專利名稱：一種分程胚胎培養(yǎng)液及其配制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種提高體外受精卵生長(zhǎng)發(fā)育效果的分程胚胎培養(yǎng)液及其配制方法。
背景技術(shù)：
自從世界上第一個(gè)“試管”嬰孩于1978年7月25日在英國(guó)出生后，到2012年7月I日已有500萬(wàn)個(gè)“試管”嬰孩誕生。IVF (體外受精)為全球超過(guò)占5000萬(wàn)不孕癥夫婦帶來(lái)了福音。然而，三十多年的臨床實(shí)踐并沒(méi)有顯著提高IVF的成功率。2011年，美國(guó)妊娠協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)35歲病人IVF成功率(受孕率)在25-30%左右，而1997年也在30%左右。而嬰兒出生率更低。其中一個(gè)重要的原因是IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量。這是IVF胚胎質(zhì)量最重要的決定性因素之一。IVF培養(yǎng)通常分為兩種流程即兩種培養(yǎng)液系列:全程(單培養(yǎng)液系列)和分程(雙培養(yǎng)液系列)。利用雙培養(yǎng)液系列流程對(duì)胚胎早期和后期階段提供不同的培養(yǎng)液成份，但也丟失了由胚胎分泌入培養(yǎng)液中的重要的有效成份，如胚胎營(yíng)養(yǎng)因子。全程培養(yǎng)液系列流程保留了這些重要的有效成份，但也保留了培養(yǎng)液中有害的分解產(chǎn)物
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供加入多種胚胎營(yíng)養(yǎng)因子的分程胚胎培養(yǎng)液，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述分程胚胎培養(yǎng)液的配制方法。技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種分程胚胎培養(yǎng)液，包括基本培養(yǎng)液和胚胎營(yíng)養(yǎng)因子，其中，所述基本培養(yǎng)液包括無(wú)機(jī)鹽緩沖液、氨基酸、丙酮酸鈉、乳酸鈉、葡萄糖和血清白蛋白；所述胚胎營(yíng)養(yǎng)因子包括PAF、IGF-1和GM-CSF的任意一種或多種。對(duì)于本發(fā)明涉及的胚胎營(yíng)養(yǎng)因子,PAF (Platelet-Activating Factor)是植入前期胚胎分泌的磷脂質(zhì)，在應(yīng)用中，主要作用在2-細(xì)胞期胚胎。PAF可誘導(dǎo)2-細(xì)胞胚胎中轉(zhuǎn)錄 CREB (cAMP-Response element binding protein, cAMP 反應(yīng)兀件結(jié)合蛋白)的憐酸化，并進(jìn)一步誘導(dǎo)2-細(xì)胞胚胎表達(dá)有利于胚胎細(xì)胞生存的轉(zhuǎn)錄因子和CREB-靶向的轉(zhuǎn)錄因子。另一方面，PAF激活MDM2，促使其與細(xì)胞核的P53結(jié)合成復(fù)合物，在細(xì)胞漿內(nèi)將P53降價(jià)，從而抑制胚胎細(xì)胞的凋零。IGF-1 是 IGF (Insulin-like Growth Factors)膜島素樣生長(zhǎng)因子中的一種，又被稱作“促生長(zhǎng)因子”，是一種植入前期胚胎分泌的活性蛋白多肽物質(zhì)。GM-CSF(Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor,粒細(xì)胞-巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子)，可由卵巢，輸卵管，子宮內(nèi)膜的上皮細(xì)胞產(chǎn)生，人類卵子和植入前期胚胎存在GM-CSF受體。起到抑制胚胎細(xì)胞凋零，提高胚胎發(fā)育的作用。以上胚胎營(yíng)養(yǎng)因子在培養(yǎng)液中，可促使受精卵生長(zhǎng)發(fā)育，生成的囊胚期胚胎具有更高的胚胎干細(xì)胞多能性，胚胎干細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)UTFl和NANOG的表達(dá)量比在無(wú)胚胎營(yíng)養(yǎng)因子的胚胎培養(yǎng)液所生成的囊胚期胚胎明顯增高。本發(fā)明采用的是分程培養(yǎng)液，即雙程培養(yǎng)液，包括卵裂液培養(yǎng)液和囊胚液培養(yǎng)液。所述卵裂液和囊胚液的無(wú)機(jī)鹽緩沖液都包括如下組分:氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂、碳酸氫鈉和EDTA 二鈉。具體地說(shuō)，無(wú)機(jī)鹽緩沖液中所述氯化鉀與氯化鈉的摩爾比為1.8^2.2:100 ；所述磷酸二氫鉀與氯化鈉的摩爾比為0.3^0.4:100 ;所述氯化鈣與氯化鈉的摩爾比為
1.6^1.8:100 ;所述硫酸鎂與氯化鈉的摩爾比為0.18^0.22:100 ;所述碳酸氫鈉與氯化鈉的摩爾比為20 30:100 ;所述EDTA 二鈉與氯化鈉的摩爾比為0.01:100。作為本發(fā)明的最優(yōu)方案，無(wú)機(jī)鹽緩沖液中氯化鉀與氯化鈉摩爾比為2:100;磷酸二氫鉀與氯化鈉摩爾比為0.35:100，氯化鈣與氯化鈉摩爾比1.71:100，硫酸鎂與氯化鈉摩爾比為0.2:100，碳酸氫鈉與氯化鈉摩爾比為25:100，EDTA 二鈉與氯化鈉摩爾比為
0.01:100。從而使緩沖液維持在PH7.3^7.5之間，有利于體外胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。其中，對(duì)于卵裂液培養(yǎng)液，所述胚胎營(yíng)養(yǎng)因子由PAF、IGF-1和GM-CSF組成，用于配制受精卵體外生長(zhǎng)至8-細(xì)胞期的卵裂液培養(yǎng)液。進(jìn)一步的，對(duì)于卵裂液培養(yǎng)液，所述PAF濃度為20ng/毫升，所述IGF-1濃度為2ng/毫升；所述GM-CSF濃度為2ng/毫升。所述乳酸鈉和氯化鈉的摩爾比為10.5:100 ;所述丙酮酸鈉和氯化鈉的摩爾比為0.32:100 ;所述葡萄糖和氯化鈉的摩爾比為0.5:100。每
毫升基本培養(yǎng)液含有3mg血清白蛋白。對(duì)于囊胚液培 養(yǎng)液，所述胚胎營(yíng)養(yǎng)因子由IGF-1和GM-CSF組成，用于配制體外受精卵從8-細(xì)胞期至植入前的囊胚液培養(yǎng)液。具體地說(shuō)，所述IGF-1濃度為5ng/毫升；所述GM-CSF濃度為4ng/毫升。進(jìn)一步的，所述乳酸鈉和氯化鈉的摩爾比為5.87:100 ;所述丙酮酸鈉和氯化鈉的摩爾比為0.1:100 ；所述葡萄糖和氯化鈉的摩爾比為3.15:100。每毫升基本培養(yǎng)液含有4mg血清白蛋白。對(duì)于本發(fā)明分程胚胎培養(yǎng)液的配制方法，先配制基本培養(yǎng)液，將PAF預(yù)先存放在有機(jī)溶劑中，配制時(shí)吸取PAF于清潔的硅化玻璃管中，注入氮?dú)鈱⒂袡C(jī)溶劑揮發(fā)，加入含有血清白蛋白的基本培養(yǎng)液，渦旋混合，避免氣泡產(chǎn)生，于25°C水箱水浴孵化I小時(shí)使PAF與血清蛋白充分結(jié)合，再加入含有血清白蛋白的基本培養(yǎng)液配制到濃度為20ng/毫升；將高于終濃度200倍的IGF-1和GM-CSF完全溶于超純水中，再加入含有血清白蛋白的基本培養(yǎng)液分別稀釋至終濃度2ng/毫升和2ng/毫升。獲得卵裂液培養(yǎng)液。配制基本培養(yǎng)液，將高于終濃度200倍的IGF-1和GM-CSF完全溶于超純水中，再加入含有血清白蛋白的基本培養(yǎng)液分別稀釋至終濃度5ng/毫升和4ng/毫升。獲得囊胚液培養(yǎng)液。本發(fā)明中所述氨基酸包括必需氨基酸和非必需氨基酸，對(duì)于用于人類體外受精的合子而言，所述氨基酸包括所有胚胎所需的必需氨基酸和非必需氨基酸。有益效果:本發(fā)明的一種胚胎培養(yǎng)液及其配制方法通過(guò)加入多種胚胎營(yíng)養(yǎng)因子避免了分程培養(yǎng)液流程丟失胚胎自身分泌的胚胎營(yíng)養(yǎng)因子的缺點(diǎn)，同時(shí)，三種胚胎營(yíng)養(yǎng)因子具有協(xié)同增效效果。受精卵在含胚胎營(yíng)養(yǎng)因子的培養(yǎng)液中所生成的囊胚胚胎具有更高的胚胎干細(xì)胞多能性，表現(xiàn)為其中更多的細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)UTFl和NANOG ;并且與體內(nèi)發(fā)育成的囊胚期胚胎無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差別。本發(fā)明的胚胎培養(yǎng)液可顯著提高受精卵體外生長(zhǎng)發(fā)育，改善胚胎的質(zhì)量，為提高助孕技術(shù)的成功率提供了重要的手段。


圖1表示受精卵在三種體外培養(yǎng)液下84小時(shí)后囊胚期胚胎的百分率及每個(gè)胚胎的細(xì)胞數(shù)；圖2為受精卵培養(yǎng)后每24小時(shí)胚胎與體內(nèi)同期胚胎所含的細(xì)胞總數(shù)的比較圖；圖3表示為本發(fā)明的免疫熒光技術(shù)分析加入胚胎營(yíng)養(yǎng)因子的培養(yǎng)液所生長(zhǎng)成的囊胚期胚胎含有與體內(nèi)生長(zhǎng)成的囊胚期胚胎相當(dāng)數(shù)量的總細(xì)胞數(shù)和表達(dá)胚胎干細(xì)胞生物標(biāo)記(UTFl)的細(xì)胞數(shù)；圖4所示為本發(fā)明的Western blot和免疫熒光技術(shù)分析加入胚胎營(yíng)養(yǎng)因子的培養(yǎng)液所生長(zhǎng)成的囊胚期胚胎含有更多數(shù)量的總細(xì)胞數(shù)和表達(dá)胚胎干細(xì)胞生物標(biāo)記(NANOG)的細(xì)胞數(shù)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1—種分程胚胎培養(yǎng)液，由卵裂液和囊胚液組成，卵裂液用于受精卵生長(zhǎng)至8-細(xì)胞期的時(shí)期內(nèi)，囊胚液用于受精卵從8-細(xì)胞期生長(zhǎng)至受精卵植入前時(shí)期內(nèi)。卵裂液和囊胚液都由基本培養(yǎng)液和胚胎營(yíng)養(yǎng)因子組成，且基本培養(yǎng)液中的無(wú)機(jī)鹽緩沖液組分相同。無(wú)機(jī)鹽緩沖液的配方如表I所示，其pH在7.3 7.5之間:表I卵裂液和囊胚液的配方
權(quán)利要求
1.一種分程胚胎培養(yǎng)液,包括基本培養(yǎng)液和胚胎營(yíng)養(yǎng)因子,其特征在于: 所述基本培養(yǎng)液包括無(wú)機(jī)鹽緩沖液、氨基酸、丙酮酸鈉、乳酸鈉、葡萄糖和血清白蛋白； 所述胚胎營(yíng)養(yǎng)因子包括PAF、IGF-1和GM-CSF的任意一種或多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中任意一項(xiàng)所述的一種分程胚胎培養(yǎng)液，其特征在于:所述無(wú)機(jī)鹽緩沖液包括氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂、碳酸氫鈉和EDTA 二鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種分程胚胎培養(yǎng)液，其特征在于: 所述氯化鉀與氯化鈉的摩爾比為1.8^2.2:100 ； 所述磷酸二氫鉀與氯化鈉的摩爾比為0.3^0.4:100 ； 所述氯化鈣與氯化鈉的摩爾比為1.6^1.8:100 ； 所述硫酸鎂與氯化鈉的摩爾比為0.18^0.22:100 ； 所述碳酸氫鈉與氯化鈉的摩爾比為2(Γ30:100 ； 所述EDTA 二鈉與氯化鈉的摩爾比為0.01:100。
4.根據(jù)權(quán)利要求Γ3中任意一項(xiàng)所述的一種分程胚胎培養(yǎng)液，其特征在于:所述胚胎營(yíng)養(yǎng)因子由PAF、IGF-1和GM-CSF組成，用于配制受精卵體外生長(zhǎng)至8-細(xì)胞期的卵裂液培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求Γ3中任意一項(xiàng)所述的一種分程胚胎培養(yǎng)液，其特征在于:所述胚胎營(yíng)養(yǎng)因子由IGF-1和GM-CSF組成，用于配制體外受精卵從8-細(xì)胞期至植入前的囊胚液培養(yǎng)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種分程胚胎培養(yǎng)液，其特征在于:所述PAF濃度為20ng/毫升，所述IGF-1濃度為2ng/毫升；所述GM-CSF濃度為2ng/毫升。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種分程胚胎培養(yǎng)液，其特征在于: 所述乳酸鈉和氯化鈉的摩爾比為10.5:100 ； 所述丙酮酸鈉和氯化鈉的摩爾比為0.32:100 ； 所述葡萄糖和氯化鈉的摩爾比為0.5:100。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種分程胚胎培養(yǎng)液,其特征在于:每毫升基本培養(yǎng)液含有3mg血清白蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種分程胚胎培養(yǎng)液，其特征在于:所述IGF-1濃度為5ng/毫升；所述GM-CSF濃度為4ng/毫升。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種分程胚胎培養(yǎng)液，其特征在于: 所述乳酸鈉和氯化鈉的摩爾比為5.87:100 ； 所述丙酮酸鈉和氯化鈉的摩爾比為0.1:100； 所述葡萄糖和氯化鈉的摩爾比為3.15:100。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種分程胚胎培養(yǎng)液,其特征在于:每毫升基本培養(yǎng)液含有4mg血清白蛋白。
12.如權(quán)利要求4所述的分程胚胎培養(yǎng)液的配制方法，其特征在于:先配制基本培養(yǎng)液，將PAF預(yù)先存放在有機(jī)溶劑中，配制時(shí)吸取PAF于清潔的硅化玻璃管中，注入氮?dú)鈱⒂袡C(jī)溶劑揮發(fā)，加入含有血清白蛋白的基本培養(yǎng)液，渦旋混合，避免氣泡產(chǎn)生，于25°C水箱水浴孵化I小時(shí)使PAF與血清蛋白充分結(jié)合，再加入含有血清白蛋白的基本培養(yǎng)液配制到濃度為20ng/毫升；將高于終濃度200倍的IGF-1和GM-CSF完全溶于超純水中，再加入含有血清白蛋白的基本培養(yǎng)液分別稀釋至終濃度2ng/毫升和2ng/毫升。
13.如權(quán)利要求5所述的分程胚胎培養(yǎng)液的配制方法，其特征在于:配制基本培養(yǎng)液，將高于終濃度200倍的IGF-1和GM-CSF完全溶于超純水中，再加入含有血清白蛋白的基本培養(yǎng)液分別稀釋至終濃度5 ng/暈 升和4ng/暈升。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種分程胚胎培養(yǎng)液及其配制方法屬于細(xì)胞學(xué)、生物技術(shù)領(lǐng)域，采用添加三種胚胎營(yíng)養(yǎng)因子的分程培養(yǎng)液，包括卵裂液和囊胚液兩種，在體外受精卵和在8-細(xì)胞期前后分別使用。本發(fā)明的胚胎培養(yǎng)液加入的胚胎營(yíng)養(yǎng)因子具有協(xié)同增效作用，避免了分程培養(yǎng)液丟失胚胎自身分泌的胚胎營(yíng)養(yǎng)因子的缺陷，受精卵在本發(fā)明的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)具有更高的胚胎干細(xì)胞多能性，其發(fā)育情況與體內(nèi)胚胎生長(zhǎng)相當(dāng)，提高了受精卵體外生長(zhǎng)發(fā)育，改善了胚胎的質(zhì)量。
文檔編號(hào)C12N5/073GK103173403SQ201310041700
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者金星亮, 白麗君 申請(qǐng)人:金星亮