專利名稱：一種利用2-de技術(shù)篩選鈍齒棒桿菌內(nèi)源高表達(dá)啟動(dòng)子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種利用2-DE技術(shù)篩選鈍齒棒桿菌內(nèi)源性高表達(dá)啟動(dòng)子的方法，屬于蛋白質(zhì)組學(xué)和基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雙向電泳技術(shù)(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)是蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)。2-DE技術(shù)由O Farrell和Klose于1975年分別在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立建立，他們將高分辨率的等電聚焦(Iso-electric focusing, IEF)電泳和十二燒基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)聯(lián)合組成雙向電泳。其基本原理是:第一向基于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同在PH梯度膠內(nèi)等電聚焦；第二向則沿著與一向垂直的方向根據(jù)分子量大小的不同進(jìn)行分離，把復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物在二維平面上分開。隨著基因工程的發(fā)展，常常需要構(gòu)建一種能高水平表達(dá)異源蛋白的表達(dá)載體。啟動(dòng)子對(duì)外源基因的表達(dá)水平影響很大，是基因工程表達(dá)載體的重要元件。因此，研究啟動(dòng)子功能對(duì)于了解生物生長發(fā)育、探討生物適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制及實(shí)現(xiàn)外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中的聞效表達(dá)等均有重要意義。鈍齒棒桿菌SYPA5-5是本課題組前期篩選的一株高產(chǎn)L-精氨酸的突變株，L-精氨酸產(chǎn)量高達(dá)36g/L。其高效遺傳表達(dá)體系的構(gòu)建對(duì)鈍齒棒桿菌改造高產(chǎn)L-精氨酸等代謝產(chǎn)物起關(guān)鍵作用。目前應(yīng)用較為廣泛的棒桿菌表達(dá)載體多采用來自大腸桿菌的啟動(dòng)子如P-tac和IacZ等外源啟動(dòng)子，這些外源啟動(dòng)子效率普遍不高，并且其應(yīng)用受多方面因素的限制。近年來,棒桿菌內(nèi)源性啟動(dòng)子越來越成為棒桿菌遺傳表達(dá)體系研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明利用2 -DE技術(shù)，篩選高表達(dá)蛋白點(diǎn)，對(duì)這些高表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALD1-T0F-MS及MS/MS分析鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出這些蛋白質(zhì)的種類。根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索，找出其相應(yīng)的編碼基因序列，并克隆出其啟動(dòng)子序列。分別將這些啟動(dòng)子替換穿梭載體PDXW-8上的tac啟動(dòng)子，并在其下游插入報(bào)告基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)，并分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109和鈍齒棒桿菌SYPA5-5，通過測定CAT的活性，證明篩選到的這些啟動(dòng)子在大腸桿菌和鈍齒棒桿菌中均具有一定的活性，其中P-argG、P-argF、P-1lvC活性較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供:通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和基因工程手段來篩選具有高活性的鈍齒棒桿菌內(nèi)源啟動(dòng)子的方法。對(duì)構(gòu)建的重組菌株進(jìn)行CAT酶活力測定發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子活性較高，并且這些啟動(dòng)子在不需要添加誘導(dǎo)物的條件下即能實(shí)現(xiàn)外源基因的高表達(dá)。為鈍齒棒桿菌過量表達(dá)外源基因提供了有效的工具。本發(fā)明的技術(shù)方案:利用2-DE技術(shù)、MALD1-TOF-MS及MS/MS分析鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索，篩選出鈍齒棒桿菌內(nèi)源高表達(dá)蛋白質(zhì)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索找出其編碼基因序列，在基因序列的上游分離出其可能的啟動(dòng)子序列。通過分子克隆技術(shù)，分別將這些啟動(dòng)子替換穿梭載體pDXW-8上的tac啟動(dòng)子，并在其下游插入報(bào)告基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)，并分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109和鈍齒棒桿菌，通過測定CAT的活性，驗(yàn)證啟動(dòng)子在宿主菌中的活性。(1)根據(jù)2-DE篩選棒桿菌內(nèi)源高活性啟動(dòng)子:①菌體培養(yǎng)菌種活化后，按5%接種量接入裝液量為50mL/250mL的錐形瓶中，30°C下，200rpm (往復(fù)式搖床)發(fā)酵36h。②蛋白樣品制備及定量將培養(yǎng)液離心收集菌體，超純水清洗3遍，用TE緩沖液(pH7.5)清洗2-3遍至上清澄清；用20mL TE緩沖液重懸菌體，加入0.2mL PMSF溶液(10%IOOmM蛋白酶抑制劑)，冰浴條件下超聲波破碎30min(破碎5s。間隔5s);迅速加入100U的DNase I和20U的RNaseA，37°C下孵育30min ;離心取上清加入預(yù)冷的冰丙酮，_20°C下沉淀過夜；離心收集沉淀，加入裂解液(8M尿素，2M硫脲，4% CHAPS70.5%兩性電解質(zhì)，1%011'，0.001%溴酚藍(lán))重懸。Bradford方法蛋白質(zhì)定量，-70°C保存?zhèn)溆谩＂垭p向電泳每塊凝膠上樣400 μ g蛋白，與水化液(8mM尿素、2mM硫脲、4% CHAPS、I % DTT,0.5%兩性電解質(zhì)和0.001 %溴酚藍(lán))混勻，上樣體積為450 μ L。將IPG膠條(17cm，pH4-7)再水化，覆蓋礦物油。等電聚焦程序?yàn)?00V2h — 1000V3h — 10000V4h — 10000V4000OVh —500V10h。等電聚焦結(jié)束后，膠條置于平衡液(6M尿素，2%SDS，0.375pH8.8This_HCl，20%甘油)中平衡2次，每次振蕩10-15min。其中平液衡I中加入20mM DTT，平衡液II中加入IOOmM碘乙酰胺。平衡完成后，將膠條水平置于預(yù)先制好的12% SDS凝膠頂部，用瓊脂糖封膠液固定并排除氣泡，進(jìn)行第2向凝膠電泳。每種細(xì)胞蛋白樣品重復(fù)3板膠。恒流32mA30min、48mA5h40min，直至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)玻璃板底部。用0.03%考馬斯亮藍(lán)R-250染色2h，用10%乙酸脫色過夜。④凝膠圖像分析及蛋白點(diǎn)質(zhì)量指紋圖譜分析用Lad Scan (GE Health)對(duì)凝膠進(jìn)行掃描，然后利用ImageMaster2D Platinum5.0軟件對(duì)凝膠圖像進(jìn)行調(diào)整、找點(diǎn)、定量和匹對(duì)。割取選中的蛋白點(diǎn)經(jīng)脫色、干燥和胰蛋白酶酶解后上清用Zip TipC18(millipore)微柱脫鹽。樣品置于Bruker Autoflex MALD1-T0F-MS質(zhì)譜儀上進(jìn)行質(zhì)譜分析,獲得肽指紋圖譜。為進(jìn)一步確定，選取最高的十個(gè)峰值進(jìn)行MS/MS分析。(2)重組表達(dá)載體及菌株的構(gòu)建方法:①重組表達(dá)載體pDXW-8-cat的構(gòu)建根據(jù)載體pACY⑶uet_l中氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因(cat)的序列，以及pDXW-8質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)cat基因引物為:F:5， -ACCCGGAATTCGAAAGGACATGAACGATGGAGAAAAAAATCACTGG-3，；R: 5，-CGCAAGCTTTCATTCTTCGTCACCTCC-3，以pACY⑶uet-Ι為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增出cat的基因序列。參照博大泰克公司膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物，膠回收產(chǎn)物按一定比例與pMD18-T過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，使用氨芐青霉素抗性平板篩選重組菌，重組質(zhì)粒經(jīng)Pstl/Ndel酶切驗(yàn)證，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-cat。提取保存于E.coli JM109中的質(zhì)粒pMD18-T_cat和pDXW-8，兩質(zhì)粒分別經(jīng)Pst I/ Nde I雙酶切，膠回收純化，T4DNA連接酶過夜連接兩片段，過夜后將連接物熱擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，使用卡那霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)Pst I/Ndel雙酶切驗(yàn)證,重組質(zhì)粒命名為pDXW-8-cat。②幾種啟動(dòng)子DNA片段的制備根據(jù)二維電泳鑒定結(jié)果，在GENBANK網(wǎng)站上找到它們的基因序列，根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)合成啟動(dòng)子寡核苷酸單鏈序列，并且在序列中引入EcoRI和BamH I酶切位點(diǎn)，以鈍齒棒桿菌SYPA5-5染色體DNA為模板擴(kuò)增出各啟動(dòng)子序列，分別命名為 P-argC、P-argG、P-argF、P-1lvC、P-serA。③攜帶啟動(dòng)子片段的重組啟動(dòng)子探測載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化參照博大泰克基因純化試劑盒對(duì)上述啟動(dòng)子片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物和pDXW-8-cat都用EcoR I/BamH I酶切，膠回收純化后，T4DNA連接酶過夜連接，連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化鈍齒棒桿菌SYPA5-5。使用卡那霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR驗(yàn)證,重組質(zhì)粒分別命名為pDXW-PmgC；-cat、pDXff-PargG-cat>pDXff-PargF—cat-, pDXff-Pilvc-cat 和 pDXW_PserA_cat。(3)重組菌CAT酶活的測定重組大腸桿菌J1109和重組棒桿菌分別接種于LB和LBG培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心收集菌體，用IOOmM Tris-HCl (pH7.8)洗滌菌體兩次，一定體積的Tris-HCl重懸后進(jìn)行超聲波破碎，破碎后10，OOOrpm離心30min取上清，即粗酶液。CAT酶活測定方法:反應(yīng)體系中含 IOOmM Tris-HCl (pH7.8)、0.ImM acetyl_CoA、0.4mg/ml DTNB,適量的粗酶液；將反應(yīng)混合物在水浴中加熱到37°C，加入氯霉素至終濃度0.1mM，混勻，立即測定光吸收值A(chǔ)412，以未加氯霉素的反應(yīng)液為對(duì)照。一個(gè)活力單位定義為:每分鐘乙?；疘 μ mo I氯霉素所需的酶量。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用2-DE技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)篩選出鈍齒棒桿菌5個(gè)高表達(dá)蛋白點(diǎn)。通過數(shù)據(jù)庫檢索找出其編碼基因序列，克隆出它們的啟動(dòng)子并替換穿梭載體pDXW-8上的tac啟動(dòng)子，并在其下游插入報(bào)告基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109和鈍齒棒桿菌，通過測定CAT的活性，證明篩選到的這些啟動(dòng)子在大腸桿菌和鈍齒棒桿菌中均具有一定的活性，其中P-argG、P-argF、P-1IvC活性較高。這些啟動(dòng)子在不需要添加誘導(dǎo)物的條件下即能實(shí)現(xiàn)外源基因的高表達(dá)，為鈍齒棒桿菌過量表達(dá)外源基因提供了有效的工具。



圖1鈍齒棒桿菌可溶性蛋白樣品雙向電泳凝膠圖像圖2pDXW-8_cat 驗(yàn)證圖I λ DNA/HindIII markers2pDXff-8-cat/PCR3pDXff-8-cat/EcoR I4pDXff-8-cat/EcoR I+BamH I5pDXff-8/EcoR I+BamH I6DNA Marker DL2000圖3重組E.coli JM109CAT酶活力的測定圖4重組C.crenatum SYPA5-5CAT酶活力的測定具體實(shí)施方法實(shí)施例1:根據(jù)2-DE篩選鈍齒棒桿菌內(nèi)源高活性啟動(dòng)子菌體經(jīng)培養(yǎng)、蛋白質(zhì)提取，提取到的蛋白質(zhì)濃度約為70yg/yL，第一向等電聚焦、平衡和第二向SDS-PAGE，經(jīng)過固定、染色和脫色后，得到了蛋白質(zhì)分布清晰的凝膠；用LadScan (GEHealth)對(duì)凝膠進(jìn)行掃描,然后利用ImageMaster 2D Platinum5.0軟件對(duì)凝膠圖像進(jìn)行調(diào)整、找點(diǎn)、定量和匹對(duì)，割取選中的蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALD1-TOF-MS和MS/MS分析，共成功鑒定出15個(gè)高表達(dá)蛋白點(diǎn)。實(shí)施例2:重組表達(dá)載體及菌株的構(gòu)建以實(shí)施例1中得到的15個(gè)高表達(dá)蛋白點(diǎn)為基礎(chǔ)，結(jié)合其在菌體細(xì)胞中的拷貝數(shù)等信息，找出了 5個(gè)目標(biāo)蛋白點(diǎn)，在GENBANK中找到這5種蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的基因序列，并根據(jù)基因序列分離其啟動(dòng)子序列，分別將這5個(gè)啟動(dòng)子命名為P-argC、P-argG、P-argF、P-1IvC和P-serA。分別將這5個(gè)啟動(dòng)子替換穿梭載體pDXW_8上的tac啟動(dòng)子，并在其下游插入報(bào)告基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat基因，將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109和鈍齒棒桿菌中。經(jīng)過驗(yàn)證，成功的構(gòu)建了 pDXW-PargC；-cat、pDXff-PargG-cat> pDXff-PargF-cat> pDXff-PilvC-cat 和pDXff-PserA-cat，并成功的獲得了其對(duì)應(yīng)的重組菌。實(shí)施例3:重組菌株的酶活力測定重組菌株分別在LB和LBG培養(yǎng)基中培養(yǎng)，8000rpm離心lOmin，pH7.8的IOOmMTris-HCl緩沖液 清洗2次，懸浮在該緩沖液中，超聲波破碎處理制備粗酶液。反應(yīng)混合物由一定體積的粗酶液、IOOmM 的 Tris-HCL (PH7.8)、0.1mM 的 acetyl_CoA、0.4mg/mL 的DTNB所組成，37°C反應(yīng)2min，加入氯霉素終止反應(yīng)，檢測412nm下的吸光值變化情況。酶活單位定義為:每分鐘乙?；疘 μ mol氯霉素所需的酶量。測得重組大腸桿菌的酶活力如圖3分別為:E.coli JM109/pDXff-PargC-cat為
0.36U/mg、Ε.coli JM109/pDXff-PargG-cat 為 5.58U/mg、E.coli JM109/pDXff-PargF-cat 為
3.81U/mg、E.coli JM109/pDXff-PilvC-cat 為 3.73U/mg、E.coli JM109/pDXff-PserA-cat 為
1.26U/mg。測得重組鈍齒棒桿菌的酶活力如圖4分別為:C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PargC_cat 為 0.09U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXW_PargG-cat 為1.86U/mg、C.crenatumSYPA5-5/pDXff-PargF-cat 為1.19U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXff-PilvC-cat 為1.12U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXff-PserA-cat 為 0.089U/mg。以上結(jié)果可以看出 P-argG、P-argF > P-1lvC 在 E.coli JMl 09 和 C.crenatumSYPA5-5中CAT酶活力都較高，說明其具有較高的活力。這是首次獲得了來自于鈍齒棒桿菌內(nèi)組成型高表達(dá)啟動(dòng)子，為鈍齒棒桿菌高表達(dá)外源基因提供了有效的工具。
權(quán)利要求
1.一種利用2-DE技術(shù)篩選鈍齒棒桿菌內(nèi)源高活性啟動(dòng)子的方法，其特征是: 通過2-DE技術(shù)篩選鈍齒棒桿菌內(nèi)高表達(dá)蛋白質(zhì)，通過MALD1-TOF-MS及MS/MS分析鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出這些蛋白的種類，在GENBANK網(wǎng)站上檢索出這些蛋白的編碼基因序列，克隆其上游的啟動(dòng)子序列。
2.一種攜帶權(quán)利要求1中啟動(dòng)子片段的探測載體，其特征是: 將權(quán)利要求1中的啟動(dòng)子基因片段替換穿梭質(zhì)粒PDXW-8上的tac-M啟動(dòng)子，并在其下游插入氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因cat，獲得幾種啟動(dòng)子片段的探測載體，分別命名為pDXff-PargC-cat> pDXff-PargG-cat> pDXW_PargF_cat、pDXff-PilvC-cat 和 pDXW_PserA_cat。
3.一種攜帶權(quán)利要求2中探測載體的重組菌株，其特征是: 將權(quán)利要求2中的探測載體用熱擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到宿主菌大腸桿菌JM109中，獲得重組大腸桿菌:E.coli JM109/pDXff-PargC-cat, E.coli JM109/pDXff-PargG-cat, E.coli JM109/pDXff-PargF-cat, E.coli JM109/pDXff-PilvC-cat, E.coli JM109/pDXff-PserA-cat ;將權(quán)利要求2中的探測載體用電擊轉(zhuǎn)化法 轉(zhuǎn)化到宿主菌鈍齒棒桿菌SYPA5-5中，獲得重組鈍齒棒桿菌:C.crenatum SYPA5-5/pDXff-PargC-cat > C.crenatum SYPA5-5/pDXff-PargG-cat > C.crenatumSYPA5-5/pDXff-PargF-cat > C.crenatum SYPA5-5/pDXff-PilvC-cat> C.crenatum SYPA5-5/pDXff-PserA-cat o
4.權(quán)利要求3中重組菌的CAT酶活測定，其特征是: 將權(quán)利要求3中的重組菌株發(fā)酵測定CAT的酶活力，測得重組大腸桿菌的酶活力分別為:E.coli JM109/pDXff-PargC-cat 為 0.36U/mg、E.coli JM109/pDXff-PargG-cat 為 5.58U/mg、E.coli JM109/pDXff-PargF-cat 為 3.81U/mg、E.coli JM109/pDXff-PilvC-cat 為 3.73U/mg、E.coli JM109/pDXff-PserA-cat為1.26U/mg ;測得重組鈍齒棒桿菌的酶活力分別為:C.crenatum SYPA5-5/pDXff-PargC-cat 為 0.09U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXff-PargG-cat為1.86U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXff-PargF-cat 為1.19U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PilvC-cat 為1.12U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXW_PserA-cat 為 0.089U/mg,以上結(jié)果可以看出在重組菌中各啟動(dòng)子的活性:P_argG > P-argF > P-1lvC > P-serA > P_argC。這是首次獲得了來自于鈍齒棒桿菌內(nèi)組成型高表達(dá)啟動(dòng)子，為鈍齒棒桿菌高表達(dá)外源基因提供了有效的工具。
全文摘要
一種利用2-DE技術(shù)篩選鈍齒棒桿菌內(nèi)源高表達(dá)啟動(dòng)子的方法，屬于蛋白質(zhì)組學(xué)和基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明首先通過2-DE技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定出鈍齒棒桿菌胞內(nèi)高表達(dá)蛋白點(diǎn)?？寺∑渚幋a基因啟動(dòng)子，分別命名為P-argC、P-argG、P-argF、P-ilvC和P-serA，替換穿梭載體pDXW-8上的tac啟動(dòng)子，并在其下游插入cat基因，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109和鈍齒棒桿菌SYPA5-5，通過測定CAT的活性，各啟動(dòng)子在重組菌中的活性P-argG＞P-argF＞P-ilvC＞P-serA＞P-argC。這是首次獲得來自鈍齒棒桿菌組成型高表達(dá)啟動(dòng)子，為鈍齒棒桿菌高表達(dá)外源基因提供了有效的工具。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103074343SQ20131004350
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者饒志明, 許正宏, 張博慧, 徐美娟 申請(qǐng)人:江南大學(xué)