)基因，被分別轉(zhuǎn)進(jìn)WXY3和WXY5，得到了工程菌株WXY6和WXY7 ；(6)將pUC_3X(野生型XR)分別轉(zhuǎn)入酵母菌株釀酒酵母WT，WXY3，WXY6，分別得到工程菌株 WXY8，WXY9, WXYlO。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，以安琪酵母公司的工業(yè)釀酒酵母YC-DM拆分孢子獲得的單倍體菌株為出發(fā)菌株WT，首先構(gòu)建了一個(gè)能夠有效利用木糖的工程菌株即WXY3，含有 XRK27as/N272P/s27iG/R276F/XDH/XK/RpE1/RKn/TAL1。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入了一個(gè)已驗(yàn)證過
的質(zhì)粒PUC-3XK270R含有木糖利用三基因XRK27°7XDH/XK，得到了工程菌株WXY5，此即第一階段葡萄糖階段。接下來以WXY5為研究對(duì)象，委托深圳華大基因?qū)ζ湓诟邼舛然旌咸前l(fā)酵過程中的4小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)進(jìn)行了 RNA-Seq分析。根據(jù)發(fā)表的DNA芯片數(shù)據(jù)，獲得RNA-seq的絕對(duì)表達(dá)量RPKM，我們自己驗(yàn)證的RT-qPCR數(shù)據(jù)，篩選獲得了好氧狀態(tài)下的啟動(dòng)子K⑶I和發(fā)酵后期的熱休克啟動(dòng)子HSP26。用KGDl啟動(dòng)子介導(dǎo)限速基因)(K，HSP26啟動(dòng)子介導(dǎo)關(guān)鍵限速基因TAL1，構(gòu)建了質(zhì)粒pv3，含有木糖階段和熱休克階段。將pv3轉(zhuǎn)入WXY5，得到了一個(gè)有良好發(fā)酵特征的WXY7。用PUC-3X替換WXY7中的pUC_3XK270R，得到了階段性的高產(chǎn)乙醇工程菌株WXY10，該菌株在5% (木糖+葡萄糖)厭氧發(fā)酵過程中，6小時(shí)消耗完了葡萄糖，大概60小時(shí)左右消耗完了木糖，乙醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 0.48g乙醇/g總糖。根據(jù)本發(fā)明的三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的基因工程菌株其保藏編號(hào)為 CGMCC N0.7191。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，其中所用木糖還原酶基因XR的序列如SEQ ID N0.1所示:atgccttctattaagttgaa ctctggttacgacatgccagccgtcggtttcggctgttggaaagtcgacgtcgacacctgttctgaacagatctaccgtgctatcaagaccggttacagattgttcgacggtgccgaagattacgccaacgaaaagttagttggtgccggtgtcaagaaggccattgacgaaggtatcgtcaagcgtgaagacttgttccttacctccaagttgtggaacaactaccaccacccagacaacgtcgaaaaggccttgaacagaaccctttctgacttgcaagttgactacgttgacttgttcttgatccacttcccagtcaccttcaagttcgttccattagaagaaaagtacccaccaggattctactgtggtaagggtgacaacttcgactacgaagatgttccaattttagagacctggaaggctcttgaaaagttggtcaaggccggtaagatcagatctatcggtgtttctaacttcccaggtgctttgctcttggacttgttgagaggtgctaccatcaagccatctgtcttgcaagttgaacaccacccatacttgcaacaaccaagattgatcgaattcgctcaatcccgtggtattgctgtcaccgcttactcttcgttcggtcctcaatctttcgttgaattgaaccaaggtagagctttgaacacttctccattgttcgagaacgaaactatcaaggctatcgctgctaagcacggtaagtctccagctcaagtcttgttgagatggtcttcccaaagaggcattgccatcattccaaagtccaacactgtcccaagattgttggaaaacaaggacgtcaacagcttcgacttggacgaacaagatttcgctgacattgccaagttggacatcaacttgagattcaacgacccatgggactgggacaagattcctatcttcgtctaa木糖醇脫氫酶基因XDH的序列如SEQ ID N0.2所示:atgactgctaacccttccttggtgttgaacaagatcgacgacatttcgttcgaaacttacgatgccccagaaatctctgaacctaccgatgtcctcgtccaggtcaagaaaaccggtatctgtggttccgacatccacttctacgcccatggtagaatcggtaacttcgttttgaccaagccaatggtcttgggtcacgaatccgccggtactgttgtccaggttggtaagggtgtcacctctcttaaggttggtgacaacgtcgctatcgaaccaggtattccatccagattctccgacgaatacaagagcggtcactacaacttgtgtcctcacatggccttcgccgctactcctaactccaaggaaggcgaaccaaacccaccaggtaccttatgtaagtacttcaagtcgccagaagacttcttggtcaagttgccagaccacgtcagcttggaactcggtgctcttgttgagccattgtctgttggtgtccacgcctctaagttgggttccgttgctttcggcgactacgttgccgtctttggtgctggtcctgttggtcttttggctgctgctgtcgccaagaccttcggtgctaagggtgtcatcgtcgttgacattttcgacaacaagttgaagatggccaaggacattggtgctgctactcacaccttcaactccaagaccggtggttctgaagaattgatcaaggctttcggtggtaacgtgccaaacgtcgttttggaatgtactggtgctgaaccttgtatcaagttgggtgttgacgccattgccccaggtggtcgtttcgttcaagtcggtaacgctgctggtccagtcagcttcccaatcaccgttttcgccatgaaggaattgactttgttcggttctttcagatacggattcaacgactacaagactgctgttggaatctttgacactaactaccaaaacggtagagaaaatgctccaattgactttgaacaattgatcacccacagatacaagttcaaggacgctattgaagcctacgacttggtcagagccggtaagggtgctgtcaagtgtctcattgacggccctgagtaa介導(dǎo)限速基因XK的序列如SEQ ID N0.3所示:atgttgtgttcagtaattcagagacagacaagagaggtttccaacacaatgtctttagactcatactatcttgggtttgatctttcgacccaacaactgaaatgtctcgccattaaccaggacctaaaaattgtccattcagaaacagtggaatttgaaaaggatcttccgcattatcacacaaagaagggtgtctatatacacggcgacactatcgaatgtcccgtagccatgtggttagaggctctagatctggttctctcgaaatatcgcgaggctaaatttccattgaacaaagttatggccgtctcagggtcctgccagcagcacgggtctgtctactggtcctcccaagccgaatctctgttagagcaattgaataagaaaccggaaaaagatttattgcactacgtgagctctgtagcatttgcaaggcaaaccgcccccaattggcaagaccacagtactgcaaagcaatgtcaagagtttgaagagtgcataggtgggcctgaaaaaatggctcaattaacagggtccagagcccattttagatttactggtcctcaaattctgaaaattgcacaattagaaccagaagcttacgaaaaaacaaagaccatttctttagtgtctaattttttgacttctatcttagtgggccatcttgttgaattagaggaggcagatgcctgtggtatgaacctttatgatatacgtgaaagaaaattcagtgatgagctactacatctaattgatagttcttctaaggataaaactatcagacaaaaattaatgagagcacccatgaaaaatttgatagcgggtaccatctgtaaatattttattgagaagtacggtttcaatacaaactgcaaggtctctcccatgactggggataatttagccactatatgttctttacccctgcggaagaatgacgttctcgtttccctaggaacaagtactacagttcttctggtcaccgataagtatcacccctctccgaactatcatcttttcattcatccaactctgccaaaccattatatgggtatgatttgttattgtaatggttctttggcaagggagaggataagagacgagttaaacaaagaacgggaaaataattatgagaagactaacgattggactctttttaatcaagctgtgctagatgactcagaaagtagtgaaaatgaattaggtgtatattttcctctgggggagatcgttcctagcgtaaaagccataaacaaaagggttatcttcaatccaaaaacgggtatgattgaaagagaggtggccaagttcaaagacaagaggcacgatgccaaaaatattgtagaatcacaggctttaagttgcagggtaagaatatctcccctgctttcggattcaaacgcaagctcacaacagagactgaacgaagatacaatcgtgaagtttgattacgatgaatctccgctgcgggactacctaaataaaaggccagaaaggactttttttgtaggtggggcttctaaaaacgatgctattgtgaagaagtttgctcaagtcattggtgctacaaagggtaattttaggctagaaacaccaaactcatgtgcccttggtggttgttataaggccatgtggtcattgttatatgactctaataaaattgcagttccttttgataaatttctgaatgacaattttccatggcatgtaatggaaagcatatccgatgtggataatgaaaattgggatcgctataattccaagattgtccccttaagcgaactggaaaagactctcatctaa基因R削I的序列如SEQ ID N0.4所示:atggctgccggtgtcccaaaaattgatgcgttagaatctttgggcaatcctttggaggatgccaagagagctgcagcatacagagcagttgatgaaaatttaaaatttgatgatcacaaaattattggaattggtagtggtagcacagtggtttatgttgccgaaagaattggacaatatttgcatgaccctaaattttatgaagtagcgtctaaattcatttgcattccaacaggattccaatcaagaaacttgattttggataacaagttgcaattaggctccattgaacagtatcctcgcattgatatagcgtttgacggtgctgatgaagtggatgagaatttacaattaattaaaggtggtggtgcttgtctatttcaagaaaaattggttagtactagtgctaaaaccttcattgtcgttgctgattcaagaaaaaagtcaccaaaacatttaggtaagaactggaggcaaggtgttcccattgaaattgtaccttcctcatacgtgagggtcaagaatgatctattagaacaattgcatgctgaaaaagttgacatcagacaaggaggttctgctaaagcaggtcctgttgtaactgacaataataactteattatcgatgcggatttcggtgaaatttccgatccaagaaaattgcatagagaaatcaaactgttagtgggcgtggtggaaacaggtttattcatcgacaacgcttcaaaagcctacttcggtaattctgacggtagtgttgaagttaccgaaaagtga`
基因RPEl的序列如SEQ ID N0.5所示:atggtcaaaccaattatagctcccaggtatccttgcttctgacttcgccaacttgggttgcgaatgtcataaggtcatcaacgccggcgcagattggttacatatcgatgtcatggacggccattttgttccaaacattactctgggccaaccaattgttacctccctacgtcgttctgtgccacgccctggcgatgctagcaacacagaaaagaagcccactgcgttcttcgattgtcacatgatggttgaaaatcctgaaaaatgggtcgacgattttgctaaatgtggtgctgaccaatttacgttccactacgaggccacacaagaccctttgcatttagttaagttgattaagtctaagggcatcaaagctgcatgcgccatcaaacctggtacttctgttgacgttttatttgaactagctcctcatttggatatggctcttgttatg
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cccccatttgaatatccaagtcgatggtggtttgggcaaggagaccatcccgaaagccgccaaagccggtgccaacg
ttattgtcgctggtaccagtgttttcactgcagctgacccgcacgatgttatctccttcatgaaagaagaagtctcg
aaggaattgcgttctagagatttgctagattag:基因TALl的序列如SEQID N0.6所示:atgtctgaaccagctcaaaagaaacaaaaggttgctaacaactctctagaacaattgaaagcctccggcactgtcgttgttgccgacactggtg atttcggctctattgccaagtttcaacctcaagactccacaactaacccatcattgatcttggctgctgccaagcaaccaacttacgccaagttgatcgatgttgccgtggaatacggtaagaagcatggtaagaccaccgaagaacaagtcgaaaatgctgtggacagattgttagtcgaattcggtaaggagatcttaaagattgttccaggcagagtctccaccgaagttgatgctagattgtcttttgacactcaagctaccattgaaaaggctagacatatcattaaattgtttgaacaagaaggtgtctccaaggaaagagtccttattaaaattgcttccacttgggaaggtattcaagctgccaaagaattggaagaaaaggacggtatccactgtaatttgactctattattctccttcgttcaagcagttgcctgtgccgaggcccaagttactttgatttccccatttgttggtagaattctagactggtacaaatccagcactggtaaagattacaagggtgaagccgacccaggtgttatttccgtcaagaaaatctacaactactacaagaagtacggttacaagactattgttatgggtgcttctttcagaagcactgacgaaatcaaaaacttggctggtgttgactatctaacaatttctccagctttattggacaagttgatgaacagtactgaacctttcccaagagttttggaccctgtctccgctaagaaggaagccggcgacaagatttcttacatcagcgacgaatctaaattcagattcgacttgaatgaagacgctatggccactgaaaaattgtccgaaggtatcagaaaattctctgccgatattgttactctattcgacttgattgaaaagaaagttaccgcttaa本發(fā)明擬采用DNA芯片及qRT-PCR方法對(duì)酵母細(xì)胞在葡萄糖發(fā)酵階段，木糖發(fā)酵階段包括發(fā)酵后期等不同階段的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜進(jìn)行構(gòu)建。針對(duì)不同代謝階段發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄水平大幅上調(diào)的特征基因，擬利用其啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)木糖代謝中相關(guān)目標(biāo)基因XR，XDH，XKS1，TAL1在相應(yīng)階段繼續(xù)進(jìn)行高水平表達(dá)，以使目標(biāo)基因在發(fā)酵的各階段都能持續(xù)高效表達(dá)。酵母在混合糖發(fā)酵的前期及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期優(yōu)先利用葡萄糖，本發(fā)明根據(jù)RT-PCR篩選并確認(rèn)了厭氧狀態(tài)下強(qiáng)啟動(dòng)子pPGKl，pADHl。當(dāng)葡萄糖耗盡后，本發(fā)明篩選了 TCA中代謝轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生較大改變的基因的啟動(dòng)子，用來調(diào)控具有呼吸特征的木糖基因轉(zhuǎn)錄，確定了木糖發(fā)酵狀態(tài)下強(qiáng)啟動(dòng)子有PKGD1。發(fā)酵后期也稱應(yīng)激階段，其中環(huán)境溫度上升5°C引起的熱休克效應(yīng)對(duì)乙醇產(chǎn)量變化非常明顯。將篩選獲得的熱休克蛋白強(qiáng)啟動(dòng)子pHSP26，pHSP70整合到目標(biāo)基因上，以增強(qiáng)酵母細(xì)胞對(duì)發(fā)酵后期不利環(huán)境的抗性和適應(yīng)性，提前到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)?？傊?，本發(fā)明通在葡萄糖階段，木糖階段及發(fā)酵后期階段引入強(qiáng)啟動(dòng)子來優(yōu)化乙醇的生物合成途徑中目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并通過調(diào)控靶點(diǎn)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平這一核心思路解決發(fā)酵中后期的代謝瓶頸。因此，本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)和優(yōu)點(diǎn)如下:本發(fā)明將纖維素酒精發(fā)酵過程分為厭氧的葡萄糖發(fā)酵階段，好氧的木糖呼吸代謝階段，具有熱休克特征的高溫抑制為主的發(fā)酵后期階段，共三個(gè)階段。針對(duì)現(xiàn)有基因工程菌株的具體問題，本發(fā)明提出在三個(gè)階段用上述各階段篩選出的目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)的特征啟動(dòng)子全面啟動(dòng)木糖利用的七基因或者主要基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，讓目標(biāo)基因在三個(gè)階段的每一個(gè)階段都能得到高效的表達(dá)，從而讓纖維素底物更加高效地轉(zhuǎn)化為纖維素乙醇。綜上所述，我們提出了這樣的三階段轉(zhuǎn)錄調(diào)控理論(three stage transcription regulations,簡(jiǎn)稱為 TSTR)。本理論的創(chuàng)新點(diǎn)及改進(jìn)之處:1第一次優(yōu)化總結(jié)并提出了三階段轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)鍵基因提高纖維素乙醇產(chǎn)量的理論體系；2第一次將熱休克啟動(dòng)子HSP26和TCA循環(huán)啟動(dòng)子KGDl等相關(guān)啟動(dòng)子用于介導(dǎo)木糖利用的關(guān)鍵基因XR/XDH/XK/TAL1提高乙醇的產(chǎn)量；3本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了通過快速耗盡葡萄糖來降低葡萄糖在乙醇發(fā)酵過程中對(duì)木糖的代謝抑制；4我們構(gòu)建的工程菌株WXYlO在各5%左右的混合糖發(fā)酵過程中，60小時(shí)左右實(shí)現(xiàn)了 0.48g乙醇/g總糖的糖醇轉(zhuǎn)化率，達(dá)到了理論最大值的94%，具有一定的工業(yè)化潛力，處于國(guó)內(nèi)外前沿水平。
附圖 說明

圖1顯示了在45g/L (葡萄糖+木糖)厭氧發(fā)酵各時(shí)間段各酵母菌株WT⑷，WXY3⑶，WXY4 (C)，WXY5⑶的乙醇代謝圖譜。圖2顯示對(duì)TCA循環(huán)基因和HSP家族基因考察的結(jié)果，在50g/L (葡萄糖+木糖)厭氧發(fā)酵各時(shí)間段各酵母菌株的乙醇代謝圖譜。圖3顯示為菌株發(fā)酵結(jié)果，在45g/L和50g/L (葡萄糖+木糖)厭氧發(fā)酵各時(shí)間段各酵母菌株的乙醇代謝圖譜。圖4為WXY7和WXYlO在50g/L葡萄糖和50g/L木糖的培養(yǎng)基下進(jìn)行發(fā)酵的結(jié)果。圖5顯示各菌株在￥^)培養(yǎng)基中發(fā)酵12小時(shí)，菌株訂1乂￥(3-54)和1乂￥(6，7，10, B)的基因XR/XDH/XK/TAL1的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。釀酒酵母WXYlO (Saccharomyces cerevisiae),于 2013 年 I 月 23 日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏編號(hào)是:CGMCC N0.7191。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、混合糖共發(fā)酵菌株的構(gòu)建出發(fā)菌株WT來自安琪酵母公司的釀酒酵母工業(yè)菌株，經(jīng)過從工業(yè)二倍體拆分孢子轉(zhuǎn)化為單倍體，經(jīng)過發(fā)酵篩選具有更好發(fā)酵特性的優(yōu)勢(shì)菌株，作為我們?cè)囼?yàn)的原始工業(yè)出發(fā)菌株。將質(zhì)粒p61轉(zhuǎn)入WT，得到WXY1，其菌株含有兩基因pADHl-RPEl和pPGKl_XDH ；將質(zhì)粒P62轉(zhuǎn)入WXY1，得到WXY2，該菌株額外含有pADHl_XR4m和pPGKl_XK ;將質(zhì)粒p64轉(zhuǎn)入WXY2，得到WXY3，該菌株額外含有多拷貝的pPGKl-RKIl和pADHl_TALl，并且該菌株能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇；將質(zhì)粒PUC-3XK270R轉(zhuǎn)入WT，得到WXY4，該菌株含有三基因pADHl-XR(K270R)/pPGKl-XDH/pPGKl-XK,能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇；將質(zhì)粒 pUC_3XK270R轉(zhuǎn)入WXY3，得到WXY5，該菌株能很好地利用木糖，產(chǎn)生更多的乙醇。圖1顯示了工程菌株WT和WXY (3-5)在約45克/升葡萄糖和45g/L的木糖培養(yǎng)基的發(fā)酵結(jié)果。WT菌株在24小時(shí)后，消耗完了 43.5g/L的葡萄糖，在發(fā)酵結(jié)束后利用了約8g/L (17.8%)木糖，產(chǎn)生了約21.4g/L的乙醇和2.7g/L的木糖醇(圖1A)。WXY4在24小時(shí)內(nèi)完全消耗43.5g/L的葡萄糖，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)利用了約16g/L (35.7%)的木糖，產(chǎn)生了 26.4g/L的乙醇和1.7g/L木糖醇(圖1C)。發(fā)酵結(jié)束后，菌株WXY3和WXY5消耗了 16.2(36%)和31.4 (70.l%)g/L的木糖，產(chǎn)生了 3.0和1.5g/L木糖醇，并產(chǎn)生較高的25.1和34.2g/L的乙醇，分別為(圖1B和D)。與WT和WXY3菌株相比，WXY4和WXY5擁有更多的細(xì)胞數(shù)量(圖1E)。相關(guān)的菌株基因型和發(fā)酵數(shù)據(jù)也參見表I和表2。與發(fā)表的工業(yè)菌株基因修飾策略相比，本發(fā)明在整體水平上，特別是關(guān)鍵基因拷貝數(shù)量進(jìn)行了優(yōu)化通過RT-PCR證實(shí)了基因拷貝數(shù)目的增加及相關(guān)基因得到了相對(duì)高的表達(dá)量:WXY5有兩拷貝突變體XR(K270R)和 XR (K270S/N272P/S271G/R276F)，兩拷貝野生型 XDH，兩拷貝 XK，多拷貝 TALl 及其他相關(guān)基因。厭氧批發(fā)酵結(jié)果顯示，混合糖到乙醇的轉(zhuǎn)化率為0.39g/g總糖。
表I質(zhì)粒
權(quán)利要求
1.一種三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述方法包括通過構(gòu)建基因XR、XDH、XK、RPEl、RKIl和TALl的表達(dá)質(zhì)粒，在釀酒酵母中表達(dá)上述基因的步驟，其中，用KGDl啟動(dòng)子介導(dǎo)限速基因》(，用HSP26啟動(dòng)子介導(dǎo)關(guān)鍵限速基因TALl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，對(duì)于基因XDH使用啟動(dòng)子pPGKl，對(duì)于基因RPEl使用啟動(dòng)子pADHl，對(duì)于RKII使用啟動(dòng)子PGKl，對(duì)于基因XR使用啟動(dòng)子pADHl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，基因XR的序列如SEQ ID N0.1所示，基因XDH的序列如SEQ ID N0.2所示，基因XK的序列如SEQ ID N0.3所示，基因RKIl的序列如SEQ ID N0.4所示，基因TALl的序列如SEQID N0.6 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述方法包括步驟: Cl)將質(zhì)粒p61轉(zhuǎn)入釀酒酵母WT，得到WXY1，其菌株含有兩基因pADHl-RPEl和pPGKl-XDH ； (2)將質(zhì)粒p62轉(zhuǎn)入WXYl，得到WXY2，該菌株額外含有pADHl_XR和pPGKl_XK ； (3 )將質(zhì)粒p64轉(zhuǎn)入WXY2，得到WXY3，該菌株額外含有多拷貝的pPGKl-RKI I和pADHl-TALl，并且該菌株能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇； (4)將質(zhì)粒pUC-3XK轉(zhuǎn)入釀酒酵母WT，得到WXY4，該菌株含有三基因pADHl_XR/pPGKl-XDH/pPGKl-XK，能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇；將質(zhì)粒pUC_3XK轉(zhuǎn)入WXY3，得到WXY5，該菌株能很好地利用木糖，產(chǎn)生更多的乙醇； (5)pv3質(zhì)粒的構(gòu)建過程如下:首先將TALl結(jié)構(gòu)基因連接在pBluscript原始質(zhì)粒上，接下來依次將啟動(dòng)子CREl，啟動(dòng)子KGDIr，XK-ORFr，選擇標(biāo)記基因RUR結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)子HSP26r，終止子CREl克隆進(jìn)來，形成pv3質(zhì)粒，其表型見表I，整合插入位點(diǎn)為CREl結(jié)構(gòu)基因，被分別轉(zhuǎn)進(jìn)WXY3和WXY5，得到了工程菌株WXY6和WXY7 ； (6)將pUC-3X(野生型XR)分別轉(zhuǎn)入酵母菌株釀酒酵母WT，WXY3，WXY6，分別得到工程菌株 WXY8，WXY9, WXYlO。
5.三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的基因工程菌株，其保藏編號(hào)為:CGMCCN0.7191。
6.一種通過生物發(fā)酵制備乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括發(fā)酵菌株CGMCCN0.7191的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙醇的生物制備領(lǐng)域，具體地涉及三階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法及基因工程菌株。所述方法包括通過構(gòu)建基因XR、XDH、XK、RPE1、RKI1和TAL1的表達(dá)質(zhì)粒，在釀酒酵母中表達(dá)上述基因的步驟，其中，用KGD1啟動(dòng)子介導(dǎo)限速基因XK，用HSP26啟動(dòng)子介導(dǎo)關(guān)鍵限速基因TAL1。本發(fā)明將纖維素酒精發(fā)酵過程分為厭氧的葡萄糖發(fā)酵階段，好氧的木糖呼吸代謝階段，具有熱休克特征的高溫抑制為主的發(fā)酵后期階段，共三個(gè)階段。讓目標(biāo)基因在三個(gè)階段的每一個(gè)階段都能得到高效的表達(dá)，從而讓纖維素底物更加高效地轉(zhuǎn)化為纖維素乙醇。
文檔編號(hào)C12R1/865GK103146741SQ20131004134
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者蕭偉, 曹利民, 湯興良, 田雪蕾 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)