專利名稱：一株產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯細菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于應用微生物領域，涉及一株產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯細菌及其應用。
背景技術：
傳統(tǒng)石油產(chǎn)品來源的塑料制品廣泛使用，但廢棄的化學塑料由于不能被微生物分解，帶來了嚴重的“白色污染”。聚β_羥基丁酸(PHB)酯是部分細菌細胞內利用常規(guī)碳源積累的一種能被微生物降解的一種高分子聚合物，是細胞內的能量和碳源物質。PHB可以加工處理作為一種生物合成塑料，不僅具有化學合成塑料的特性，還具有高度可生物降解性、生物組織相容性、壓電性和抗凝血性等優(yōu)點，可望在電子、光學、生物醫(yī)學等高技術領域獲得應用。能合成聚β —羥基丁酸的微生物分布極廣，包括光能和化能自養(yǎng)微生物和異養(yǎng)微生物共計65個屬300多種微生物。這些微生物能利用葡萄糖、蔗糖或淀粉的水解物等不同的碳源合成聚β —羥基丁酸酯。但是很多碳源價格比較昂貴，使生產(chǎn)聚β —羥基丁酸酯的成本升高，為了降低生產(chǎn)PHB的成本必須找到更便宜，更方便的碳源物質，而淀粉來源廣泛，大部分來自于植物，成本低廉，能夠長期滿足生產(chǎn)聚β —羥基丁酸酯的需要。因此，以淀粉為單一碳源生產(chǎn)聚β —羥基丁酸酯的微生物在生物塑料的生產(chǎn)中具有更高的潛在應用價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一株以淀粉為唯一碳源的生產(chǎn)多聚β_羥基丁酸酯新菌株Aquabacterium sp.A7_Y。本發(fā)明的另一目的是提供該菌株的應用。一株聚β-羥基丁酸酯產(chǎn)生菌Aquabacterium sp.Α7-Υ，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年8月27日，保藏編號為CCTCC NO:M2012316，以下簡稱A7-Y菌株。本發(fā)明所述的聚β -輕基丁酸酯產(chǎn)生菌Aquabacterium sp.Α7-Υ在生產(chǎn)聚β-輕基丁酸酯中的應用，特別是在以淀粉為唯一碳源生產(chǎn)聚β_羥基丁酸酯中的應用。利用所述的聚β -輕基丁酸酯產(chǎn)生菌Aquabacterium sp.A7_Y產(chǎn)生聚β-輕基丁酸酯的方法，利用改良的HV培養(yǎng)基對權利要求1所述的聚β_羥基丁酸酯產(chǎn)生菌Aquabacterium sp.A7_Y進行發(fā)酵，所述的改良的HV培養(yǎng)基的成分是:淀粉10g/L,NaNO30.5g/L, KCll.5g/L, Na2HPO40.75g/L, MgSO40.5g/L, FeSO40.02g/L, CaCl20.02g/L,pH=6.5-7.00有益效果:本發(fā)明提供了一株產(chǎn)聚β —羥基丁酸酯的菌株，本發(fā)明中聚β —羥基丁酸酯的生產(chǎn)能夠以淀粉為唯一碳源，發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)配方簡單，原料來源廣泛、價格低，發(fā)酵周期短，耗能低，從而大幅降低了聚β —羥基丁酸酯生產(chǎn)成本。


圖1 基于 16s rDNA 序列的 Aquabacterium.sp A7-Y 系統(tǒng)進化樹圖2Aquabacterium.sp A7-Y 在 HV 平板生長:透射電鏡形態(tài)(5000 X )圖3Aquabacterium.sp A7-Y HV平板生長透射電鏡下產(chǎn)PHB情況(4000 X )生物材料保藏信息Aquabacterium sp.A7-Y，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年8月27日，保藏地址:中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M2012316。
具體實施例方式實施例11.菌種分離土壤樣品采集于安徽省，首先用采樣鏟去表層土，用取樣器取深度為10-30cm的土樣，裝入牛皮紙袋中。室溫下風干IOd,稱取5克土壤加入到IOOmL無菌水中制成土壤懸液，在土壤懸浮液中加6%酵母膏以及0.05%SDS并在40°C搖床上振蕩培養(yǎng)20min，取ImL分別稀釋10倍，100倍和1000倍，分別取0.1mL各稀釋度的稀釋液涂布改良HV平板(淀粉10g/L, NaNO30.5g/L, KCll.5g/L, Na2HPO40.75g/L, MgSO40.5g/L, FeSO40.02g/L, CaCl20.02g/L,瓊脂16g/L，pH=6.5-7.0)，置于27°`C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，將平板上單菌落用無菌接種環(huán)及時轉接到HV平板培養(yǎng)基上，再繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)出單菌落，使用蘇丹黑染色，挑取染色后細胞呈黑色的為產(chǎn)PHB菌株。根據(jù)其胞內PHB的充盈程度確定其中菌株A7-Y是產(chǎn)PHB能力較好的菌株。采用HV液體培養(yǎng)基培養(yǎng)A7-Y，37°C震蕩培養(yǎng)2天后，IOOOOrpm離心收集菌體，采用常見的氯仿抽提法提取A7-Y所產(chǎn)PHB，經(jīng)核磁共振(NMR)，紅外光譜、氣相色譜-質譜聯(lián)機測定等手段，確定A7-Y所產(chǎn)胞內聚合物為PHB。2.菌種鑒定(I) 16S rRNA 基因分析提取菌株A7-Y基因組DNA，采用細菌的16S r DNA通用引物(27f:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；1492r:5’ -TACCTTGTTACGACTT-3’)擴增 16S rRNA 基因并純化測序，序列測定結果通過EzTaxon server2.1進行相似性比較。序列分析結果表明:菌株A7-Y的16S rRNA的核苷酸序列為SEQ ID N0.1。核苷酸序列相似性高于 97%,為 Aquincola tertiaricarbonis LlOT (相似度 97.105%,genbank號為DQ656489)，進一步將該菌株與同源性較高的50個菌株的16S rDNA進行序列比對，利用ClustalX(Versionl.83)和MEGA4.1軟件進行多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構建，用Neighbor-Join法，1000次，得到系統(tǒng)進化發(fā)育樹，結果顯示(圖1):菌株A7-Y聚類到Aquabacterium 屬的，是其一個新種，以此命名為 Aquabacterium sp.A7-Y。(2)菌株A7-Y形態(tài)特征及生理生化特性將菌株A7-Y與Aquabacterium屬各個已鑒定菌株進行比較。形態(tài)特征按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》描述進行(圖1)。生理生化按照ZYM、API20NE (法國梅里埃)說明書進行。DNA (G+C)mol%含量測定委托中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心完成。Aquabacterium sp.A7-Y為革蘭氏染色陰性,菌落表面干燥并突起,相互粘連不易散開，輕度堅硬不易被接種環(huán)挑起，白色(見圖2)。菌體桿狀，有內含物，有運動能力(見圖3)。根據(jù)ZYM結果:可以利用的堿性磷酸酯酶、酯酶(C4)、類脂酯酶(CS)、類脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-B1-磷酸水解酶、α -葡萄糖苷酶、β -葡萄糖苷酶；根據(jù)ΑΡΙ20ΝΕ實驗結果:硝酸鹽還原陽性，氧化酶陽性、過氧化氫酶陽性、可以水解七葉苷、明膠、同化葡萄糖、麥芽糖等，其中與Aquabacterium屬的5株菌及Aquincola tertiaricarbonis LlOT比較的生理生化具體情況如表I。表I與同源關系相近菌屬生理生化特性比較
權利要求
1.株聚β-羥基丁酸酯產(chǎn)生菌Aquabacterium sp.Α7_Υ，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年8月27日，保藏編號為CCTCC NO:Μ2012316。
2.權利要求1所述的聚β-輕基丁酸酯產(chǎn)生菌Aquabacterium sp.Α7_Υ在生產(chǎn)聚β_羥基丁酸酯中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于權利要求1所述的聚β-羥基丁酸酯產(chǎn)生菌Aquabacterium sp.Α7_Υ在以淀粉為唯一碳源生產(chǎn)聚β_輕基丁酸酯中的應用。
4.用權利要求1所述的聚β-輕基丁酸酯產(chǎn)生菌Aquabacterium sp.Α7_Υ產(chǎn)生聚β -羥基丁酸酯的方法，其特征在于利用改良的HV培養(yǎng)基對權利要求1所述的聚β -羥基丁酸酯產(chǎn)生菌Aquabacterium sp.A7_Y進行發(fā)酵,所述的改良的HV培養(yǎng)基的成分是:淀粉10g/L, NaNO30.5g/L, KCll.5g/L, Na2HPO40.75g/L, MgSO40.5g/L, FeSO40.02g/L, CaCl20.02g/L, pH =6.5-7.00
全文摘要
本發(fā)明屬于應用微生物領域，涉及一株產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯細菌及其應用。一株聚β-羥基丁酸酯產(chǎn)生菌Aquabacterium sp.A7-Y，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年8月27日，保藏編號為CCTCC NOM2012316，以下簡稱A7-Y菌株。本發(fā)明所述的聚β-羥基丁酸酯產(chǎn)生菌Aquabacterium sp.A7-Y可在以淀粉為唯一碳源生產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯中的應用。
文檔編號C12N1/20GK103087965SQ201310041368
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月1日 優(yōu)先權日2013年2月1日
發(fā)明者崔中利, 馮麗, 孫志斌, 黃艷 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學